癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用

目的:探讨癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用.方法:用Moloney逆转录病毒载体先后将正常的c-myc基因和突变的K-ras基因转导入小鼠正常卵巢上皮细胞(MOSE),建立表达c-myc或(和)K-ras基因的细胞系,分别称为Myc细胞、Ras细胞、RM细胞,通过细胞增殖试验、裸鼠体内成瘤试验研究转基因后MOSE细胞生物学特性的改变.结果:用携带有c-myc和K-ras基因的重组逆转录病毒感染MOSE后,用RT-PCR和Western blot能分别检测到有相应的c-myc或(和)K-ras mRNA转录以及蛋白的表达;Ras细胞增殖显著快于MOSE和Myc细胞(P＜0.01),RM细胞显著快于Myc细胞(P＜0.05);将Ras和RM细胞腹腔注射于裸鼠体内,有肿瘤形成,免疫组化结果显示瘤组织有K-ras和c-myc蛋白的表达;MOSE细胞和Myc细胞没有肿瘤形成.结论:重组逆转录病毒载体具有高转导效率,突变的K-ras可使MOSE发生恶性转化,在体内形成肿瘤;c-myc不能使MOSE发生恶性转化,但具有协同作用.     

昆明小鼠胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养

目的:建立能够在体外长期培养胰腺导管上皮细胞的方法.方法:成年昆明小鼠,颈椎脱臼法处死,取胰腺组织,以Ⅴ型胶原酶消化,400目滤网过滤,分离胰腺导管上皮细胞,用添加有各种生长因子的DMEM/F12培养基培养,待细胞达到90%以上汇合时以胰酶消化传代.在不同时间点取样,于普通光镜和相差显微镜下观察细胞形态学变化;采用免疫细胞化学方法检测细胞角蛋白-19(CK-19)的表达情况;并行双硫腙(DTZ)染色.结果:原代及传代培养的细胞具有上皮样细胞的典型特征,CK-19染色阳性,DTZ染色阴性,可初步鉴定为胰腺导管上皮细胞.结论:所建立的原代和传代培养方法,适宜于小鼠胰腺导管上皮细胞的体外生长.     

携带k-ras和c—Myc基因逆转录病毒载体的构建及其转导正常卵巢细胞效能的研究

目的：构建携带k—ras和c—Myc基因的逆转录病毒载体，研究其转导正常小鼠卵巢上皮细胞（mouse ovarian surface epithelial cell，MOSE）的效能。方法：用基因克隆的方法将k—ras和c—Myc基因插入到载体pI，PCX和pI，HCX中，构建真核表达质粒pLPC—mMyc和pI。HC—kras。将pLPC—mMyc或pLHC—kRas通过脂质体法转导包装细胞Ecotropic Pheonix细胞，提取含有携带目的基因的重组病毒上清，转染MOSE，获取携带c—Myc和k—ras基因的MOSE细胞株，分别命名为MOSE—Myc细胞和MOSE—Ras细胞，同时拮抗Puromycin和Hygromycin的MOSE细胞株，命名MOSE—RM细胞。用RT-PCR和Western blot检测目的癌基因和蛋白质在MOSE细胞的表达。将MOSE、MOSE-Myc、MOSE-Ras、MOSE—RM被分别注射到CDl裸鼠腹腔，60d后处死所有裸鼠，解剖检查，观察成瘤情况和生存时间，并进行免疫组织化学染色。结果：RT—PCR能检测到目的基因c—Myc（943bp）和k—ras（620bp）mRNA特异的条带，Western blot在转基因细胞株中能检测到cMyc（67ku）和k-ras（21ku）基因蛋白质的表达。MOSERM和MOSE—Ras组在裸鼠体内均能形成肿瘤，而MOSE和MOSE—Myc在实验结束时均未能形成肿瘤。免疫组织化学染色显示MOSERas和MOSE—RM组k—ras蛋白均呈强阳性，定位于细胞膜；MOSE—RM组c—Mye蛋白呈强阳性，位于细胞核。结论：真核表达质粒plPC—mMyc和plHC—kras能够通过逆转录病毒将k—ras和c—Myc高效导人正常小鼠卵巢上皮细胞MOSE，表达目的蛋白。     

小鼠膀胱移行细胞癌细胞株（WYH929）的建立及其生物学特性

小鼠膀胱移行细胞癌细胞株(WYH929)是本室建立的小鼠膀胱移行细胞癌可移植动物模型(BTT739)。将瘤组织经机械法剪碎，胰酶消化获得细胞悬液，置于含20％小牛血清的RPMI—1640培养液中，经连续传代培养而建株。光镜和电镜观察显示该细胞株具有来自恶性上皮细胞特征，染色体检查证明其分布广泛，众数为70—76条的超二倍体肿瘤。     

人离体子宫在位内膜细胞的原代培养方法探讨

目的:比较不同的消化酶对人离体子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养的异同,为研究人体子宫内膜细胞生长、分化及药物作用机制提供一个较理想的实验方法。方法:将人离体子宫内膜细胞随机分为胰酶组、胶原酶组、胰酶组和胶原酶联合消化组进行消化分离和体外培养,用倒置相差显微镜观察细胞的生长状况及形态特点。结果:3组的培养成功率分别为53.33%、73.33%、86.67%。联合消化组较胰酶组培养成功高(P<0.05)。3种不同方法消化分离后的子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞贴壁、生长状况无明显差异(P>0.05)。结论:采用胰酶与胶原酶联合消化法进行子宫内膜细胞消化分离和体外培养,较单用胰酶法细胞培养的成功率高,比单用胶原酶缩短了消化时间,具有降低培养成本的优点。     

SD大鼠胰腺导管上皮细胞培养技术的研究

目的 分离纯化SD大鼠胰腺导管上皮细胞，为将其转分化为胰岛细胞提供细胞来源。方法 用酶消化法培养SD大鼠胰腺导管上皮细胞，观察细胞增殖动态，用CK-19进行免疫组化鉴定。结果 胰腺导管上皮细胞可在体外有效扩增，有效去除成纤维细胞是扩增的关键。结论 低血清培养和反复贴壁法可获得较纯的胰腺导管上皮细胞。     

小鼠原代肝细胞的分离与培养

目的 探索小鼠原代肝细胞细胞分离培养的简化方法,并对其生物学特性进行鉴定。方法 分离出生2～3 d小鼠肝组织,利用低温下机械剪碎法结合胶原酶消化,分离小鼠原代肝细胞,利用小鼠肝表面抗原CK-19进行荧光染色鉴定。结果 成功地从乳鼠体内分离获得肝原代细胞,免疫荧光鉴定属于肝细胞。结论 利用简单的机械加酶消化法也可以获得肝组织细胞,且得率较高,细胞活力较好。     

小鼠乳腺癌细胞4T1对不同品系小鼠乳腺癌模型的影响

目的:将小鼠乳腺癌细胞4T1接种到两种不同品系的小鼠脂肪垫,观察植瘤小鼠的生物学状态、成瘤大小、转移情况以及生存周期等指标,为建立不同品系小鼠的乳腺癌模型提供参考。方法:将小鼠乳腺癌细胞4T1胰酶消化去除上清,用PBS洗两遍,最后用生理盐水调整细胞数量为1×106个,分别接种到裸鼠和BABL/c小鼠的脂肪垫。比较各组老鼠的成瘤率、成瘤时间以及生存期等实验指标。结果:原位注射1×106个4T1细胞时两组均能成瘤,但是裸鼠的成瘤率高于BABL/c小鼠;裸鼠的成瘤大小明显大于BABL/c小鼠;裸鼠的生存期明显短于BABL/c小鼠;裸鼠出现肺转移结节明显多于BABL/c小鼠。结论:不同免疫能力的小鼠对接种相同数量的细胞数可能会产生不同的实验结果,在选择构建小鼠乳腺癌模型的时候一定要综合考虑所选用品系的小鼠是否会对实验结果带来影响。     

四种气管上皮细胞分离培养方法的比较研究

目的：比较四种不同的方法在培养气管上皮细胞中的异同，改进其培养技术，为组织工程气管提供种子细胞。方法：用两步酶消化法（使用0.1％ Dispase 4℃消化18h后，用0．25％的胰酶37℃消化5min）、Dispase冷消化法（用0．1％Dispase 4℃消化18h）、胰酶温消化法（0．25％的胰酶37℃消化10min）和机械刮刷法四种方法分离、培养兔气管上皮细胞，测定分离细胞的数量和纯度。结果：两步酶消化法、Dispase冷消化法较其他两种方法得到的气管上皮细胞纯度高，细胞状态好；Dispase冷消化法得到细胞数量较其他方法少，其余三种方法得到的细胞数统计学上不存在差异。结论：两步酶消化法较其他方法所得细胞数量多、纯度高、细胞成活率高，是一种较好的气管上皮细胞体外分离培养方法。     

正常大肠干细胞的条件永生化

目的:建立正常人大肠干细胞系.方法:用中性蛋白酶分级分离法从人胚肠中分离正常大肠干细胞,以含端粒酶逆转录酶和SV40大T抗原的重组逆转录病毒感染,对其进行永生化;然后,对建立的正常大肠干细胞系进行生物学特性鉴定.结果:用中性蛋白酶分级消化获得的AKP活性阴性的细胞群生长呈多角形.该细胞群转染含端粒酶逆转录酶和SV40大T抗原的重组逆转录病毒后8～12周出现上皮样细胞克隆,经细胞特性鉴定:PAS染色黏蛋白阳性,上皮细胞角蛋白pan、CK-8、CK-19均阳性;用ELISA-PCR法检测该细胞第12代和第43代端粒酶活性,分别为0.43、0.83;用Western blot法检测发现该细胞系表达端粒酶和SV40大T抗原;用RT-PCR检测示该细胞株表达Musashi-1 mRNA;以1×106细胞数接种裸鼠,观察4个月无肿瘤形成,软琼脂克隆试验培养无转化细胞克隆出现.结论:建立的正常的大肠干细胞系具有干细胞特征,可作为体外研究致癌剂/促癌剂作用机制的较理想实验靶点.     

Cre/LoxP 系统联合SV40 LTag 诱导可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系的建立

 目的探索可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞的建立方法。方法采用胰酶消化法分离培养大鼠皮肤成纤维细胞;逆转录病毒载体（SSR69）转染成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTag 的永生化成纤维细胞;用表达Cre 重组酶的腺病毒感染永生化成纤维细胞,筛选获得回复后成纤维细胞。对原代、永生化及回复后成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞生长状态;采用细胞生长曲线法测定细胞增殖能力。免疫荧光染色检测Vimentin 在原代及永生化成纤维细胞中的表达情况,平板克隆实验评价回复后成纤维细胞的致瘤性。结果提取了大鼠皮肤成纤维细胞,并筛选出表达SV40 LTag 的永生化成纤维细胞,二者形态无明显差异,均贴壁生长,呈长梭形或多角形,但永生化成纤维细胞体外增殖能力明显高于原代成纤维细胞（P < 0.05）,在体外培养传代>25 代。细胞免疫荧光提示两种细胞均在细胞质内表达Vimentin。回复后成纤维细胞不表达SV40 LTag,其体外增殖能力与原代细胞无明显差异（P > 0.05）,无致瘤性。结论应用Cre/LoxP系统联合SV40 LTag 可以建立可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系     

人离体子宫在位内膜细胞的原代培养方法探讨

目的：比较不同的消化酶对人离体子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养的异同，为研究人体子宫内膜细胞生长、分化及药物作用机制提供一个较理想的实验方法。方法：将人离体子宫内膜细胞随机分为胰酶组、胶原酶组、胰酶组和胶原酶联合消化组进行消化分离和体外培养，用倒置相差显微镜观察细胞的生长状况及形态特点。结果：3组的培养成功率分别为53．33％、73．33％、86．67％。联合消化组较胰酶组培养成功高（氏0．05）。3种不同方法消化分离后的子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞贴壁、生长状况无明显差异（B〉0．05）。结论：采用胰酶与胶原酶联合消化法进行子宫内膜细胞消化分离和体外培养，较单用胰酶法细胞培养的成功率高，比单用胶原酶缩短了消化时间．具有降低培养成本的优点。     

原代肾小管上皮细胞的培养和鉴定

目的:建立大鼠肾小管上皮细胞原代培养及鉴定方法.方法:采用研磨、消化培养法,用免疫细胞化学和RT-PCR鉴定细胞.结果:培养的细胞CK18蛋白表达阳性,基本没有α-SMA 和Vimentin的蛋白表达,E-cadherin mRNA强表达.结论:成功建立大鼠肾小管上皮细胞原代培养方法,为肾脏疾病的研究提供实验平台.     

小鼠气管上皮细胞的气液相界面培养

目的通过气液相界面培养将小鼠气管上皮细胞诱导分化成具有纤毛和黏液分泌功能的上皮细胞,从功能和结构上,使其更贴近体内气管上皮细胞的自然生长状态。方法采用低温酶消化法、气液相界面培养、无血清条件培养基培养小鼠的气管上皮细胞,通过扫描电镜以及细胞免疫化学观察和鉴定细胞。结果此方法获得的细胞具有纤毛和黏液分泌功能。细胞角蛋白表达阳性。结论低温酶消化法、小鼠气管上皮细胞气液相界面培养的细胞更贴近生理状态,为进一步研究呼吸系统疾病提供了良好的模型。     

新生大鼠成纤维细胞原代培养

目的探讨新生sD大鼠成纤维细胞的培养方法。方法采用胰酶消化法和组织块贴壁法原代培养成纤堆细胞。采用HE染色及波形蛋白（Vimentin）免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定。结果两种方法均能培养出成纤维细胞,其中酶消化法一次性可获得较多细胞,但细胞状态较差,贴壁慢,生长慢;组织块贴壁法短时间内可长出大量成纤维细胞,一周即可传代。HE染色后倒置相差显微镜下观察细胞形态典型,免疫细胞化学染色结果显示Vimentin呈阳性反应。结论组织块贴壁培养法是获取成纤维细胞简单,可行,快速的方法。     

急性提取成年小鼠心肌细胞的方法

目的:目前常用离体心脏灌注法提取心肌细胞,但小鼠的心脏体积较小,难度较大,因此作者通过实验获得一种简易提取成年小鼠心肌细胞的方法。方法:脱臼处死小鼠后,通过胰酶、胶原酶消化提取小鼠心肌细胞。结果:用酶解法可获得大量的高质量的心肌细胞且细胞存活率不低于90%。结论:酶解法提取细胞是一种简单、快速获得成年小鼠心肌细胞的可行办法。     

人卵巢上皮癌的体外培养及耐药株的诱导

目的研究人卵巢上皮癌体外培养的方法及其耐药株的诱导方法。方法取卵巢上皮癌患者的卵巢癌实体瘤、囊内液及腹水,分别用直接培养法,胰酶消化培养法和胶原酶消化培养法体外培养。检测细胞对顺铂和环磷酰胺的药物敏感性,选择适当的药物和浓度诱导卵巢上皮癌耐药株。并比较耐药株与诱导前的母株间克隆形成率和耐药蛋白表达的差异。结果腹水和囊内液直接培养较实体瘤培养易成功。实体瘤培养以胶原酶消化培养法获得细胞数最多,混杂细胞最少。取腹水来源的稳定传至30代的卵巢癌细胞用环磷酰胺诱导耐药株成功。检测其克隆形成率和耐药蛋白表达均高于诱导前。结论本实验探讨了人卵巢上皮癌体外培养的多种方法,成功培养一株卵巢黏液性囊腺癌细胞,达建系要求,并成功诱导其耐药株。可用于卵巢上皮癌发生及复发机制和治疗及预防方面的研究。     

BXSB狼疮小鼠胸腺上皮细胞培养方法的建立

目的：比较不同培养条件下原代狼疮小鼠胸腺上皮细胞生长情况。 方法：分别采用剪切法、剪切加胶原酶消化法、剪切加胰蛋白酶消化法建立培养体系获取自发性系统性红斑狼疮小鼠（BXSB小鼠）胸腺上皮细胞;用光镜、免疫细胞化学染色法进行细胞鉴定。 结果：含血清的培养基与含生长因子的培养基均能培养出较纯的胸腺上皮细胞;剪切法成纤维细胞污染较多,剪切加胰蛋白酶消化法细胞生长状态较差,经剪切加胶原酶消化的BXSB胸腺植块,生长状态好,成纤维细胞污染少;当原代培养的细胞长满瓶壁的90％左右时可传代,角蛋白染色阳性细胞纯度达95％以上。 结论：剪切加胶原酶消化法仅用含血清的培养基即可培养出符合实验要求的BXSB小鼠胸腺上皮细胞,是低成本、简便易行的系统性红斑狼疮模型鼠胸腺上皮细胞培养体系。     

白藜芦醇对恶性黑色素瘤生长抑制作用的体外及体内研究

目的:研究白藜芦醇在体外和体内对恶性黑色素瘤的抗肿瘤效果.方法:采用MTT法测定白藜芦醇对小鼠B16及人A375细胞的增殖抑制率;用Western blot方法检测白藜芦醇对B16细胞中p-Akt蛋白表达的影响;建立B16皮下种植瘤小鼠模型,观察不同剂量的白藜芦醇对小鼠皮下瘤的生长抑制作用.结果:体外实验发现在白藜芦醇对B16及A375细胞均显示了良好的浓度依赖性;Western blot显示了不M浓度的白藜芦醇有效的抑制了p-Akt蛋白的表达,提示其抗肿瘤机制可能与此有关;体内实验证实不同浓度的白藜芦醇对恶性黑色素瘤的生长产生了明显的抑制作用.结论:体外和体内实验证实白藜芦醇有效的抑制了恶性黑色素瘤的生长,并且发现其抗肿瘤机制可能通过抑制p-Akt蛋白的表达来实现.这为白藜芦醇在恶性黑色素瘤的临床治疗的可能应用提供了实验基础,也为我国中草药的抗肿瘤效果的开发提供了具体思路.     

人胚胎生殖系细胞分离与体外培养的初步研究

目的:初步探讨人胚胎生殖系细胞的分离与体外培养.方法:体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织,按单纯机械分离、酶消化分离、二者结合法及是否有饲养层将组织分为5种不同的方式培养后,用碱性磷酸酶标记,计数阳性克隆并进行比较.结果:酶消化法培养所获得的克隆较单纯机械分离方法多,原代培养时种植到饲养层上效果较好.将分离到的组织用0.25％胰酶消化3 min,种植到丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞上培养3 d,挑取克隆传代,在第10天形成30.7 个阳性克隆,显著高于其他方法获得的阳性克隆数.用碱性磷酸酶标记的细胞(克隆)具有多样性,细胞胞体为圆形,分为有突起和无突起两种;阳性细胞克隆呈圆球形、条带形和块形,与周围细胞分界清楚.结论:人胚胎体内的微环境限制生殖系细胞的体外扩增培养,原代培养需要在饲养层上进行且宜用酶消化法尽早传代.