盐酸小檗碱、黄芩苷和苦参碱对SZ95皮脂腺细胞增殖及脂质合成的影响

目的 研究中药单体盐酸小檗碱、黄芩苷和苦参碱对永生化人皮脂腺细胞(SZ95)增殖及脂质合成的影响.方法 倒置显微镜观察药物作用24h后细胞形态变化.确定药物的毒性浓度;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度的药物在作用24、48及72h对SZ95细胞增殖的影响;用流式细胞仪检测药物作用48h后尼罗红染色的SZ95细胞内脂质含量的变化.结果 毒性浓度黄芩苷为1×10^-3mol/L,盐酸小檗碱为1×10^-4mol/L,苦参碱在1×10^-3mol/L以下细胞未见形态变化.MTT法显示,盐酸小檗碱呈时间和剂量依赖性抑制SZ95细胞的增殖,IC50值48h为2.9×10^-5mol/L,72h为1.4×10^-5mol/L;黄芩苷在5×10^-4mol/L以下、苦参碱在1×10^-3mol/L以下对SZ95细胞增殖无影响.1×10^-4mol/L儿黄芩苷作用48h使细胞平均荧光强度下降30.1%(P<0.05);1×10^-6mol/L盐酸小檗碱下降7.9%,但差异无统计学意义(P>0.05);1×10^-3mol/L苦参碱则促进脂质合成(26.9%).结论 盐酸小檗碱、黄芩苷等中药单体可能具有抑制皮脂腺细胞增殖或脂质合成的作用.     

卡泊三醇、维A酸及雷公藤内酯醇对角质形成细胞及COLO16细胞中血管内皮生长因子生成的影响

目的 探讨卡泊三醇、维A酸及雷公藤内酯醇对角质形成细胞及COLO16细胞中血管内皮生长因子(VEGF)生成的影响.方法 采用RT-PCR法检测原代培养的人角质形成细胞及COLO16细胞中VEGFmRNA的水平.结果 卡泊三醇作用于正常人角质形成细胞4h和24h后,以及作用COLO16细胞24h后,均可抑制VEGFmRNA的表达,呈剂量依赖性,IC₅₀值分别为1.19×10^-4μg/mL、1.51×10^-4μg/mL和3.16×10^-5μg/mL.维A酸作用于正常人角质形成细胞4h后可抑制VEGFmRNA的表达,作用于正常角质形成细胞24h后及作用于COLO16细胞4h和24h均无抑制作用.雷公藤内酯醇对正常角质形成细胞和COLO16细胞中VEGFmRNA表达均无抑制作用.结论 在转录水平抑制VEGF生成可能是维A酸与卡泊三醇抗银屑病的作用机制之一.     

维生素D_3抑制角质形成细胞MCP-1的表达

目的　观察维生素D3 对角质形成细胞单核细胞化学吸引蛋白质 1(monocytechemoattractantprotein 1,MCP 1)的表达影响 ,探讨其在治疗银屑病中的作用机制。方法　培养角质形成细胞株HACAT ,并用不同浓度的维生素D3 处理 2 4h ,通过酶联免疫吸附 (ELISA)法检测上清液中MCP 1的表达 ;通过RT PCR法进一步检测细胞中MCP 1mRNA的水平。结果　经过浓度为 7.8× 10 -12 mol/L～ 6.2 5× 10 -11mol/L的维生素D3 处理过的角质形成细胞株HA CAT ,其分泌至上清中的MCP 1水平明显受到抑制 ,细胞中MCP 1mRNA的水平低于正常对照组。结论　维生素D3 在治疗银屑病过程中很有可能是通过抑制了角质形成细胞中MCP 1的表达 ,从而减弱了银屑病患者角质形成细胞趋化单核细胞及巨噬细胞的能力 ,阻止了银屑病皮损局部的炎症反应。     

维胺酯对HaCaT细胞增殖和分化的影响

目的 探讨维胺酯对体外培养角质形成细胞(HaCaT细胞)增殖和分化的影响.方法 将浓度为2,5,10,15,20,25,30 μg/mL的维胺酯作用于培养的HaCaT细胞,采用MTT法检测维胺酯对HaCaT细胞体外增殖的影响,流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率变化,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测分化标记物角蛋白10及内披蛋白mRNA的表达水平.结果 2 μg/mL维胺酯处理的HaCaT细胞,48 h时表现出对细胞增殖的抑制作用,随着时间延长和药物剂量加大,抗增殖作用愈明显;当药物质量浓度达到30 μg/mL时,48 h和72 h时的抑制率分别为57.67%和82.00%.与对照组相比,经维胺酯作用48 h后,细胞G₁期比例显著增加,S期与G₂期比例则显著下降,并可抑制G₁/G₂期转换,但对细胞凋亡无影响.细胞内披蛋白mRNA表达水平随维胺酯处理浓度增高而上升,药物浓度达30μg/mL时,表达水平由对照组的40.80%增高至156.12%;而角蛋白10 mRNA表达水平则下降,由96.46%降至14.60%.结论 维胺酯具有抑制角质形成细胞增殖及诱导其分化的作用.     

紫外线对HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达的影响

目的 观察紫外线照射对人角质形成细胞系HaCaT细胞表达结合珠蛋白的影响。方法 用逆转录-聚合酶链反应法检测长波紫外线UVA、中波紫外线UVB照射后HaCaT细胞各时相结合珠蛋白mRNA表达水平。结果 UVA12J/cm²照射后HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达明显升高。照射后20min结合珠蛋白mRNA表达已开始升高,6h达第一高峰,48h出现第二高峰。照射后2h、4h、6h、24h、48h组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)UVB30mJ/cm²照射HaCaT细胞后结合珠蛋白mRNA表达也出现时相变化:4h达第一高峰,48h出现第二高峰。照射后20min、2h、4h、6h、12h、48h、72h组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 紫外线UVA、311nmUVB上调HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达,随照射时间,结合珠蛋白mRNA表达呈时相变化。     

内皮缩血管肽1和促肾上腺皮质激素对体外培养的正常人黑素细胞增殖的影响

目的 了解内皮缩血管肽1及促肾上腺皮质激素(ACTH)对体外培养的正常人黑素细胞增殖的影响.方法 采用体外黑素细胞培养技术、四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)研究不同浓度内皮缩血管肽1、ACTH对黑素细胞增殖的影响.结果 从0.1~1000nmol/L浓度的内皮缩血管肽1均可不同程度地促进正常人黑素细胞的增殖,低浓度0.1nmol/L内皮缩血管肽1具有很好的促增殖作用.10^-13~10^-9mol/L的ACTH也可不同程度地促进正常人黑素细胞的增殖,与对照组相比,P值均<0.05,其中又以高浓度10^-9mol/LACTH促增殖能力最强,10^-12mol/L、10^-11mol/L、10^-10mol/L 3个浓度间差异无统计学意义.结论 内皮缩血管肽1及ACTH具有促进体外培养的正常人黑素细胞增殖的作用,较低浓度内皮缩血管肽1即具有很好的促增殖作用,正常人生理水平(10^-12~10^-11mol/L)及更高浓度ACTH均有较强的促增殖作用.     

雷公藤内酯醇对HaCaT细胞表皮生长因子受体磷酸化及其下游信号激酶MEK的影响

目的 探讨雷公藤内酯醇对表皮生长因子(EGF)信号刺激HaCaT细胞后EGF受体磷酸化以及下游MEK途径的影响.方法 在HaCaT细胞培养体系中,用外源性重组人EGF为刺激信号,用免疫印迹法检测总EGF受体及其磷酸化受体,以及总MEK及其磷酸化激酶的表达.结果 雷公藤内酯醇对rhEGF引起的细胞总EGF受体表达无明显影响,但抑制磷酸化EGF受体表达,抑制作用呈剂量依赖性,IC₅₀值为2.38×10^-10mol/L.对细胞总MEK1/2表达也不影响,但明显下调磷酸化MEK,抑制作用的IC₅₀值约为6.03×10^-11mol/L.结论 雷公藤内酯醇对EGF信号引起的EGF受体磷酸化及下游MEK激酶磷酸化均有抑制作用.     

卤米松对角质形成细胞维生素D受体表达的影响

目的观察卤米松对角质形成细胞维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)表达的影响,以探讨糖皮质激素对维生素D3衍生物治疗银屑病效应的潜在影响。方法采用CCK8法观察不同浓度卤米松、卡泊三醇在不同时相点下对HaCaT角质形成细胞增殖的影响;采用反转录-实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)、蛋白印迹法,观察不同浓度卤米松在不同时相点作用下HaCaT细胞VDR的表达情况。结果卤米松可增强卡泊三醇对HaCaT细胞增殖的抑制作用;卤米松作用24 h、48 h后,HaCaT细胞中VDR m RNA及蛋白水平均明显升高,并呈剂量依赖性效应。结论卤米松上调VDR的表达可能有助于提高角质形成细胞对维生素D3衍生物作用的反应性,从而有可能提高维生素D3衍生物对角质形成细胞的治疗效应。     

银屑病患者中性粒细胞中CXC型趋化因子受体CXCR1、CXCR2 mRNA的表达

目的 了解银屑病患者外周血中性粒细胞中CXC型趋化因子受体CXCR1及CXCR2的表达情况。方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测了进行期斑块状银屑病患者及健康人对照各30例(其中治疗后患者14例)外周血中性粒细胞中CXCR1及CXCR2mRNA的表达,并将结果与患者皮损面积及严重程度指数(PASI)进行了相关性分析。结果 斑块状银屑病患者外周血中性粒细胞中CXCR1及CXCR2mRNA表达水平分别为1.30±1.18和1.62±0.97,明显高于正常人对照(分别为0.56±0.36、0.74±0.58,P<0.01),并随治疗后患者PASI评分的下降而降低,治疗后CXCR1、CXCR2分别为0.49±0.34、0.51±0.51,(P<0.01),银屑病患者外周血中性粒细胞中CXCR2mRNA水平高于CXCR1mRNA水平,二者均与PASI呈显著正相关。CXCR1:r=0.60,P<0.001;CXCR2:r=0.84,P<0.001。结论 银屑病患者外周血中性粒细胞中增高的CXCR1与CXCR2可能与白细胞向皮损部位的移行和聚集有关,CXCR1及CXCR2参与了银屑病的发病机制。     

重组人甲状旁腺素(1-34)对角质形成细胞分泌IL-6和IL-8的影响

目的研究人甲状旁腺素(PTH)(1-34)对角质形成细胞分泌IL-6和IL-8的影响,探讨其治疗银屑病的分子机理。方法体外培养人角质形成细胞株(HaCaT),研究中设空白对照组、骨化三醇组、骨化三醇和PTH(1-34)联合组以及1.0×10-7mol/L～1.0×10-10mol/L4个不同剂量的PTH(1-34)给药组。48h后收集上清液,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HaCaT细胞分泌至培养液中IL-6和IL-8的含量。结果在1.0×10-7mol/L～1.010-10mol/L四个梯度浓度PTH(1-34)及联合骨化三醇处理48h后,HaCaT细胞分泌IL-6量和空白对照组、骨化三醇组比较,差异无统计学意义,而IL-8的分泌量明显降低(P<0.05),且1.0×10-7mol/LPTH(1-34)处理组IL-8分泌量明显低于其他各组。结论PTH(1-34)治疗银屑病的作用机制可能部分通过调节IL-8的表达和分泌来实现。     

miR-20a靶向STAT3抑制角质形成细胞增殖参与银屑病的机制

目的探讨miR-20a是否可靶向调控STAT3表达影响角质形成细胞增殖参与银屑病发生发展过程。方法QPCR检测银屑病患者正常皮肤和皮损组织中miR-20a、STAT3的表达情况,统计分析二者间的表达相关性;QPCR检测miR-20a表达变化对STAT3水平的影响;LUC验证miR-20a和STAT3间的靶向关系;miRNA mimics和STAT3过表达载体共转染后,MTT检测HaCaT细胞的增殖活性。结果miR-20a在银屑病患者皮损组织中特异性低表达,STAT3在皮损组织中高表达,且miR-20a与STAT3表达呈负相关性;QPCR检测miR-20a表达变化对STAT3的影响后发现miR-20a可抑制STAT3表达;LUC实验发现miR-20a可靶向结合STAT3;MTT功能实验结果表明STAT3过表达可增强角质形成细胞增殖活性,而过表达miR-20a不仅可抑制细胞增殖活性和STAT3的表达,还可部分逆转STAT3对细胞增殖的促进作用。结论miR-20a可靶向STAT3抑制角质形成细胞过度增殖,在银屑病发生发展中发挥保护作用。     

The inhibitory effect of VitD3 on proliferation of keratinocyte cell line HACAT is mediated by down-regulation of CXCR2 expression

Psoriasis is a disease characterized by inflammation and increased population of hyperproliferative keratinocytes. It is well known that chemokines and chemokine receptors, such as interleukin-8 and its receptors (CXCR1 and CXCR2), play important roles in the pathogenesis of psoriasis. So far, examination of CXCR2 expression in psoriatic lesional keratinocytes by FACS calibur has not been reported and whether VitD3 inhibits psoriatic lesional keratinocyte proliferation through down-regulation of CXCR2 expression has not been elucidated. In the present study, CXCR2 expression in psoriatic lesional keratinocytes and HACAT treated with VitD3 was detected by flow cytometry. The proliferative capacity of HACAT treated with VitD3 was assayed by MTT assay. The results showed that CXCR2 expression in psoriatic lesional keratinocytes was higher than that in normal human keratinocytes. At the correct concentration VitD3 could inhibit human keratinocyte proliferation and down-regulate CXCR2 expression in HACAT. The data demonstrate that the inhibitory effect of VitD3 on keratinocyte proliferation might be mediated by down-regulation of CXCR2 expression.     

他克莫司对角质形成细胞生长的抑制作用及其机制

为观察他克莫司对角质形成细胞表面表达趋化因子受体CXCR2的影响，探讨其在治疗银屑病中的作用机制，在不同时间段内用不同浓度的他克莫司处理人类角质形成细胞株HACAT，通过MTT法检测了他克莫司抑制HACAT增殖的有效剂量及时间；通过流式细胞术（FACS0分析他克莫司处理的HACAT表达CXCR2的情况。结果显示，HACAT经他克莫司在39ng/ml-5000ng/mL浓度范围内处理24h后的OD值较未处理组降低，但不具有统计学意义（P＞0．05）；经他克莫司处理48h的细胞OD值较未处理组明显降低（P＜0．05），各浓度之间无显著差异（P＞0．05）；HACAT在39ng/mL他克莫司处理48h后CXCR2的表达明显低于正常对照组。结果说明，他克莫司治疗银屑病的作用机制部分是通过抑制角质形成细胞表达CXCR2，从而达到抑制角质形成细胞增殖的目的。     

MiRNA-203在寻常性银屑病皮损的表达及其对HaCaT细胞增殖的影响

目的 研究微小核糖核酸(miRNA)-203在寻常性银屑病患者皮损中的表达,并探讨对角质形成细胞株(HaCaT细胞)增殖的影响.方法 取2014-2016年23例寻常性银屑病患者的皮损组织和相邻非皮损组织.荧光定量PCR法检测组织中miRNA-203的表达水平,并以5'端、3'端地高辛标记的探针对皮肤组织切片中目的miRNA进行原位杂交,观察miRNA-203在皮肤组织中的定位情况.将miRNA-203模拟物(miRNA-203模拟物组)和miRNA-203模拟物阴性对照(阴性对照组)分别转染HaCaT细胞,正常细胞培养组作为空白对照组,采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪和Western印迹法分别对HaCaT细胞的增殖、细胞周期及相关周期蛋白(Cyclin D1、Cyclin B1)的变化进行检测.结果 miRNA-203特异性地表达在表皮的角质形成细胞中,除细胞核外,细胞质亦有表达,且寻常性银屑病患者皮损组织中miRNA-203表达水平(1.35±0.28)显著高于非皮损组织(0.52±0.09),差异有统计学意义(t=6.76,P=0.012).转染miRNA-203模拟物能抑制HaCaT细胞增殖(F=9.36,P=0.007),且空白对照组、阴性对照组和miRNA-203模拟物组HaCaT细胞增殖率均随时间的延长逐渐增加(F=18.68,P＜0.001).与阴性对照组和空白对照组相比,miRNA-203模拟物组HaCaT细胞被阻滞在G2/M期(G2/M期细胞比例:31.33％±4.56％比17.02％±3.53％、16.67％±3.32％,均P＜0.05),HaCaT细胞周期蛋白周期蛋白D1表达水平较高(1.15±0.13比0.52±0.05、0.56±0.07,均P＜0.05),而周期蛋白B1水平较低(0.43±0.08比0.93±0.16、0.91±0.0.15,均P＜0.05).结论 miRNA-203可能参与了寻常性银屑病的发生发展过程.     

Cyclosporin A induces the unfolded protein response in keratinocytes

Psoriasis vulgaris is a chronic inflammatory disorder of the skin, in which activation of keratinocytes and crosstalk between keratinocytes and T cells or dendritic cells are considered to be involved in the pathogenesis of psoriasis vulgaris. Cyclosporin (Cy) A, an immunomodulator, has been used for the treatment of psoriasis vulgaris, but the mechanism of its action on keratinocytes has not been well elucidated as its function on T cells is well known. Previous study indicated that the expression of the unfolded protein response (UPR) markers, GRP78/Bip and HRD1 were poorly expressed in psoriasis vulgaris. To investigate if the UPR in keratinocytes is involved in the pathogenesis of psoriasis vulgaris we assessed immunocytochemistry of normal human skin and psoriatic lesions, quantitative PCR of keratinocyte cell line (HaCaT) treated with TGFβ. Moreover, to elucidate how CyA effects on the UPR in keratinocytes, we set out quantitative PCR and western blotting, HaCaT and squamous cell carcinoma cell lines (HSC-1) treated with CyA and CyA analog, cyclosporin D. Furthermore, the siRNA-mediated knockdown effect of cyclophilin (Cyp) A, Cyp B and Cyp C on HaCaT cells were also examined. As a result, the UPR was downregulated in keratinocytes from psoriatic lesions, characterized by immunocytochemical staining of GRP78/Bip, CHOP/GADD153, HRD1 and C/EBPβ. TGFβ induced UPR markers in HaCaT cells. CyA treatment and siRNA-mediated knockdown of Cyp B induced the UPR in HaCaT cells or HSC-1 cells. Altogether, we demonstrate that in psoriasis vulgaris CyA or reduction in Cyp B by RNA interference might induce the UPR in keratinocytes.     

白介素8及其受体CXCR2在银屑病角质形成细胞中的表达

目的 观察白介素8（IL－8）及基受体CXCR2在银屑病角质形成细胞中的表达及在银屑病的临床及病理表现中的作用。方法 培养银屑病患者皮损处角质形成细胞，通过微孔小室实验检测其上清液的趋化功能，通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测上清液中IL－8的表达，通过流式细胞仪分析银屑病患者皮损处角质形成细胞的趋化因子受体CXCR2的表达。结果 银屑病患者皮损处角质形成细胞分泌上清液对中性粒细胞的趋化能力明显强于正常对照组，其分泌的IL－8水平也高于正常人，皮损处角质形成细胞CXCR2的表达也明显强于正常对照组。结论 银屑病患者皮损局部表面出的角质形成细胞高度增殖与角质形成细胞高分泌、高表达具有促增殖作用的IL－8及其受体CXCR2有关，同时皮损局部大量的炎性细胞的浸润部分可能是由于角质形成细胞高分泌具有趋化能力的IL－8，它们可能在银屑病的发生、发展中起着重要作用。     

UVN对角质形成细胞生长的抑制作用及其机制研究

目的：观察UVN（混合紫外线）对角质形成细胞（keratinocytes,KC)生长的抑制作用并分析其机制。方法：将角质形成细胞株HACAT经生理剂量的UVN照射后,通过LEICA显微镜观察其形态,通过四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测其增殖情况,通过流式细胞术（FACS）分析UVN照射后不同时间HACAT的趋化因子受体CXCR2表达的改变。结果：生理剂量UVN照射HACAT后,部分细胞变圆,少量细胞脱落。照射后24h细胞的增殖受到明显抑制,此时其CXCR2的表达也明显降低,但至48h开始其增殖能力和CXCR2的表达开始恢复,72h后其增殖能力及CXCR2的表达进一步恢复,但与正常对照组间仍见差异。结论：UVN的照射可降低银屑病角质形成细胞CXCR2的表达,这可能因抑制了白细胞介素8（linterleukin 8,IL-8)等细胞生长因子对KC的促增殖作用从而对银屑病表现出一定的治疗效果。     

靛玉红对角质形成细胞中促炎细胞因子表达水平的影响

目的:探讨靛玉红对人类永生化角质形成细胞株(HaCaT细胞)中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平的影响,初步阐明青黛膏治疗银屑病的机制.方法:以人类永生化角质形成细胞株HaCaT细胞作为研究对象,观察不同浓度靛玉红处理后HaCaT细胞中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平的变化,采用E...