大鼠全脑缺血再灌注后额叶神经细胞凋亡与P^53蛋白表达的实验

目的 探讨大鼠全脑缺血再灌注后不同时间对额叶神经细胞凋亡及P^53蛋白表达的影响。方法 采用改良的Pulsineli 4-血管阻断(4-VO)方法建立SD大鼠急性全脑缺血模型，随机分为3组：正常组（n=7)；假手术组（n=49)；手术组（n=49)。缺血15min，分别于再灌注1、6、12、24、48、72h和7d断头取脑，采用TUNEL方法检测神经细胞凋亡，SP免疫组化方法观察额叶P^53蛋白的表达。结果 全脑缺血再灌注24h，可见少量TUNEL阳性细胞，再灌注48h可见较多TUNEL阳性细胞，72h出现大量TUNEL阳性细胞，7d明显减少。免疫组化染色：缺血组于再灌注24h可见少量P^53蛋白表达，48h达高峰，72h有所下降，7d明显下降，这种表达主要在细胞核内。结论 急性全脑缺血再灌注后的迟发性神经元坏死是以凋亡的方式发生的，全脑缺血再灌注后，额叶P^53蛋白表达增加，神经细胞凋亡和P^53蛋白的表达在一定时间内呈正相关。     

大鼠全脑缺血再灌注后额叶神经细胞凋亡与P53蛋白表达的实验研究

目的 探讨大鼠全脑缺血再灌注后不同时间对额叶神经细胞凋亡及P~(53)蛋白表达的影响。方法采用改良的Pulsineli 4-血管阻断(4-VO)方法建立SD大鼠急性全脑缺血模型,随机分为3组:正常组(n=7);假手术组(n=49);手术组(n=49)。缺血15min,分别于再灌注1、6、12、24、48、72h和7d断头取脑,采用TUNEL方法检测神经细胞凋亡,SP免疫组化方法观察额叶P~(53)蛋白的表达。结果 全脑缺血再灌注24h,可见少量TUNEL阳性细胞,再灌注48h可见较多TUNEL阳性细胞,72h出现大量TUNEL阳性细胞,7d明显减少。免疫组化染色:缺血组于再灌注24h可见少量P~(53)蛋白表达,48h达高峰,72h有所下降,7d明显下降,这种表达主要在细胞核内。结论 急性全脑缺血再灌注后的迟发性神经元坏死是以凋亡的方式发生的,全脑缺血再灌注后,额叶P~(53)蛋白表达增加,神经细胞凋亡和P~(53)蛋白的表达在一定时间内呈正相关。     

高龄大鼠全脑缺血再灌注后认知功能障碍与额叶神经细胞凋亡及P53蛋白表达的实验研究

目的 探讨高龄大鼠全脑缺血再灌注不同时间大鼠行为变化与额叶神经细胞凋亡及P^53蛋白表达的相关性。方法 采用四血管阻断方法建立SD高龄大鼠急性全脑缺血模型。实验第1部分为大鼠行为测定，第2部分为制造大鼠全脑缺血模型。并随机分为正常组、假手术组、手术组。缺血15min，分别于再灌注1、6、12、24、48、72h和7d断头取脑，采用TUNEL方法检测神经细胞凋亡。免疫组化方法观察额叶P^53蛋白的表达。结果 全脑缺血再灌注72h、7d学习记忆能力明显下降。TUNEL染色结果示。手术组于再灌注24h开始出现阳性细胞，72h时达高峰，7d时明显减少。免疫组化染色结果为，手术组于再灌注24h开始出现P^53蛋白表达，48h时达高峰。7d时明显下降。结论 急性全脑缺血再灌注使大鼠学习记忆功能受到损害，全脑缺血再灌注后的迟发性神经元坏死主要以凋亡方式，全脑缺血再灌注后额叶P^53蛋白表达增加。神经细胞凋亡和P^53蛋白的表达在一定时间内呈正相关，P^53蛋白的表达和神经细胞凋亡与认知功能呈负相关。     

川芎嗪、黄芪对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及Fos蛋白表达的影响

目的探讨川芎嗪、黄芪对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及Fos蛋白表达的影响.方法48只雄性SD大鼠,随机等分成4组,每组12只.A组:假手术组;B组:生理盐水对照组;C组:川芎嗪治疗组;D组:黄芪治疗组.采用TUNEL法及免疫组化法分别检测各组大鼠脑组织神经细胞凋亡及Fos蛋白的表达.结果与A组比较,B组大鼠神经细胞凋亡数目及Fos蛋白阳性细胞数目增多,Fos蛋白阳性细胞平均灰度值下降(P＜0.01);与B组比较,C组、D组大鼠神经细胞凋亡数目及Fos蛋白阳性细胞数目下降,Fos蛋白阳性细胞平均灰度值升高(P＜0.01).结论川芎嗪、黄芪均可能通过抑制脑缺血再灌注后Fos蛋白表达而减少神经细胞凋亡.     

吸氧预处理对大鼠局灶脑缺血神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax的影响

目的 观察吸氧预处理对大鼠局灶脑缺血再灌注后细胞凋亡及凋亡相关基因Bax、Bcl-2的关系,探讨吸氧预处理的脑保护作用.方法 采用线栓法阻塞大鼠大脑中动脉造成局灶脑缺血再灌注模型,用TUNEL染色标记神经细胞凋亡,免疫组化染色观察Bax,Bcl-2蛋白含量.结果 与模型组相比,吸氧预处理组半暗区的TUNEL阳性细胞数和Bax蛋白表达阳性细胞数明显下降,(P<0.05),Bcl-2蛋白表达细胞数明显上升(P<0.05).结论 吸氧预处理可通过抑制缺血再灌注后神经细胞凋亡和减少Bax的表达,增加Bcl-2蛋白的表达发挥脑保护作用.     

腺苷预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的脑保护作用

目的 观察腺苷预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的改善作用及脑保护机制.方法 线栓法建立大鼠局灶性脑缺血2 h后再灌注损伤模型;SD大鼠60只,随机分为假手术组(F组),缺血再灌注组(IR组),腺苷预处理组(AP组),每组20只;通过HE 染色在光镜下观察神经细胞损伤变化,免疫组化法检测Bax蛋白的阳性表达.结果 光镜下,假手术组(F组)神经细胞结构正常,腺苷预处理组(AP组)和缺血再灌注组(IR组)均有不同程度的缺血再灌注损伤,腺苷预处理组较缺血再灌注组损伤轻;假手术组Bax蛋白表达极弱,缺血再灌注组和腺苷预处理组在脑缺血再灌注后2 h接近缺血核心区出现Bax蛋白阳性表达,6 h后表达增多,24 h达到高峰,72 h开始减少.与假手术组相比,腺苷预处理组和缺血再灌注组Bax蛋白阳性细胞数显著增多(P＜0.05);与缺血再灌注组相比,腺苷预处理组Bax蛋白阳性细胞数显著减少(P＜0.05).结论 腺苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用,腺苷可通过下调Bax蛋白的表达发挥脑保护作用.     

自由基清除剂预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响

目的探讨自由基清除剂依达拉奉预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及其相关蛋白Bcl-2、Bax、热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。方法将45只雄性SD大鼠随机分为假手术组、对照组、依达拉奉预处理组,每组15只。采用线栓法制作大鼠缺血2h再灌注24h模型。预处理组大鼠建模前12h腹腔注射依达拉奉(3mg/kg),对照组给予等容量生理盐水。再灌注24h后断头取脑,应用免疫组织化学法检测Bcl-2、Bax、HSP70蛋白表达,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的原位缺口末端标记法检测凋亡细胞。结果依达拉奉预处理组和对照组大鼠缺血周围脑组织中凋亡细胞和Bcl-2、Bax及HSP70阳性细胞数比假手术组均明显增加(P<0.01);与对照组比较,其凋亡细胞和Bax阳性细胞数均明显减少(P<0.01),而Bcl-2和HSP70阳性细胞数明显增加(P<0.01)。结论细胞凋亡在缺血再灌注损伤中起着重要作用;依达拉奉可能通过上调Bcl-2、HSP70蛋白表达、下调Bax蛋白表达减轻大鼠脑缺血再灌注后的细胞凋亡,增加脑缺血再灌注损伤耐受性,从而起到神经保护作用。     

GM1对高血压大鼠脑缺血再灌注后DNA损伤修复的影响

目的探讨GM1对局灶性脑缺血再灌注后神经元凋亡作用的机制。方法运用双肾双夹法建立肾血管性高血压大鼠模型,采用线栓法制备高血压大鼠短暂性局灶性脑缺血再灌注模型,免疫组化法检测再灌注过程中鼠脑DNA损伤修复蛋白XR—CC1、TUNEL法检测凋亡。结果与假手术组相比,脑缺血再灌注3h至24h在缺血区皮质XRCC1表达出现显著减低（P〈0.05）;再灌注24h缺血区皮质神经细胞发生凋亡,神经细胞XRCC1的表达强度与凋亡呈负相关。GM1治疗后缺血区皮质XRCC1的表达显著升高,凋亡显著减少（P〈0．05）。结论GM1通过提高肾血管性高血压大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞XRCC1的表达,发挥了抗神经细胞凋亡的作用。     

3-硝基丙酸预处理对大鼠缺血-再灌注脑损伤保护作用的研究

目的 研究3-硝基丙酸(3-NPA)预处理对大鼠局灶性脑缺血脑梗死体积,脑缺血半暗带神经细胞凋亡的影响,探讨3-NPA预处理诱导脑缺血耐受的机制.方法 大鼠腹腔注射3-NPA,分别在24h和72h后制作大脑中动脉缺血-再灌注模型,采用TTC染色和TUNEL法,观察3-NPA预处理对缺血2h再灌注24h脑梗死体积、神经细胞凋亡的影响.结果 缺血2h再灌注24h,3-NPA预处理组脑梗死体变小,神经细胞凋亡减少,与对照组及假手术组比较有显著性差异.结论 3-NPA预处理可以诱导脑缺血耐受,抑制神经细胞凋亡可能是其机制之一.     

pHGF对脑缺血再灌注大鼠bc1-2、p53表达的影响

目的 探讨促肝细胞生长因子(pHGF)对脑缺血再灌注损伤神经元的抗凋亡作用及机制.方法 36只健康雄性Wistar大鼠,随机分为缺血对照组和pHGF治疗组,再随机分为再灌注6h、12h、24h组3个亚组.采用动脉线栓法建立大鼠脑缺血再灌注模型,于各观察时间点处死大鼠取脑组织制切片,应用TUNEL法和免疫组化法检测神经元凋亡及bc1-2、p53蛋白表达情况.结果 各观察时间点,pHGF治疗组凋亡细胞数及p53蛋白阳性细胞数较缺血对照组明显减少(P＜0.05),pHGF治疗组bcl-2蛋白阳性细胞数较缺血对照组明显增多(P＜0.01).结论 pHGF具有抑制脑缺血再灌注损伤神经元凋亡的作用,其作用机制与调节bc1-2、p53蛋白表达有关.     

大鼠局灶性脑缺血预处理的抗细胞凋亡作用机制的研究

目的研究大鼠短暂局灶性脑缺血预处理对再次脑缺血神经细胞凋亡的保护作用,及bcl-2、bax与脑缺血耐受的关系.方法用开颅方法阻断大鼠大脑中动脉(MCA)20分钟,3天后再次阻断6小时.观察大鼠脑梗死体积及组织病理学改变,采用TUNEL法观察神经细胞凋亡状况,采用免疫组织化学方法观察bcl-2、bax蛋白表达的改变.结果与假预处理组和缺血组相比,预处理后缺血组梗死灶体积明显减小(均P＜0.01),半影区凋亡细胞数明显减少(P＜0.01),bax蛋白表达下降(P＜0.05),bcl-2蛋白表达显著上升(P＜0.01).结论 20分钟局灶性脑缺血预处理能够通过bcl-2表达增加及bax表达下降对再次脑缺血神经细胞起保护作用.     

脑缺血耐受与细胞凋亡及p53、p21、Bax表达关系的实验研究

目的　探讨大鼠局灶性缺血预处理的脑保护作用与细胞凋亡及凋亡相关因子p5 3、p2 1和Bax的关系。方法　采用线栓法阻塞大鼠大脑中动脉造成脑缺血预处理和致死性缺血模型 ,图像分析测算相对梗死体积 ,使用TUNEL染色标记神经细胞凋亡 ,免疫组化染色观察p5 3、p2 1和Bax蛋白表达。结果　与致死缺血组比较 ,缺血预处理组梗死体积减少 4 6 % (P <0 0 5 ) ,半暗区TUNEL阳性细胞数和p5 3阳性细胞数均明显降低 (均P <0 0 5 ) ,p2 1和Bax阳性细胞数无显著变化 (均P >0 0 5 )。结论　缺血预处理可能通过抑制严重缺血后p5 3表达 ,减轻神经细胞凋亡 ,发挥脑保护作用。p2 1和Bax在脑缺血耐受形成中可能不起重要作用。     

缺血预处理后Fas蛋白表达与迟发性神经元凋亡的关系初步探讨

目的动态观察缺血预处理后大鼠大脑皮层和海马CA1区神经元凋亡与Fas蛋白表达变化情况,初步探讨缺血预处理后Fas蛋白表达与迟发性神经元凋亡的关系。方法四血管阻断法复制全脑缺血模型,动物随机分为非缺血对照组、预处理对照组、缺血预处理组和缺血组。采用尼氏和TUNEL染色法观察皮层及海马CA1区神经元存活数和凋亡细胞数,免疫组化方法检测Fas蛋白在缺血预处理后表达变化情况。结果缺血组缺血6h在皮质及海马CA1区Fas阳性表达细胞计数升高,12h达高峰;缺血预处理组缺血12h阳性细胞计数升高,24h达高峰。缺血组缺血6h出现凋亡细胞,48h凋亡细胞数达到高峰;缺血预处理组凋亡细胞数较缺血组明显减少。缺血组缺血7d神经元数明显减少,12周时神经元大量减少;缺血预处理组缺血7d时神经元数无明显变化,但12周时神经元同样大量减少。结论全脑缺血可能通过诱导Fas蛋白的表达增多,启动细胞凋亡,导致缺血后神经元凋亡的发生;缺血预处理虽可延缓缺血后神经元的凋亡,但无法提供真正的长时期的神经元保护作用,其有限的保护作用可能是通过延缓Fas蛋白的表达而减缓了神经元凋亡的进程。     

脑缺血预处理对沙鼠脑缺血再灌注损伤 p38MAPK活化的作用

目的 探讨脑缺血预处理对脑缺血后p38MAPK信号的影响.方法 蒙古沙鼠分成对照组、脑缺血再灌注组、脑缺血预处理组和抑制剂SB203580组.制备脑缺血及脑缺血预处理动物模型.免疫组织化学法和蛋白质印迹法检测海马区磷酸化p38MAPK的表达,TUNEL 法检测神经细胞凋亡,TTC染色测定脑梗死体积.结果 与对照组比较,脑缺血再灌注组磷酸化p38MAPK表达增高,凋亡神经细胞数量增加(P<0.05),磷酸化p38MAPK阳性细胞与TUNEL阳性细胞为同一神经元.与脑缺血再灌注组比较,脑缺血预处理组凋亡神经细胞下降、磷酸化p38MAPK表达较少、梗死面积缩小(P<0.05);抑制剂SB203580组磷酸化p38MAPK表达水平与脑缺血预处理组相似,但两组神经细胞凋亡数量及脑梗死体积比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 缺血预处理对脑缺血性损伤具有保护作用,其机制并非完全依赖p38MAPK信号活化.

Abstract：

Objective To study the effect of ischemic preconditioning on p38MAPK pathway after ischemia - reperfusion injury in gerbils. Method Gerbils were divided randomly into control group, ischemia - reperfusion group ( I/R ) , ischemia preconditioning group ( IP ) and inhibitor SB203580 group. Transient ischemia - reperfusion model and ischemia preconditioning model were performed. The expression levels of p38MAPK phosphorylation were detected by immunohistochemistry and Western blot, the neurons apoptosis were detected by TUNEL method and the infarction volume assessments were performed by TTC staining. Results Compared with control group, there were higher expression levels of p38MAPK phosphorylation,more apoptotic neurons in I/R group. The p38MAPK phosphorylation \positive cells and TUNEL positive cells were located in the same neurons. Compared with I/R group, there were lower expression levels of p38MAPK phosphorylation,fewer apoptotic neurons and smaller infarction volumes in IP group( P <0.05). The levels of p38MAPK phosphorylation in SB203580 group were similar as those in IP group( P > 0. 05 ) . However, the number of apoptotic neurons and infarction volumes were obviously changed ( P <0.05). Conclusions IP has protective effect from I/R damage in gerbils, which might be not only involved p38MAPK pathway.     

酸敏感离子通道2a对缺血预处理诱导大鼠海马缺血耐受的作用

目的探讨脑缺血时的组织病理学变化及酸敏感离子通道2a（ASIC2a）在缺血预处理诱导的脑缺血模型耐受中的作用。方法取成年雄性SD大鼠160只,随机分为假手术组、预缺血组、缺血组、缺血预处理组共4组。行焦油紫染色观察各组大鼠海马CAI区存活神经元密度,TUNEL染色观察大鼠海马CA1区神经元凋亡情况,RT—PCR和Western blotting检测ASIC2a在大鼠海马CAl区mRNA和蛋白表达情况。结果缺血预处理能够显著减少大鼠海马CA1区锥体神经元的死亡和凋亡,PC＋Isch组和Isch组相比具有显著性差异（P〈0．01）。全脑缺血能够上调ASIC2a在大鼠海马CA1区mRNA和蛋白表达,在24h达到高峰,而缺血预处理进一步上调ASIC2a表达,呈进行性上升,在24h和72h时相点,PC＋Isch组和Isch组相比具有显著性差异（P〈0．01）。结论在脑缺血耐受中,缺血预处理对第二次致死性缺血表现出保护作用。在这个过程中,大鼠海马CA1区ASIC2a基因和蛋白表达上调发挥了重要的保护作用。     

预缺血诱导大鼠CA1神经元中蛋白伴侣hsp70的表达并抑制蛋白聚集物的形成

目的 研究预缺血对蛋白伴侣hsp70表达和蛋白聚集物形成的影响,探讨其可能的脑保护机制.方法 采用大鼠双侧颈总动脉暂时夹闭法建立全脑缺血模型.大鼠分为3min缺血组,10min缺血组以及预缺血组.苏木素-伊红染色,光镜下随机计数分析预缺血后海马CA1区死亡神经元数量变化.免疫组织化学及激光扫描共聚焦显微镜法观察蛋白伴侣hsp70在CAI区神经元内的分布.差速离心分离细胞浆、细胞核及蛋白聚集物.蛋白印迹法检测不同缺血状态下海马CA1神经元内蛋白聚集物含量的变化,以及胞浆、胞核及蛋白聚集物内蛋白伴侣hsp70含量的变化.结果 组织学检查显示预缺血能够显著减少海马CA1区神经元死亡数量.预缺血诱导海马CA1区神经元内蛋白伴侣hsp70在再灌注后24h表达.预缺血处理后,海马CA1区神经元内蛋白聚集物显著减少.预缺血诱导的蛋白伴侣hsp70与再缺血形成的异常蛋白结合在一起并防止其聚集.结论 预缺血可能通过诱导蛋白伴侣hsp70的表达和抑制再缺血后蛋白聚集物的形成,减少再缺血引起的神经元死亡.     

线粒体通透性转换孔在缺血预处理脑保护中的作用及机制

目的观察线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)在缺血再灌注及缺血预处理脑保护中的作用。方法将体外培养8 d的海马神经元分为五组,正常对照组(A组),缺血再灌注组(B组),缺血预处理+缺血再灌注组(C组),苍术苷+缺血再灌注组(D组),缺血预处理+苍术苷+缺血再灌注组(E组)。使用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,罗丹明123染色流式细胞术检测线粒体膜电位,Western-blot检测Bcl-2,Bax的表达水平。结果与A组比较,其余四组线粒体膜电位均降低,神经元凋亡率升高(P<0.05);与B组比较,C组线粒体膜电位升高,神经元凋亡率升高,Bcl-2表达上调,Bax表达下调(P<0.05);与C组比较,E组粒体膜电位降低,神经元凋亡率升高,Bcl-2表达下调,Bax表达上调(P<0.05)。结论缺血预处理能有效减轻海马神经元缺血再灌注损伤,抑制缺血再灌注后神经细胞凋亡,其机制可能与抑制MPTP的开放有关。     

局灶性脑缺血大鼠预处理后CHOP mRNA及其蛋白的表达

目的观察缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注后C/EBP同源蛋白(C/EBP homology protein,CHOP)mRNA及其蛋白表达的影响。方法SD大鼠180只,随机分为假手术组(sham-operation group,SO)、脑缺血再灌注组(middle cerebral artery occlusion,MCAO)、脑缺血预处理组(brain ischemic preconditioning,BIP)3组,每组按照再缺血后12 h、1 d、2 d、3 d其4个时间点分为4个亚组。采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用原位杂交法和免疫印迹法(western blot)观察再缺血后各个时间点CHOP mRNA及其蛋白的表达变化,用流式细胞术检测神经细胞凋亡率。结果①MCAO组12 h CHOPmRNA表达达高峰(142.92±7.46,P<0.01),随再灌注时间延长其表达逐渐下降;BIP组缺血各时间点其表达水平均显著下降(12 h:157.7±8.37;24 h:167.54±8.99;2 d:178.16±9.25;3 d:186.85±9.82,P<0.05)。②MCAO组CHOP蛋白表达于缺血再灌注后12 h开始明显上升,24 h达高峰,2 d后表达开始减弱(1.674±0.136,P<0.01);BIP组较MCAO组CHOP表达明显降低(12 h:1.453±0.128;24 h:1.605±0.132;2 d:1.485±0.129;3 d:1.279±0.115,P<0.05,P<0.01)。③MCAO组12 h细胞凋亡发生率显著增加(34.6%±11.5%),1 d时达到高峰(48.2%±12.4%),以后时间点逐渐下降;BIP组各个时间点神经元凋亡发生率较MCAO组显著降低(12 h:25.3%±9.0%;24 h:36.4%±10.9%;2 d:30.8%±11.2%;3 d:22.5%±8.7%,P<0.05,P<0.01)。结论脑缺血预处理可能通过抑制CHOP表达发挥其神经保护作用。     

缺血预处理后海马CA1区反应性星形胶质细胞增生与迟发性神经元缺血耐受性的关系

目的 探讨缺血预处理后海马CA1区反应性星形胶质细胞增生与迟发性神经元缺血耐受性的关系。方法 实验动物被随机分为手术组、缺血组、预缺血组、预缺血后再缺血组。阴断沙土鼠双侧颈总动脉造成前脑缺血模型。采用细胞特异性抗原胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组化法标记星形胶质细胞。结果 预缺血后1－7天,海马CA1区GFAP阳性的星形胶质细胞数轻度增加,至28天时增生非常显著（P＜0．01）。预缺血后1－7天再缺血,海马CA1区存活正常神经元数逐渐下降,预缺血后28天再缺血又显著增加（P＜0．01）。结论 缺血预处理后,神经元可出现迟发性缺血耐受,反应性星形胶质细胞增生可能起了重要作用。