人胚胎视网膜来源神经干细胞体外培养尝试

目的从人胚胎视网膜中分离、培养神经干细胞。方法人16～20周胚胎视网膜制备的单细胞悬液,分别在无血清和有血清条件下进行体外培养,采用免疫荧光法检测培养的细胞对nestin和视网膜终末细胞抗原的表达,采用RT—PCR方法和实时荧光定量PCR法检测诱导前后细胞nestin基因在mRNA水平的表达差异。结果可从人胚胎视网膜神经感觉层中培养出神经干细胞。该细胞具有自我复制能力,表达nestin,经不同条件诱导后细胞表达视网膜视杆细胞、无长突细胞、双极细胞、节细胞和米勒细胞等标志。诱导后细胞nestin基因表达量较诱导前细胞明显降低。结论人胚胎视网膜神经感觉层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。（中华眼科杂志,2005,41：847-852）     

体外培养人胚胎来源视网膜干细胞的诱导分化

目的 探讨培养的人胚胎来源视网膜干细胞向视网膜终末细胞分化的可能性。方法 来自16～20周人胚胎的视网膜干细胞进行无血清体外培养,并分别进行有血清条件下体外诱导和用含视网膜色素上皮的眼杯模拟体内条件诱导的观察,采用免疫荧光法检测干细胞和视网膜终末细胞表面抗原的表达,采用实时荧光定量PCR法检测诱导前后细胞nestin基因在mRNA水平的表达差异。结果 从人胚胎视网膜神经感觉层分离出的视网膜干细胞,在体外诱导的条件下,可表达视网膜终末细胞标记PKCα、GFAP、Thy1,少数细胞表达nestin和MAP2;在模拟体内环境诱导后,则不仅表达上述细胞标记,而且rhodopsin和syntaxin表达阳性。实时荧光定量PcR法检测显示：诱导后细胞nestin基因表达量较诱导前细胞明显降低。结论 RPE可以促进体外培养的视网膜干细胞向视杆细胞和无长突细胞分化。(中华眼科杂志,2004,40：448-452)     

人视网膜中神经干细胞样细胞的分离和体外培养

目的 分离培养发育基本成熟的人视网膜中神经干细胞样细胞。方法 取0～3岁猝死婴幼儿视网膜细胞，在干细胞选择性培养基中培养，观察原代和传代细胞的形态和增殖情况，并对其诱导分化。通过免疫细胞化学方法检测Nestin、MAP-2和GFAP的表达。结果 原代细胞可形成悬浮生长的致密球状细胞团，传代后能形成新的细胞球。部分细胞球表达Nestin，传代后阳性率增加。分化后细胞形态多样，每一团细胞相对一致，部分细胞表达MAP-2或GFAP。结论 0～3岁人视网膜中存在一种表现出神经干细胞特性的细胞。     

大鼠胚胎视网膜干细胞的分离培养

目的分离培养大鼠胚胎视网膜干细胞。方法从胎龄第16d的SD大鼠视网膜神经上皮分离视网膜细胞并进行悬浮培养,观察细胞增殖以及自发分化情况,采用免疫细胞化学方法检测Nestin、β-Tubulin、GFAP和Recoverin的表达。结果原代细胞可形成悬浮生长的神经球,传代后能形成新的细胞球。原代及传代细胞大部分表达神经干细胞标记物Nestin,分化后的细胞部分表达神经元标记物β-Tubulin或神经胶质细胞标记物GFAP,少数细胞表达光感受器细胞标记物Recoverin。结论分离培养的SD胚鼠视网膜神经干细胞可以在体外扩增并具有多分化潜能。     

大鼠视网膜干细胞与神经干细胞体外增殖、分化特点比较

目的 通过对大鼠视网膜干细胞和神经干细胞体外增殖、分化特点进行比较,进一步明确视网膜于细胞自我更新及向神经细胞方向分化的能力.方法 实验研究.分离出生10 d大鼠睫状体区组织及新生大鼠脑组织,分别应用酶消化法将两种组织制成单细胞悬液,放入含有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养,观察并比较视网膜干细胞及神经干细胞体外增殖的特点.分别取第2代细胞,应用免疫细胞化学染色法检测干细胞特异性抗原神经巢蛋白（nestin）及细胞分裂增殖标志物5-溴脱氧尿核苷（BrdU）的表达.同时,应用含50 ml/L的胎牛血清及1×N2添加剂的培养基促进其分化,观察两种细胞向神经细胞方向分化的特点：分别应用免疫细胞化学染色法对分化后的细胞nestin、神经无标志物神经元特异性烯醇酶（NSE）、神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白（GFAP）进行检测,并应用卡方检验对两种干细胞分化后的NSE及GFAP阳性细胞数比例进行比较.结果 两种细胞原代培养48 h后均可见小的球状细胞团悬浮生长,折光性强.原代培养约7 d后传代,传代后细胞能重新形成球状细胞团,应用免疫细胞化学染色方法均可检测到细胞内nestin及BrdU的阳性表达,视网膜干细胞体外增殖的能力较神经干细胞弱.两种细胞均可在血清诱导条件下转变为贴壁生长,并分化出具有神经细胞形态的细胞.诱导第7天进行免疫细胞化学染色,检测出两种干细胞表达nestin阳性细胞数比例分别为（9.5±3.5）%及（9.1±0.7）%.视网膜干细胞分化后NSE及GFAP的阳性细胞数比例分别为（11.2±2.8）%及（18.9＋2.1）%,低于神经干细胞分化后两种标志物阳性细胞数比例[（34.1±63）%及（41.9±3.3）%],NSE、GFAP在两组表达的差异均有统计学意义（x2=103.23,P＜0.05;x2=74.36,P＜0.05）.结论 来源于睫状体区的大鼠视网膜干细胞形态、体外增殖及可分化特性与神经干细胞相似,但其增殖及分化为神经细胞的能力较神经干细胞弱.     

人胚眼视网膜光感受器细胞的体外培养和鉴定

目的：探讨人胚眼视网膜光感受器细胞的获得和体外培养方法,为进行人类视网膜光感受器细胞移植提供理论依据。方法：采用酶分层消化法分离获取了胚眼纯视网膜光感受器细胞,使用视网膜色素上细胞的条件培养液,在体外长期培养并进行形态学鉴别;用苏木素－伊红染色显示消化后的视网膜组织结构层次,以确定所获得取的视网膜光感受器细胞的纯度;用抗视杆细胞特异性视紫质蛋白抗体（rhodopsin4D2,Rho4D2)免疫细胞化学染色做细胞鉴定,结果：酶分层消化法能获取较纯的视网膜光感受器细胞,抗Rho4D2阳性,并能在体外存活较长时间,结论：酶分层消化法所获取的人胚眼纯视网膜光感受感器细胞能在体外较长时间存活,并可表达光感受器细胞特异性视紫质蛋白,将为人类视网膜光感受器细胞的移植和各种体外研究提供细胞特异性视紫质蛋白,将为人类视网膜光感受器细胞的移植和各种体外研究提供细胞来源。     

SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

目的 探讨视网膜神经细胞培养的上清液对胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）体外分化的诱导作用。 方法 收集SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液，抽滤后按2∶3比例与DMEM培养液混合，用该混合液进行ES 细胞的诱导分化，每天倒置相差显微镜观察ES细胞的生长及分化情况,对诱导分化后的细胞进行神经丝蛋白(nellcofilament protein，NFP)免疫组织化学检查。 结果 加入了视网膜神经细胞培养上清液的ES细胞生长出类似神经细胞突起样结构，NFP免疫组织化学染色阳性。 结论 SD大鼠视网膜神经细胞培养的上清液具有诱导ES细胞向神经细胞分化的作用。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 134-136)     

体外诱导室管膜下区神经干细胞分化为视网膜神经细胞样细胞的研究

目的 研究室管膜下区细胞的体外培养及其诱导分化情况。方法 取新生0—3d的SD乳鼠室管膜下区细胞进行体外培养,同时培养视网膜神经细胞。收集视网膜细胞培养上清液,配制成条件分化液,将培养的室管膜下区细胞接种于视网膜细胞条件分化液中,并对诱导的细胞进行免疫荧光鉴定。结果体外培养的室管膜下区细胞在无血清的培养基中生长良好,接种于SD乳鼠视网膜细胞条件分化液中的室管膜下区细胞可分化为视网膜神经样细胞。应用,Thyl.1单克隆抗体行免疫荧光检查,细胞呈阳性反应。结论 在一定条件下室管膜下区细胞能够于体外培养存活,视网膜细胞条件分化液可定向诱导室管膜下区细胞分化为视网膜神经节细胞样细胞,体外模拟眼内环境行室管膜下区细胞诱导,将为进一步的眼内移植提供理论依据。     

体外无血清培养新生SD大鼠视网膜神经细胞

目的 采用无血清培养建立新生SD大鼠视网膜神经细胞的体外培养方法,为视网膜神经细胞的体外实验研究奠定基础.方法 取出生后3～5d的SD大鼠视网膜,用胰蛋白酶消化分离获取细胞悬液,使用无血清神经原培养基(Neurobasal TM-A Medium)和添加剂B-27 Supplement Minus AO进行培养.倒置相差显微镜观察细胞形态及轴突生长情况.培养至第5天,用抗微管相关蛋白2抗体、抗视紫红质蛋白抗体及抗胶质纤维酸性蛋白抗体,行免疫细胞化学鉴定并计算视网膜视杆细胞的纯度.结果 采用无血清法培养的视网膜神经细胞生长良好,细胞伸出突起,部分神经元的突起交织呈网状.生长至第5天经免疫细胞化学证实其中神经元细胞占95.6％,而38.6％为视网膜视杆细胞,同时神经胶质细胞的生长得到了很好地抑制.结论 无血清培养法可以获取纯度较高的视网膜神经细胞,为研究视网膜光感受器细胞提供了理想的体外实验模型.     

大鼠胚胎视网膜前体细胞的分离、体外培养及鉴定

目的探讨流式细胞分析技术、免疫荧光及^3H—Thymidine分析对大鼠胚胎视网膜前体细胞性质及其体外增殖进行鉴定的可行性。方法来源于19d胚胎大鼠视网膜的视网膜前体细胞,使用流式细胞分析及免疫荧光技术从数量及形态上对细胞性质进行鉴定。采用无血清培养基体外培养,通过^3H-Thymidine分析、形态学观察及统计学分析,研究细胞增殖情况。结果从胚胎大鼠全层视网膜分离出的原代视网膜前体细胞,流式细胞分析结果显示：培养0d时,22．23％的细胞神经上皮干细胞蛋白（Nestin）呈阳性表达,16．04％的细胞Sox-2呈阳性表达,19．66％的细胞钙结合蛋白呈阳性表达,其余终末视网膜细胞标记物（胶质纤维酸性蛋白、CD90、视紫红质、C反应蛋白、突触前膜列阵蛋白）均呈极微量阳性或阴性。免疫荧光结果显示大部分细胞及细胞球（〉90％）Nestin呈阳性表达。培养6d后,流式细胞分析显示43．36％的细胞Nestin阳性,免疫荧光显示Nestin及胶质纤维酸性蛋白呈阳性。连续4d^3H-Thymidine分析及形态学观察、统计学分析原代视网膜前体细胞初期增殖良好。结论流式细胞分析、免疫荧光及^3H—Thymidine等免疫学技术可很好的对视网膜前体细胞性质及其增殖情况进行鉴定。大鼠胚胎原代视网膜前体细胞表现出神经干细胞的特性,根据检测手段不同,阳性结果不同,其原代视网膜前体细胞体外培养初期增殖良好。     

异种神经干细胞移植的存活与分化

目的 探讨异种神经干细胞注射到玻璃体腔后迁移到视网膜的存活及分化。方法 将起源于人胚胎大脑脑室下区的神经干细胞悬浮液注射到SD大鼠的玻璃体腔中。分别于手术后4周和6周处死并剥离出视网膜，进行免疫组织化学染色，在荧光显微镜下观察实验结果。结果 术后4周和6周均可见有移植细胞存活，术后6周时移植前微管相关蛋白2（MAP2）阴性表达的移植细胞，移植后为阳性表达。结论 起源于人胚胎大脑脑室下区的神经干细胞可以迁移到视网膜组织中存活，并且可以进一步分化。     

体外培养及诱导胚兔视网膜及脑神经干细胞分化的研究

目的 比较体外不同培养条件对视网膜及脑神经干细胞(NSCs)视紫红质的纯化能力及不同诱导条件对NSCs的诱导分化能力.方法 取胚兔视网膜及大脑皮质制备单细胞悬液,分别在5种不同培养基中进行体外培养并纯化.选取无血清条件下传3代的NSCs,分别在2种培养基中诱导8～10 d.采用免疫荧光法及流式细胞仪检测所获得细胞的神经干细胞和视网膜神经上皮细胞抗原的表达.结果 免疫荧光法显示无血清培养条件下2种组织来源的NSCs均部分表达巢蛋白.流式细胞术显示2种诱导方式均部分细胞表达巢蛋白,较诱导前明显降低,而视紫红质及Thy1.1的表达均较诱导前明显增高.经5%胎牛血清(FBS)诱导的细胞表达视紫红质较联合应用全反式视黄酸(ATRA)时高,差异均有统计学意义(χ2=30.59,6.76;P<0.01).但Thy1.1表达低于后者,差异也有统计学意义(χ2=6.19,22.92;P=0.01).结论 无血清培养基添加N2、EGF、bFGF、LIF 4种因子可以获得最佳纯化效果.2种诱导培养基都能够诱导NSCs的分化,视网膜NSCs分化为视网膜神经上皮细胞的能力高于大脑皮质NSCs.     

Incorporation and differentiation of hippocampus-derived neural stem cells transplanted in injured adult rat retina

PURPOSE: In a previous study it has been shown that adult rat hippocampus-derived neural stem cells can be successfully transplanted into neonatal retinas, where they differentiate into neurons and glia, but they cannot be transplanted into adult retinas. In the current study, the effect of mechanical injury to the adult retina on the survival and differentiation of the grafted hippocampal stem cells was determined. METHODS: Mechanical injury was induced in the adult rat retina by a hooked needle. A cell suspension (containing 90,000 neural stem cells) was slowly injected into the vitreous space. The specimens were processed for immunohistochemical studies at 1, 2, and 4 weeks after the transplantation. RESULTS: In the best case, incorporation of grafted stem cells was seen in 50% of the injured retinas. Most of these cells located from the ganglion cell layer through the inner nuclear layer close to the injury site. Immunohistochemically, at 1 week, more than half of the grafted cells expressed nestin. At 4 weeks, some grafted cells showed immunoreactivity for microtubule-associated protein (MAP) 2ab, MAP5, and glial fibrillary acidic protein (GFAP), suggesting progress in differentiation into cells of neuronal and astroglial lineages. However, they showed no immunoreactivity for HPC-1, calbindin, and rhodopsin, which suggests that they did not differentiate into mature retinal neurons. Immunoelectron microscopy revealed the formation of synapse-like structures between graft and host cells. CONCLUSIONS: By the manipulation of mechanical injury, the incorporation and subsequent differentiation of the grafted stem cells into neuronal and glial lineage, including the formation of synapse-like structures, can be achieved, even in the adult rat retina.     

Neuronal differentiation of hippocampus-derived neural stem cells cultured in conditioned medium of embryonic rat retina

PURPOSE: To investigate whether conditioned medium from embryonic rat retinas can induce differentiation of adult rat hippocampus-derived neural stem cells (AHSCs) into neurons and glia in vitro. METHODS: AHSCs were cultured in 3 types of media: standard culture medium, conditioned medium from embryonic rat retina, and standard culture medium with retinoic acid. Neuronal and glial differentiation of the cultured cells was assessed by cell growth analysis, flow cytometric analysis, immunofluorescent staining, and RT-PCR analysis. RESULTS: Cells cultured in the standard medium showed very little neuronal and glial differentiation. The cells cultured in the conditioned medium and the medium with retinoic acid showed neuronal morphology and growth inhibition. They also expressed mature neuronal markers and glial markers. In addition, the cells cultured in the conditioned medium expressed Thy-1, HPC-1, and calbindin, which were not found in the previous studies with postnatal retinas in vivo. Those cultured in the medium with retinoic acid expressed HPC-1 and calbindin, but not Thy-1. CONCLUSIONS: Conditioned medium from embryonic rat retina contains factors that induce neuronal and glial cell differentiation of AHSCs, and promote up-regulation of some types of retinal cell markers.     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的比较

目的:探讨体外分离培养高纯度、高活力大鼠骨髓间充质干细胞(MMSC)的方法,为眼科组织工程提供种子细胞。方法:取清洁级SD大鼠,改良贴壁筛选法分离培养MMSC,采用MTT法检测MMSC活性,流式细胞术检测MMSC纯度。对比改良贴壁筛选法与密度梯度离心法,剪去干骺端法与骨干中间剪断法,不同月龄大鼠MMSC活性和纯度(CD44 CD34-,CD90 CD34-)的差别。结果:改良贴壁筛选法比密度梯度离心法获取的MMSC细胞数量多,细胞纯度差异无明显统计学意义。剪去干骺端法比骨干中间剪断法获取的MMSC细胞数量少,细胞纯度差异无明显统计学意义。在相同接种密度条件下,MMSC的增殖活力随大鼠年龄的增长而下降。结论:改良贴壁筛选法是一种简便易行的培养高活力、高纯度MMSC的方法。     

An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina.

An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from normal rat retinas is described. Following a brief incubation in the neutral protease Dispase, large epithelial sheets can be harvested rapidly. The separation of the choroid from the pigment epithelium prior to retinal detachment greatly reduces the risk of contamination of the cultures with choroidal cells. Growth of pigment epithelial cells on Matrigel-coated microporous filters in hormonally-defined medium allows for development of high levels of transepithelial electrical resistance as well as for preservation of the differentiated pigment epithelial cell phenotype. This method should be useful for studies of pigment epithelial cell permeability and structural differentiation in vitro.     

胎儿角膜缘干细胞的培养和生物学特性观察

角膜缘干细胞(limbalstemcells,LSC)及利用角膜缘干细胞移植(limbalstemcellstransplantation,LSCT)重建眼表的研究正在国内外广泛展开。而实行LSCT其前提是必须有LSC供体,尽管当前LSC的来源有自体、同种异体和体外培养的自体及同种异体等几种,但均有其局限性。人胎儿细胞的增殖和分化潜能较成人同类细胞大,此外,胎儿的免疫系统没有发育完善,胎儿组织存在免疫宽容现象[1]。贾卉等[2]研究还发现,胎儿角膜中与免疫反应有关的细胞和细胞间黏附分子较成人少,故胎儿器官、组织或细胞移植较少甚至无免疫排斥反应发生。因此,为探寻一种新的…