蝎镇痛抗菌活性肽BmK AS的融合表达及蛋白切割

目的构建镇痛抗菌活性肽BmK AS原核融合表达载体,实现可溶性表达,获得重组活性肽BmK AS。方法利用本实验室已构建成功的pET 28a-AS质粒,设计引物经过聚合酶链式反应,将目的基因克隆至pET 32a载体中,构建融合表达载体pET 32a-AS,优化诱导表达条件,实现BmK AS在大肠杆菌BL21(DE 3)中的融合可溶性表达,通过金属离子螯合亲和薄层色谱法对重组蛋白进行初步分离纯化,获得重组融合蛋白后采用凝血酶进行切割去除纯化标签,经SDS-PAGE检测切割效果。结果成功构建重组表达质粒,优化得到低温诱导促进蛋白可溶性表达的方法;采用金属离子螯合亲和薄层色谱法获得重组蛋白;电泳结果表明凝血酶可以切割融合蛋白。结论实现活性肽BmK AS在大肠杆菌中的融合可溶性表达,经凝血酶切割后获得重组镇痛抗菌活性肽BmK AS,为后续药理活性研究奠定基础。     

人丙氨酸氨基转移酶基因(ALT1)的克隆、表达、纯化及酶活性的鉴定

目的克隆、表达、纯化重组人丙氨酸氨基转移酶(ALT1),并测定该酶活性,为建立特异性的ALT分型检测方法奠定基础。方法通过RT-PCR从肝癌细胞中扩增丙氨酸氨基转移酶(ALT1)基因,并将其克隆至pET-28 a表达载体中。重组表达质粒pET28 a-ALT1,转化大肠杆菌BL21,经1.0mmol.L-1IPTG诱导,表达可溶性重组融合蛋白,通过硫酸铵沉淀、镍离子柱亲和色谱及QHP柱色谱3步纯化,并检测融合蛋白活性。结果经过表达条件的优化增加了可溶性蛋白的表达,纯化后目的蛋白纯度达到85%,经测定重组蛋白具有很高的丙氨酸氨基转移酶活性(200 U.mg-1)。结论通过基因克隆及大肠杆菌表达,能得到活性较高的丙氨酸氨基转移酶蛋白。     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达

目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子 1(hIGF 1) ,构建hIGF 1原核表达载体 ,并进行表达与纯化。方法以pUCIGF质粒为模板 ,PCR扩增了hIGF 1基因。经适当酶切后 ,构建表达载体pRSET IGF ,转入大肠杆菌BL2 1(DE3)进行表达 ,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。结果带有重组质粒pRSET IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后 ,以可溶性形式表达 7.8kD大小的蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白量的10 %～ 2 0 % ,纯化后目的蛋白纯度达 95 %以上 ,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF 1抗原活性。结论构建了pRSET IGF重组质粒 ,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达 ,为获得大量基因工程产品奠定了基础     

sMICA基因的克隆表达及其纯化

目的构建重组MICA原核表达载体并探讨MICA对NK细胞毒效应的影响。方法经RT-PCR从Hela细胞获取MICA基因,经适当酶切后构建表达载体pBV220-MICA,转入大肠杆菌DH5α进行表达。重组MICA蛋白经纯化后与NK92细胞孵育观察对NK细胞毒效应的影响。结果带有重组质粒pBV220-MICA的大肠杆菌经热诱导后,以可溶性形式表达重组MICA蛋白,纯化后的重组MICA蛋白纯度为95%。经重组MICA处理的NK92细胞对MICA表达阳性的肿瘤细胞的杀伤作用明显降低。结论构建了pBV220-MICA重组质粒,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,为研究MICA与NK细胞受体的相互作用机制奠定了基础。     

pET15b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP原核表达载体的构建、表达及其意义

目的：HCTP（HPV tansformed cervical cancer cell targeting penetratin HCTP）是新近发现的一种能特异性识别并穿透HPV转化宫颈癌细胞胞膜的短肽。构建HCTP与绿色荧光蛋白（GFP）、凋亡素（Apoptin）的重组表达载体，原核系统表达并纯化出GFP-HCTP、Apoptin-HCTP融合蛋白，研究HCTP的特异性靶向穿膜效应。方法：根据美国NIH基因库收藏的Apoptin基因序列，利用多重PCR技术拼接出Apoptin cDNA、运用PCR方法以pEGFP-C1质粒为模版扩增获得GFP cDNA片段，将Apoptin及GFP cDNA分别与退火形成的HCTP双链连接并克隆至原核表达载体pETl5b，成功构建pETl5b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP重组表达载体。DNA测序证实重组构建无误，用上述两个重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）．以IPTG诱导融合蛋白表达并用Ni-NTA His-Bind Resin蛋白纯化试剂纯化，获得可溶性基因重组融合蛋白GFP-HCTP和Apoptin-HCTP。运用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定目的蛋白。结果：成功构建pETl5b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP原核表达载体，经表达、纯化制备了GFP-HCTP和Apoptin-HCTP基因重组融合蛋白。结论：我们使用基因工程技术，经原核表达系统表达制备的GFP-HCTP和Apoptin-HCTP融合蛋白将为进一步研究HCTP的特异穿膜效应以及探讨HCTP作为宫颈癌治疗药物的靶向运送载体提供实验基础。     

蝎毒镇痛活性肽基因BmK AngM1的密码子优化及其真核表达分析

密码子的偏爱性是影响基因异源表达的重要因素,通过对外源基因的密码子序列进行优化可提高其表达水平。为了获得蝎毒镇痛活性肽基因BmK AngM1在毕赤酵母中的高效表达,根据毕赤酵母密码子偏爱性,将BmK AngM1基因中的毕赤酵母低利用率密码子突变为其高利用率简并密码子,克隆到表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母,甲醇诱导表达;重组蛋白表达量测定结果显示,优化后的BmK AngM1基因在毕赤酵母中的表达水平是优化前的3.7倍。研究结果表明,密码子优化能显著提高BmK AngM1基因在毕赤酵母中的表达水平。     

乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达

目的构建瑞替普酶(rPA)大肠杆菌基因工程菌,优化乳糖诱导表达条件,并获得活性重组蛋白。方法通过PCR扩增得到rPA编码基因,将该基因片段克隆到载体pET40b中,转化E.coli BL21。优化确定乳糖诱导浓度、时间、温度等参数,将诱导表达后获得的菌体细胞通过超声破碎裂解后利用镍柱亲和色谱进行分离纯化,重组目的蛋白经Xa因子切割去除DsbC融合标签后释放获得rPA产物,最后利用纤维蛋白平板法对其溶栓活性进行检测。结果 rPA重组质粒构建成功,利用终浓度30 mmol/L的乳糖于30℃诱导5 h可以获得很好的表达效果,重组蛋白的表达量、可溶性及酶活与IPTG诱导产物基本接近;经纯化后的rPA目的蛋白可表现出明显的溶栓活性。结论本研究为进一步利用大肠杆菌系统表达生产高活性重组rPA提供了一定的参考依据。     

重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白基因工程菌高密度发酵及分离纯化

目的研究重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白(Tα1-HSA)基因工程菌在30 L发酵罐中高密度发酵表达Tα1-HSA融合蛋白的发酵工艺及产物的分离纯化方法。方法采用两步发酵法进行重组毕赤酵母Tα1-HSA基因工程菌的高密度发酵。发酵液经超滤浓缩,阴离子交换色谱,亲和色谱,凝胶过滤色谱等步骤进行分离纯化。结果发酵结束后,菌体细胞湿重达到350 g/L,发酵液中蛋白产量达到2.0 g/L。发酵液经分离纯化后获得了纯度较高的重组Tα1-HSA融合蛋白,HPLC分析纯度达97.5%。结论重组毕赤酵母Tα1-HSA基因工程菌高密度发酵的成功及分离纯化方法的建立为Tα1-HSA的进一步研究和开发奠定了基础。     

Fas胞外区基因的构建、表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的构建Fas胞外区(eFas)基因的表达载体,表达纯化重组蛋白,进行多克隆抗体的制备,为进一步功能研究奠定基础。方法通过重叠PCR获得eFas基因的编码序列,构建pET-22b(+)/eFas表达载体,转化大肠杆菌Rosetta-gami,IPTG诱导表达,Ni-NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度。将纯化的eFas融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,通过ELISA方法检测多克隆抗体的效价。结果获得了eFas的编码序列与表达载体,目的蛋白主要在包涵体中表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,纯化的重组蛋白纯度达95%以上。结论eFas融合蛋白基因的构建、表达、纯化以及多克隆抗体的制备,为进一步研究Fas提供了材料。     

高质量重组人干扰素α2b的分离纯化研究

重组人干扰素2b作为一种上市药物,被广泛用于治疗慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、恶性黑色素瘤等多种疾病的治疗,产生了良好的临床疗效和经济效益。目前国内厂家生产的重组人干扰素以大肠杆菌基因工程表达为主。大肠杆菌表达的人干扰素2b以包涵体的形式表达,包涵体产物需通过变性复性以及其后的纯化才能获得生物活性。干扰素复性得率低,纯化时需要经过四步色谱处理,工艺繁琐,成本高,而且无法去除未完全复性的中间产物,从而影响产品质量和疗效。建立可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵工艺,并在此基础上,建立其高效、快速和稳定的纯化工艺。通过发酵工艺优化获得可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵,收集菌体后,通过高压破菌、硫酸铵分级沉淀、phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析、Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、Octyl Sepharose Fast Flow疏水层析进行分离纯化,并对纯化产物进行生物活性分析。重组人干扰素α2b工程菌的发酵密度A₆₀₀达到38.5,可溶性重组人干扰素α2b占...     

α-突触核蛋白的异源表达及其与Pectinolide G的相互作用研究

目的 体外获得人源α-突触核蛋白并研究其与海洋小分子Pectinolide G的实际结合情况 方法 采用基因重组的方法构建α-突触核蛋白的原核重组表达载体并在BL21(DE3)中诱导蛋白表达,从诱导温度、时间和诱导剂浓度三方面对蛋白表达进行优化,并确立硫酸铵纯化目的蛋白的具体条件,通过表面等离子共振技术和分子对接技术,探究人源α-synuclein与Pectinolide G的结合情况。结果 通过基因重组将α-synuclein目的基因与PET30a原核表达载体构建成融合载体,确立该蛋白的最佳诱导表达条件为：0.5mM IPTG,37 ℃, 5 h,最佳纯化条件为: 95℃加热破碎后菌液,50%饱和硫酸铵溶液沉淀目的蛋白,质谱法确认其分子量为14.6KD,符合人源α-synuclein理论分子量。最后,利用纯化得到的α-synuclein通过表面等离子共振(SPR)和计算机分子模拟技术,确认了其可与Pectinolide G较好的结合。结论 通过原核重组表达获到人源α-synuclein,并确认了其与海洋小分子Pectinolide G的结合力和结合模式     

重组人Hexastatin融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及其纯化

目的构建人Hexastatin蛋白原核表达载体,大量表达并纯化Hexastatin蛋白,为其在体内外的活性研究奠定基础。方法提取人食管癌EC9706细胞总RNA,通过RT-PCR方法扩增人Hexastatin基因,导入pMD18-T载体测序,然后克隆至pMAL-c4x表达载体,IPTG诱导表达,并利用Amylose亲和树脂纯化融合蛋白,产物进行Westernblot鉴定。结果经PCR扩增成功获得了687bp的人Hexastatin基因,测序正确。重组人Hexastatin基因在BL21菌体中获得高效可溶性表达,表达的可溶性蛋白占总蛋白量的24.8%,纯化后的MBP-Hexastatin融合蛋白纯度可达90%,Westernblot证实表达蛋白为目的蛋白。结论人Hexastatin基因克隆、表达及纯化的成功,为进一步在体内外研究其生物活性奠定基础,同时也为肿瘤的生物治疗提供了新的方法。     

重组人TNF-α在大肠杆菌中的表达、纯化及生物学活性研究

构建有利于人肿瘤坏死因子α(TNF-α)大量表达及有效纯化的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过密码子优化构建表达质粒pET28-TNF,并将其转化入大肠杆菌,对表达条件进行优化后进行大量表达并通过两轮镍柱亲和纯化获得高纯度重组人TNF-α(rhTNF-α)蛋白。应用Western blot和细胞测活分别检测重组人TNF-α蛋白的抗原性和细胞毒活性。成功构建了重组人TNF-α原核表达载体,并通过表达纯化获得了纯度>95%,具有生物活性(LD50<10 ng/mL)的rhTNF-α蛋白。     

人α1微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的构建人α1微球蛋白（α1-MG）基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、纯化,为制备仅。一MG诊断试剂中原料抗体、标准品及质控品奠定基础。方法从人胚胎肝脏中提取总RNA,利用反转录聚合酶链反应技术扩增α1-MG基因。然后克隆至PQE30表达载体,转化大肠杆菌M15中进行表达,并经镍固定金属亲和层析进行纯化,蛋白质印迹进行免疫学鉴定。结果获得了与Genebank报道一致的仪。一MG基因片段,成功构建了成熟人α1-MG的原核表达载体PQE30-α1-MG,质粒转化大肠杆菌并经1mmol／L异丙基硫代半乳糖诱导5h后,可表达相对分子质量约25000的外源蛋白,表达的α1-MG大部分在包涵体中,并可经镍固定金属亲和层析纯化,纯化有效率95％以上,BCA法测定纯化的α1-MG蛋白含量为25mg／L。蛋白质印迹表明,该蛋白可与抗人仅．一MG天然抗体反应。结论通过基因工程方法可获得高效表达的重组α1-MG蛋白,该蛋白具备同天然仅。一MG相同的生物学特性,为下一步进行α1-MG相关研究及应用奠定基础。     

布氏锥虫亮氨酰-tRNA合成酶的克隆表达纯化及活性测定

目的克隆布氏锥虫亮氨酸-tRNA合成酶基因,并进行表达纯化及活性测定。方法通过PCR方法从布氏锥虫细胞基因组中扩增出亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)基因,依次克隆入pBS-T克隆载体及pET21a(+)表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中通过条件优化后表达。表达产物用His-Bind亲和色谱纯化,并用免疫印迹进行鉴定。采用放射性同位素方法进行酶活性测定。结果PCR扩增得到3.2 kb的DNA片段,重组质粒pET21a(+)/LeuRS经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体可溶性蛋白的20%,纯化后蛋白纯度达85%,免疫印迹进行鉴定蛋白正确,酶活性测定计算出提纯物酶活性约为72 U/mL。结论已成功克隆表达纯化出布氏锥虫亮氨酸-tRNA合成酶,并用放射性同位素方法进行了酶活性测定,这为下一步进行布氏锥虫亮氨酰-tRNA合成酶抑制物的设计和体外筛选奠定了良好的基础。     

儿茶酚胺氧位甲基转移酶的克隆表达及纯化

目的将儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因(COMT)克隆到原核表达载体进行可溶性表达,制备纯化COMT蛋白,为深入研究COMT的功能提供材料。方法运用分子生物学方法构建融合表达质粒Pet22b+-COMT。将Pet22b+-COMT转入E.coli BL21(DE3)表达菌株,利用IPTG诱导表达,并用亲和色谱纯化COMT。结果经测序分析成功构建了融合表达质粒Pet22b+-COMT。COMT基因在E.coli BL21(DE3)中表达相对分子质量约为28000的蛋白质,纯化后,COMT蛋白的纯度大于90%。结论COMT基因在原核中得到良好的表达,得到了纯度较高的蛋白质,为酶学活性研究奠定了基础。     

重组TNF-α衍生物RMPT的制备及其抗肿瘤作用初步研究

利用基因重组技术制备具有抗肿瘤作用的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)衍生多肽RMPT,并研究其体外生物学效应。PCR方法合成RMPT基因序列,定向插入高效表达载体pTXB1-MCS,在大肠杆菌ER2566中诱导表达重组融合蛋白并建立RMPT融合蛋白诱导表达的优化体系。N端自动切割、纯化、HPLC制备获得RMPT,电泳和质谱鉴定其分子质量。CCK-8检测RMPT对肿瘤细胞的抑制作用。实验结果表明:重组工程菌可溶性RMPT融合蛋白最佳诱导表达条件为37℃、8 h、IPTG浓度0.75 mmol/L;DTT诱导蛋白内含肽自剪切固相纯化和HPLC制备重组肽RMPT,纯度大于95%,电泳和质谱鉴定其分子质量为3.7 ku,结果与理论值相符合,其产率为10.8 mg/L发酵液;体外研究表明,RMPT能够高效抑制多数肿瘤细胞增殖。     

CREKA/tTF融合蛋白表达及活性鉴定

目的制备用于靶向肿瘤血管中的凝血血浆蛋白的CREKA/tTF融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术构建CREKA与tTF的融合基因,克隆至表达载体pET22b(+),在E.coli BL21中表达,镍亲和色谱柱纯化,梯度透析复性。利用凝血时间,结合荧光定量测定等实验在体外鉴定该融合蛋白的活性。结果获得序列正确的CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,融合蛋白在E.coli BL21中高效表达。纯化后的融合蛋白具有引起血液凝固的功能,且能与凝血血浆蛋白结合。结论成功构建CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,CREKA/tTF融合蛋白具有TF凝血活性及CREKA的结合活性。     

肿瘤—睾丸基因SSX1的原核表达载体的构建

目的：构建肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体,为进一步表达、纯化SSX1蛋白,制备肝癌疫苗奠定基础。方法：行RT-PCR从肝细胞癌组织中扩增CT基因SSX1,将SSX1和pMAL-C2质粒进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,然后连接并转化大肠杆菌DH5α,最后对重组质粒进行蓝白斑筛选,酶切和测序鉴定。结果：重组表达质粒经鉴定准确无误。结论：成功构建了肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体。     

精氨酸脱亚胺酶的克隆表达和纯化

目的 研究人型支原体来源的精氨酸脱亚胺酶(MhADI)在大肠杆菌中的表达及纯化.方法 人工合成密码子优化的人型支原体来源的adi基因片段,定向插入到pET-22b载体的NdeⅠ和Xho Ⅰ位点之间;重组的表达载体pET22b-adi转化大肠杆菌BL21 (DE3),用IPTG诱导表达;表达产物通过透析复性后经DEAE离子交换层析纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果;纯化的重组蛋白用二乙酰一肟-氨基硫脲比色法检测比活.结果 成功诱导表达分子量为48 kDa的重组蛋白,目的产物以包涵体形式表达,表达量约为细胞总蛋白的15％.纯化后蛋白纯度达95％以上,比活为3 IU.结论 本研究方法可制备得到较高纯度活性重组人型支原体ADI蛋白.