重组SARS-CoV核衣壳蛋白的表达及免疫原性研究

我们利用全基因合成方式及原核表达系统获得大量纯化的N蛋白，为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究提供新的思路。由于长片段目的基因在原核系统中不易表达，根据抗原性预测分析将N蛋白分成两部分表达，第一部分为N-4蛋白1-549bp，第二部分为N-2蛋白496-1269bp，上下游分别设计BamH Ⅰ、     

抗SARS-CoV病毒N蛋白的单链抗体(scFv)筛选

目的筛选出抗SARS-CoV病毒N蛋白的单链抗体。方法利用原核表达所获得的SARS病毒N蛋白,筛选人源单链抗体噬菌体展示库,经特异性的检测,以期得到抗SARS-CoV病毒N蛋白的特异单链抗体。结果获得了8个抗SARS病毒N蛋白的候选克隆。经测序,获得了编码抗体可变区的基因序列,并进行了原核表达。结论筛选得到的抗SARS-CoV病毒N蛋白单链抗体具有高度的特异性,可以用作临床实验或研究SARS病毒过程中快速检测SARSN蛋白或SARS病毒粒子的候选抗体。     

SARS-CoV N蛋白对真核细胞基因谱的影响

N蛋白位于SARS冠状病毒（SARS-CoV）颗粒的核心，是SARS-CoV的主要结构蛋白之一，它可以与病毒基因组RNA结合。目前研究表明N蛋白可以选择性激活AP-1（activator protein 1）信号转导途径；并发现在压力条件下（即缺乏生长因子时），N蛋白可以诱导COS-1细胞凋亡和肌动蛋白重组。本文研究了体外转染N蛋白真核表达载体后细胞基因转录水平的变化。通过长寡核苷酸芯片和SAM统计学处理，得到了瞬时表达N蛋白的真核细胞转录谱。N蛋白对哺乳动物细胞转录的影响可能与SARS-CoV的致病机理相关。     

一株变异SARS冠状病毒N蛋白的原核表达及活性测定

目的 :克隆编码严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS CoV)N蛋白的DNA ,构建原核表达质粒pGEX 2T/N ,并诱导表达。方法 :采用RT PCR方法从病毒培养液中获得N基因片段 ,并克隆入T EASY载体中。经PCR、双酶切鉴定后 ,测序。将N蛋白基因序列定向插入原核表达载体pGEX 2T中 ,表达融合蛋白。用表达产物与抗SARS CoV抗体阳性血清做Westernblot。结果 :N蛋白DNA测序的结果与GenBank比对缺失 2 0个bp。GST N融合蛋白以可溶形式表达。Westernblot检测表明 ,其与抗SARS CoV抗体阳性血清的反应呈阳性。结论 :成功地构建原核表达质粒pGEX 2T/N ,并表达GST N融合蛋白 ,为下一步的研究奠定了基础。     

SARS-CoV核衣壳蛋白单克隆抗体识别抗原位点的分析

SARS CoV主要的结构蛋白包括刺突糖蛋白(spikeglycoprotein ,S)、包膜小蛋白 (smallenvelope ,E)、膜蛋白 (membrane ,M)和核衣壳蛋白 (nucleocap sidprotein ,N)。研究发现 ,N蛋白诱导机体产生很强的免疫应答〔1〕,我们用SARS CoV全病毒免疫小鼠制备的单克隆抗体 ,发现有 80 %是针对N蛋白的抗体 ,证明N蛋白具有很强的免疫原性 ,这与以往对动物冠状病毒N蛋白研究结果是一致的〔2〕。本研究通过对SARS CoVN蛋白单克隆抗体结合抗原位点分析 ,以及用SARS CoV抗体阳性血清与单抗对N蛋白进行竞争抑制试验 ,分析自然状态下机体对N蛋…     

SARS-CoV E蛋白基因的扩增及原核表达载体的构建

加拿大英属哥伦比亚癌症研究所基因组科学中心已完成了SARS冠状病毒的全基因组测序 (基因库登录号 :AY2 74 119)。SARS CoV基因组编码包括S蛋白、M蛋白、N蛋白和E蛋白等结构蛋白质。E蛋白是最小的结构蛋白 (为糖蛋白 ) ,散布于SARS病毒的包膜 ,疏水性最强 ,其核苷酸序列为 2 31bp ,编码 76个氨基酸 ,其等电点为 6 .0 1,相对分子质量为 8.36 1× 10 3。推测E蛋白的作用有利于病毒形状的形成 ,在病毒颗粒形成过程中起主要作用。本文利用已公布的SARS CoV基因组序列 ,克隆了E蛋白基因 ,以期为深入研究E蛋白的生物学功能和药物或疫…     

SARS-N蛋白真核表达质粒的构建及其免疫原性

目的　选取SARS CoVN蛋白编码基因为研究对象 ,构建真核表达质粒PVAX1/N ,并在体外转染COS 7细胞的基础上免疫Balb/c小鼠 ,测定血清总IgG水平及诱发的细胞免疫反应。方法　用RT PCR方法从感染SARS病毒的VeroE6细胞中扩增得到约 12 6 9bp的片段 ,构建重组真核表达质粒PVAX1/N ,转染COS 7细胞后 ,用细胞免疫化学方法鉴定目的蛋白的表达 ;免疫Balb/c小鼠后 ,用ELISA方法测血清总IgG水平 ,MTS/PES比色法测定脾T淋巴细胞增殖 ,ELISPOT法测定CD8+ T淋巴细胞的活性。结果　构建的重组质粒经酶切及测序鉴定 ,与GenBank中登录的序列完全一致 ;细胞免疫化学鉴定结果显示 :重组质粒可在COS 7细胞中表达有免疫原性的SARS CoVN蛋白 ;免疫小鼠血清中检测到较高滴度的抗体 ;T淋巴细胞增殖及CTL活性均明显优于对照组 (P <0 .0 1)。结论　成功构建真核表达质粒PVAX1/SARS CoVN ,并能诱导免疫小鼠产生特异性的抗SARS抗体及特异性的细胞免疫反应     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白特异性单克隆抗体(McAb)，为SARS的快速诊断及致病机制的研究提供实验材料。方法 用纯化的重组SARS-CoVN蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合和亚克隆后获得分泌针对N蛋白的杂交瘤细胞株，用Western blot和间接免疫荧光法检测这些细胞株分泌的单克隆抗体特异性，并将N蛋白分3段表达初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。结果 通过细胞融合和3轮克隆化，筛选出分泌抗N蛋白的6个杂交瘤细胞株。Western blot及免疫荧光显示，获得的McAb可与SARS-CoVN蛋白及SARS-CoV发生特异性反应，有4个细胞株分泌的抗体的识别位点位于N蛋白N端，2个位于C端。结论 获得了SARS-CoV特异性单克隆抗体并进行了初步定位，可用于SARS的早期诊断及致病机制研究。     

抗SARS-CoV重组纤突蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

SARS冠状病毒(SARS-CoV)严重威胁人类的健康,对其深入研究具有重要的现实意义。许多研究表明,SARS-CoV的S糖蛋白(spike glycoprotein)为其主要抗原,在病毒与宿主细胞表面受体结合并介导病毒经膜融合进入细胞中起关键作用。SARS-CoV病毒S蛋白的N末端含有由疏水性氨基酸组成的短的Ⅰ型信号序列,C末端含有跨膜结构域和富含半胱氨酸残基的胞质区尾部。这些序列在SARS-CoV中高度保守[1,2],因此,可以通过检测S蛋白诊断SARS-CoV病毒的早期感染。本研究中,我们制备了抗S蛋白的单克隆抗体(mAb),并对其特性进行了鉴定,为建立诊断SAR…     

幽门螺杆菌HpaA-CtxB融合蛋白的表达及其免疫原性研究

目的 :探讨幽门螺杆菌融合蛋白粘附素 霍乱毒素B亚单位 (HpaA CtxB ,HCTB)经口服免疫小鼠后 ,机体产生的免疫应答。方法 :用PCR方法扩增HpaA和CtxB两个目的基因片段 ,将它们分别克隆至pET 32a( )和pQE 30质粒上 ,然后同时插入pQE 30表达载体中 ,构建含双基因的的表达质粒pQE HCTB ,转化E .coliDH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白HCTB ;West ernblot分析其免疫反应性。融合蛋白经镍离子柱纯化后 ,HCTB和HpaA分别给小鼠灌胃进行免疫 ,ELISPOT和ELISA分别检测小鼠胃粘膜、派伊尔小结 (Peyer′spatches ,PP)抗原特异性抗体分泌细胞 (ASC) ,和血清IgG、IgA、小肠粘液sIgA和粪便sIgA。结果 :经测序HCTB融合基因片段由 116 1bp组成 ,为编码 387个氨基酸残基的多肽。经SDS PAGE分析相对分子量 (Mr)约为4 0 0 0 0。可溶性表达占全菌的 2 5 %以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 92 %以上的重组蛋白。Westernblot分析其能分别与HpaA抗血清和CT抗血清特异性反应。灌胃免疫小鼠后ELISPOT和ELISA检测结果 ,胃和PPsIgA ASC、IgG ASC数量明显增加 ,尤以sIgA ASC为甚 ,同时血清IgA、IgG ,粪sIgA ,肠粘液sIgA也明显高于HpaA组和对照组 (P <0 0 5和P <0 0 1)。结论 :融合蛋白HCTB经口服免疫可有效诱导粘膜免疫应答 ,产生高水平     

Yeast expression and characterization of SARS-CoV N protein

The severe acute respiratory syndrome human coronavirus (SARS-CoV) nucleocapsid protein (N protein) is its most antigenic structural protein. The N protein gene has been cloned into a yeast expression vector pPIC9, transformed into Pichia pastoris strain GS115 and induced for expression by methanol. SDS-PAGE and Western blot showed that the N protein was expressed at a level of 3 mg/ml of culture medium. Characterization by mass spectrometry, circular dichroism and fluorescence luminescence assays showed that the expressed N protein displayed a β-sheet secondary structure in solution and it is stable in the pH range between 5.0 and 8.0. The P. pastoris-expressed N protein is believed to more closely resemble native SARS N protein than the bacterially expressed N protein.     

SARS病毒N蛋白的表达与DNA疫苗的构建

目的：在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒核衣壳N蛋白，并构建其DNA疫苗。方法：构建含N基因的原核表达载体pQEN，并在大肠杆菌M15中表达N蛋白。采用NP亲和层析法纯化目的蛋白。将N基因克隆入真核表达载体pSecTagB中，构建真核重组质粒pSecN。以其免疫小鼠制备抗血清，并用ELISA法检测其与大肠杆菌中表达的重组N蛋白及天然全病毒N蛋白的反应性。结果：重组N蛋白能与DNA疫苗免疫的小鼠血清以及SARS患者血清发生特异性反应；SARS—CoV病毒颗粒也可与DNA疫苗免疫的小鼠血清发生特异性反应。结论：重组N蛋白保留了病毒的一些特异性抗原表位，可作为用ELISA法检测SARS—CoV的抗原。构建的DNA疫苗可在小鼠体内产生高效价的抗SARS病毒N蛋白的特异性抗体，从而为该疫苗的开发奠定了基础。     

Expression and membrane integration of SARS-CoV E protein and its interaction with M protein

The severe acute respiratory syndrome (SARS)-CoV E gene fragment was cloned and expressed as a recombinant protein fused with a myc tag at the N-terminus in vitro and in Vero E6 cells. Similar to other N-glycosylated proteins, the glycosylation of SARS-CoV E protein occurred co-translationally in the presence of microsomes. The SARS-CoV E protein is predicted to be a double-spanning membrane protein lacking a conventional signal peptide. Both of the transmembrane regions (a.a. 11–33 and 37–59) are predicted to be α-helices, which penetrate into membranes by themselves. As expected, these two transmembrane regions inserted a cytoplasmic protein into the endoplasmic reticulum membrane. Either of these two transmembrane domains co-localized with M protein. Both the transmembrane domains of E protein are required to interact with M protein, while either of the hydrophilic regions (a.a. 1–10 or 60–76) is dispensable as shown by co-immunoprecipitation assay. These results are important for the study of SARS-CoV assembly. Electronic supplementary material  The online version of this article (doi:) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

Comparative immunization in BALB/c mice with recombinant replication-defective adenovirus vector and DNA plasmid expressing a SARS-CoV nucleocapsid protein gene

In order to investigate immunogenicity in the induction of humoral and cellular immune responses, severe acute respiratory syndrome associated coronavirus （SARS-CoV）-N gene recombinant replication-defective adenoviral vector, rAd-N, was generated and immunized BALB/c mice in a pcDNA3.1-N prime-rAd-N boost regimen. After humoral and cellular immune response detection, different levels of SARS-CoV N protein specific antibodies and interferon-γ （IFN-γ） secretion are shown compared to controls. The humoral immune response was induced more effectively by the DNA priming and recombinant adenovirus boosting regimen. There is a significant difference between heterogeneous and homologous vaccinations. The heterogeneous combinations were all higher than those of the homologous combinations in the induction of anti-N antibody response. Among the three heterogeneous combinations, pcDNA3.1-N/pcDNA3.1-N/pcDNA3.1-N/rAd-N induced the strongest antibody response. In the induction of IFN-γ production, the homologous combination of rAd-N/rAd-N/rAd-N/rAd-N was significantly stronger than that of pcDNA3.1-N/pcDNA3.1-N/pcDNA3.1-N/pcDNA3.1-N, but was relatively weaker than the heterogeneous combination of pcDAN3.1-N/pcDAN3.1-N/pcDAN3.1-N/rAd-N. This combination was a most efficient immunization regimen in induction of SARS-CoV-N-specific （IFN-γ） secretion just as the antibody response. These results suggest that DNA immunization followed by recombinant adenovirns boosting could be used as a potential SARS-CoV vaccine.     

SARS冠状病毒S蛋白表位合成肽抗原性的研究

目的　研究SARS病毒合成肽疫苗。方法　根据目前已知SARS病毒的基因组序列及其编码的蛋白质 ,选择了SARS病毒编码的spike蛋白抗原表位蛋白质序列 ,运用计算机抗原表位预测技术 ,筛选抗原表位 ,以合成肽抗原表位。通过对SARS病人血清进行筛选确定与血清高交叉反应的 3个短肽 ,再合成多重抗原肽 (multipleantigenicpeptide ,MAP) ,与KLH偶联后免疫小鼠。结果　筛选的 3条与SARS病人血清反应强的肽 ,免疫小鼠均产生了高效价的抗体。结论　以合成肽为免疫原研究SARS病毒肽疫苗有着广阔前景。     

SARS冠状病毒膜蛋白膜内区的表达、纯化及抗原性初步研究

目的对SAILS冠状病毒膜蛋白膜内区基因片段进行克隆表达和表达产物的纯化复性,探讨该表达蛋白的抗原特性。方法克隆SAILS冠状病毒GD322株膜蛋白膜内区,在原核表达系统中表达His-融合蛋白,采用Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析His-融合蛋白抗原特性。结果7份SARS临床诊断患者血清中5份血清能与His-融合蛋白反应,2份不与之反应。兔抗OCA3、229E血清及20份健康人血清皆不与His-融合蛋白反应。His-融合蛋白免疫动物可产生多克隆抗体。结论本研究获得的His-融合蛋白可与SARS临床诊断患者血清特异性结合,可免疫动物获得特异性多抗;但不与健康人血清及兔抗OCA3、229E血清发生特异性结合。     

SARS-CoV N蛋白和MAP19的相互作用

目的:研究SARS-CoV N蛋白与MAP19之间的相互作用.方法:利用免疫共沉淀试验验证SARS-CoV N蛋白与MAP19的相互作用, 并利用Western blot检测SARS-CoV N蛋白对MAP19表达量的影响.结果:SARS-CoV N蛋白与MAP19能够在细胞内相互作用, 且SARS-CoV N能够显著提高MAP19的表达量.结论:SARS-CoV N蛋白与MAP19能够在细胞内形成复合物, 将为进一步研究SARS-CoV N蛋白与MAP19相互作用的生物学功能提供实验基础.     

Evaluation of antibody responses against SARS coronaviral nucleocapsid or spike proteins by immunoblotting or ELISA

Severe acute respiratory syndrome (SARS)-CoV is a newly emerging virus that causes SARS with high mortality rate in infected people. To study the humoral responses against SARS-CoV, we evaluated nucleocapsid (N) and spike (S) proteins-specific antibodies in patients' sera by Western blotting and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Recombinant N and S proteins of SARS-CoV were purified from transformed E. coli. Serum specimens from 40 SARS-CoV-infected patients in the convalescent phase were analyzed by Western blotting using the purified antigens. Serial serum specimens from 12 RT-PCR-confirmed SARS patients were assayed by ELISA using the recombinant N protein as coated antigen. By Western blotting, 97.5% of the SARS patients were positive for N protein-specific antibodies whereas only 47.5% of the samples were positive for S protein-specific antibodies. Using N protein-based ELISA, 10 out of the 12 patients were positive for N protein-specific antibodies and 6 of them showed seroconversion at mean of 16 days after onset of fever. Immunoblotting was useful for detecting the humoral immune response after SARS-CoV infection. Antibodies against SARS-CoV N protein appear at the early stage of infection, therefore, N protein-based ELISA could serve as a simple, sensitive, and specific test for diagnosing SARS-CoV infection.