p21基因的saRNA表达质粒的构建及功能研究

目的构建可表达具有RNA激活功能的小激活RNA(saRNA)质粒表达载体,并对其激活前列腺癌细胞PC-3中p21WAF1/CIP1(p21)基因表达的功能进行相关研究。方法人工合成与p21基因启动子特定序列相应的DNA片段及同样长度的随机DNA序列,利用DNA重组技术将这些片段构建到真核小分子双链RNA(dsRNA)表达质粒pGenesil-1中,构建成能表达dsRNA片段的表达质粒载体(dsRNAp21-pGenesil-1)和随机对照dsRNA片段的表达质粒载体(dsRNACon-pGenesil-1)。采用脂质体介导方法,分别将dsRNAp21-pGenesil-1(实验组)、dsRNACon-pGenesil-1(随机对照组)及空白质粒pGenesil-1(空白对照组)转染到体外培养的PC-3细胞,通过荧光染色检测转染效率,采用RT-PCR和免疫组化技术检测各组细胞p21蛋白表达的差异。结果成功构建目的表达载体dsRNAp21-pGenesil-1及随机对照载体dsRNACon-pGenesil-1,将各组质粒转染到PC-3细胞后,实验组p21基因表达明显增强,而随机对照组和空白对照组无明显变化。结论本研究构建的dsRNA表达质粒载体能成功表达saRNA分子,并激活p21基因及蛋白的表达,为研究的激活效应提供有效工具。     

saRNA在转录水平激活人膀胱癌细胞p21WAF1/CIP1的表达研究

目的 探讨小激活RNA-dsP21-322上调人膀胱癌细胞系T24中抑癌基因p21WAF1/CIP1(p21)表达的效应.进一步分析dsP21-322是否还可上调p21前体mRNA的表达,以及增强RNA聚合酶Ⅱ蛋白与dsP21-322靶向的p21启动子区的联系.方法 合成靶向p21启动子区的小激活RNA序列dsP21-322及阴性对照(dsControl),并分别转染至T24细胞,RT-qPCR和Western Blot分别检测p21 mRNA、前体mRNA和蛋白表达的变化.ChIP检测RNA聚合酶Ⅱ蛋白与dsP21-322靶向的p21启动子富集的改变.结果 RT-qPCR和Western Blot结果显示,dsP21-322可以明显上调T24细胞系中p21成熟mRNA、前体mRNA及p21蛋白的表达,且与dsControl相比,差异均有统计学意义(P<0.001).此外,dsP21-322的转染可以明显增强RNA聚合酶Ⅱ蛋白与dsP21-322靶向的p21启动子区的联系.结论 dsP21-322上调抑癌基因p21表达是发生在转录水平的基因调控过程,这一特征的发现为后续RNA激活机制的研究提供了部分理论依据.     

小干扰RNA对胃癌细胞葡萄糖调节蛋白94表达的抑制作用

目的构建Grp94靶向RNA干扰质粒载体，观察其对人类胃癌细胞株SGC-7901 Grp94基因表达的抑制作用。方法从GenBank中选取人类Grp94基因序列，采用siRNA Target Designer-Version 1．51设计软件设计1对Grp94基因发卡寡核苷酸，序列符合siRNA表达载体siSTRIKE^TM U6的要求并与psiSTRIKE^TM质粒载体连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子U6的真核表达载体。采用Lipofectamne^TM 2000转染试剂进行转染，将重组质粒导入人类胃癌细胞株SGC-7901内，分别在转染前、转染后24、48和72h通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot及免疫荧光技术检测Grp94 mRNA及蛋白水平的表达情况。结果成功构建RNA干扰质粒载体，靶向Grp94干扰质粒载体命名为psiSTRIKE^TM／Grp94，将上述质粒转染到人类胃癌细胞株后，观察到psiSTRIKE^TM／Grp94能够明显下调Grp94 mRNA及蛋白水平的表达，并随着时间推移稳定存在。结论构建的RNA干扰真核表达载体psiSTRIKE^TM／Grp94能明显抑制Grp94 mRNA及蛋白的表达，提示通过降低胃癌细胞中Grp94的表达，可能抑制或辅助抑制胃癌细胞的生长的作用。     

p53对胃癌细胞BGC823中Survivin基因表达的影响

目的 探讨p53基因对胃癌细胞株BGC823中Survivin基因表达的影响及其作用机制。方法 应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot技术检测胃癌细胞株BGC823中Survivin和p53基因表达情况；利用质粒pcDNA3．0-rpS3转染该细胞株。应用实时聚合酶链反应（PCR）和Western blot检测细胞在培养后不同时间点Survivin mRNA和蛋白表达水平。结果 确认了胃癌细胞株BGC823中Survivin和突变型p53基因的表达。受野生型p53质粒转染的胃癌细胞在培养16和24h后，Survivin mRNA和蛋白质水平呈明显下降趋势。结论 野生型p53在转染胃癌细胞株BGC823后可显著抑制后者Survivin基因的转录和表达。     

人工合成小分子RNA对前列腺癌细胞周期及增殖的影响

目的 研究人工合成的dsP21-555对前列腺癌细胞株PC-3和LNCaP细胞周期和增殖的影响。方法 合成dsP21-555（实验组）和dsControl（阴性对照组）,分别转染至PC-3和LNCaP。使用Real-time PCR及Western blotting分别检测分析前列腺癌细胞转染后的p21mRNA及p21蛋白的表达情况。流式细胞术检测细胞周期分布,使用MTT实验及集落形成实验检测细胞的活力及增殖能力。结果 转染dsP21-555后PC-3和LNCaP细胞中的p21 mRNA水平分别上调至2.90倍(P<0.01)和2.05倍(P<0.01)。Western blotting实验结果符合这一趋势。流式细胞术检测显示,转染dsP21-555后,在S期和G2/M期的细胞比例下降,在G0/G1期的细胞比例则增加。MTT实验显示,与dsControl组相比,转染dsP21-555后,PC-3和LNCaP细胞的活力明显降低。集落形成实验显示,dsP21-555组的集落的数量较少,细胞增殖能力降低。结论 人工合成的dsP21-555能明显激活前列腺癌细胞中p21基因的表达,并显著抑制前列腺癌细胞周期的进展和增殖。     

p53~(mut)、p53~(wt)、p16基因转染对肺腺癌H1299细胞Samd4蛋白表达的影响

目的探讨外源性p53mut、p53wt和p16基因转染人肺癌细胞株H1299后对其Smad4蛋白表达的影响。方法运用PCR方法扩增p53mut、p53wt及p16基因,构建真核表达载体p IRES2-EGFP-p53mut、p IRES2-EGFP-p53wt及p IRES2-EGFP-p16,脂质体法单独或共转染H1299细胞。荧光显微镜下观察细胞中表达的带绿色荧光的增强型荧光蛋白(EGFP),使用RT-PCR验证质粒载体转染效果,使用Western blot检测转染后各组细胞Smad4蛋白表达水平的变化。结果转染72小时后在荧光显微镜下观察到被转染的H1299细胞发绿色荧光。经RT-PCR证实转染后的H1299细胞成功表达目的基因。Western blot法显示空载体组与空白对照组在Smad4蛋白表达上无明显差异(P0.05),p53mut组Smad4蛋白表达较空载体组下调(P0.05),而p53wt转染组或p53wt、p16联合转染组Smad4表达增强,且以后者的上调作用更为明显(P0.05)。结论 p53mut转染可抑制H1299细胞的Samd4蛋白表达,而单独转染p16或共转染p16、p53wt可使Smad4蛋白表达上调,且以后者的上调作用更为显著。p53mut的促癌作用及p53wt和p16的抑癌作用可能与TGF-β/Smad4相关信号通路有关。     

肾癌ACHN细胞HIF-1α基因siRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的采用RNA干扰方法,构建及筛选对肾透明细胞癌ACHN细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因有干扰沉默作用的真核表达质粒。方法 CoCl2缺氧诱导培养ACHN细胞高表达HIF-1α,设计并化学合成4条针对HIF-1α基因的小干扰RNA（siRNA）序列,构建相应真核表达质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2/3/4,经测序分析,质粒构建成功后,分别转染ACHN细胞后培养24h,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,采用荧光实时定量PCR（real time-PCR）和免疫印记杂交法（Western blot）分别检测HIF-1α的mRNA与蛋白表达水平。结果质粒构建后经测序显示与设计完全一致;荧光显微镜下观察到ACHN细胞表达绿色荧光蛋白,证实重组质粒已转入细胞,转染效率约为78%;实时定量PCR与Western blot结果显示,siRNA-1/2组HIF-1α的mRNA与蛋白表达较对照组均明显下降（P〈0.05）,质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2明显干扰抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达,其中以质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1效果最佳。结论本实验成功构建靶向HIF-1α基因的真核表达质粒,并筛选出能有效抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达的质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2,这为肾癌的基因治疗提供了新的方法和手段。     

重组人DNMT1真核表达质粒对胆管癌细胞DNMT1基因mRNA水平及细胞生长曲线的影响

目的 观察重组人DNMT1真核表达质粒转染对胆管癌细胞DNMT1基因mRNA表达水平和细胞生长曲线的影响。方法 将构建好的正义和反义DNMT1真核表达质粒用脂质体转染入人胆管癌细胞株QBC-939,然后用G418进行筛选,得到阳性克隆细胞株后,用半定量RT-PCR检测DNMT1基因的mRNA水平的变化,用MIT法观察细胞生长曲线。结果 正义DNMT1真核表达质粒能使QBC-939细胞中的DNMT1基因的mRNA水平增加,而反义DNMT1真核表达质粒则使其mRNA水平降低;正义质粒可使QBC-939细胞增殖速度加快,反义质粒使其增殖速度减慢。结论 重组人DNMT1真核表达质粒转染能影响胆管癌细胞DNMT1基因的mRNA表达水平和细胞生长曲线。     

RNAi表达载体对膀胱癌细胞Livin基因表达的抑制作用

目的观察RNA干扰（RNAi）表达载体对膀胱癌BIU-87细胞Livin基因的抑制作用。方法构建针对Livin基因的RNAi质粒表达载体，脂质体法转染膀胱癌BIU-87细胞株，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot检测其对Livin mRNA及蛋白表达的影响。结果构建的表达质粒在膀胱癌BIU-87细胞株中均抑制了Livin mRNA及蛋白表达。与空白载体组细胞作对照，前者产生的小干扰RNA（siRNA）在对Livin mRNA的抑制率24、48h分别为（81．28±9．21）％、（55．88±6．27）％，蛋白抑制率24h为（64．75±7．55）％。结论RNAi表达载体可以有效地抑制膀胱癌细胞Livin基因的表达。     

能稳定表达外源抑癌基因PTEN的胆管癌细胞系QBC939的建立

目的：为研究抑癌基因PTEN对胆管癌细胞生物学行为的影响，建立能稳定表达外源PTEN的胆管癌细胞系。方法：将野生型、突变型PTEN质粒和空载体质粒分别转化细菌，提取纯化后，脂质体介导法转染体外培养的胆管癌细胞系QBC939;嘌呤霉素筛选抗性克隆;Western blot 检测标签蛋白HA的表达;RT-PCR， Western blot和免疫细胞化学法分析目的基因PTEN的表达。结果：野生型、突变型PTEN和空载体转染细胞株均获得嘌呤霉素抗性;野生型和突变型PTEN转染细胞株均检测到ＨＡ的表达，而空载体转染细胞株和未转染细胞株均未检测到ＨＡ的表达;野生型及突变型PTEN转染细胞株中目的基因PTEN在mRNA和蛋白质表达水平上均较空载体转染细胞株和未转染细胞株增强。结论：成功构建了分别能稳定表达外源野生型PTEN，突变型PTEN或空载体pBP的胆管癌细胞系。     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。     

深圳市某两所小学流行性腮腺炎突发疫情的流行病学分析

目的：通过对深圳市某两所小学发生的流行性腮腺炎突发疫情的流行病学特点及差异性进行分析,为制定科学、高效的防控策略提供科学依据。方法2013年5～7月深圳市大鹏新区某两所小学爆发流行性腮腺炎,以学校为整体研究对象,分别标记为学校A（24个班,学生1210例）和学校B（27个班,学生1274例）,对比两所小学的疫情流行病学差异性。结果分析发现,学校A流行性腮腺炎发病率为4.30%,发病班级所占比54.17%,均较学校B1.73%和29.63%高,对比差异有统计学意义（P＜0.05）;分析显示学校A学生出现疫病平均年龄为（11.2±1.1）岁,较学校B（9.34±1.0）岁,对比差异明显（P＜0.05）;且两组疫病患儿在接种疫苗率对比上差异无统计学意义（P＞0.05）;但疫情发生时,学校B疫苗紧急接种率明显高于学校A,对比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论小学作为流行性腮腺炎爆发的主要场所之一,疫病爆发高峰季节前,针对易感染人群给予相应的疫苗接种等预防控制措施,同时加强流行性腮腺炎的监测,对于降低感染人群数量,减轻、遏制疫情有着积极的意义,值得相关防控部门重视。     

Frequency of complications of manipulation of the spine

Summary A survey of all members of the Swiss Medical Association of Manual Medicine was undertaken for the year 1989. Informative data were given by 425 respondents on the frequency of complications of manipulation as related to the spine. The number of thoraco-lumbar manipulations during 1989 (225 working days) was 805 for each respondent, and the number manipulations of the cervical spine 354. Thus, the total number of thoraco-lumbar manipulations was 342 125, and the total number of cervical manipulations was 150 450. The overall incidence of side-effects of transient complications due to cervical spine manipulation such as disturbance of consciousness or radicular signs was 1: 16716. Seventeen patients (ratio 1: 20 125) after manipulation of the lumbar spine presented, in addition to increased pain, a transient sensorimotor deficit with precise radicular distribution. Nine of the 17 patients (ratio 1: 38013) developed a progressive radicular syndrome with sensorimotor defict and radiologically verified disc herniation and had to be referred for surgery. Side effects and complications of cervical and lumbar spine manipulation are rare. Taking in to account the yearly number of manipulations performed by a single physician in Switzerland and the rate of complications, it can be calculated that a physician practicing manual medicine will encoutner one complication due to manipulation of the cervical spine in 47 years and one complication due to lumbar spine manipulation in 38 years of practice. However, it is important that a careful clinical assessment is carried out to avoid complications due to manipulation carried out on the basis of inappropriate indications. Furthermore, the decision as to which technique is indicated for any particular functional disorder of the spine should be made on the basis of rational criteria resting on a knowledge of clinical biomechanics, functional anatomy and neurophysiology. The authors recommend a prospective morbidity study to be carried out among physicians, chiropractors, osteopaths and physiotherapists, taking into account the different indications and therapeutic techniques in relation to complications.     

Oddi括约肌肌电活动实验模型的建立

目的建立研究Oddi括约肌肌电活动的动物模型和实验方法。方法将双极金属钩状电极通过浆膜层置入Oddi括约肌，记录不同条件干预下家兔的Oddi括约肌肌电活动信号，调整电生理实验参数并经放大、滤波及计算机处理后，对其大小、波形、幅度进行分析。结果不同条件干预下的家兔Oddi括约肌的肌电活动在波形、频率、幅度等方面均有明显的不同，具有明显的规律性。重复实验可得到相似的结果。结论使用双极金属钩状电极配以合理的电生理实验参数调整可以稳定地采集到在体的家兔Oddi括约肌肌电活动信号。这为今后广泛、深入地研究Oddi括约肌肌电活动搭建了一个技术平台。     

骨盆骨折的治疗进展

对于骨盆骨折的治疗 ,传统方法以卧硬板床 ,股骨髁上持续骨牵引 ,骨盆兜等保守治疗为主 ,常常引起下肢不等长 ,骶髋痛 ,步态失常等而严重影响生活质量 ,同时长期卧床易引发肺部感染、褥疮、应激性溃疡、泌尿系统结石等并发症而危及生命。下面就骨盆骨折的治疗进展作一综述。1     

Pathogenesis of carcinoma of the papilla of Vater

Most adenomas and carcinomas of the small intestine and extrahepatic bile ducts arise in the region of the papilla of Vater. In familial adenomatous polyposis (FAP) it is the main location for carcinomas after proctocolectomy. In many cases symptoms due to stenosis lead to diagnosis at an early tumor stage. In about 80%, curative intended resection is possible. Operability is the most relevant prognostic factor. Most ampullary carcinomas resp. carcinomas of the papilla of Vater develop from adenomatous or flat dysplastic precursor lesions. They can be sited in the ampulloduodenal part of the papilla of Vater, which is lined by intestinal mucosa. They also can develop in deeper parts of the ampulla, which are lined by pancreaticobiliary duct mucosa. Intestinal-type adenocarcinoma and pancreaticobiliary-type adenocarcinoma represent the main histological types of ampullary carcinoma. Furthermore, there exist unusual types and undifferentiated carcinomas. Many carcinomas of intestinal type express the immunohistochemical marker profile of intestinal mucosa (keratin 7–, keratin 20+, MUC2+). Carcinomas of pancreaticobiliary type usually show the immunohistochemical profile of pancreaticobiliary duct mucosa (keratin 7+, keratin 20–, MUC2–). Even poorly differentiated carcinomas, as well as unusual histological types, may conserve the marker profile of the mucosa they developed from. These findings underline the concept of histogenetically different carcinomas of the papilla of Vater which develop either from intestinal- or from pancreaticobiliary-type mucosa of the papilla of Vater. Molecular alterations in ampullary carcinomas are similar to those of colorectal as well as pancreatic carcinomas, although they appear at different frequencies. In future studies, molecular alterations in ampullary carcinomas should be correlated closely with the different histologic tumor types. Consequently, the histologic classification should reflect the histogenesis of ampullary tumors from the two different types of papillary mucosa.     

主动脉窦瘤破裂外科治疗的临床研究

目的　探讨主动脉窦瘤破裂局部病理改变及其合并主动脉瓣关闭不全的手术方法。方法　 3 6例主动脉窦瘤破裂 (RASV)合并主动脉瓣关闭不全 (AI) 15例、室间隔缺损 (VSD) 2 6例。补片修补 3 5例 ,其中合并VSD的均以一片法修补 ,合并AI的主动脉瓣置换 (AVR) 6例 ,主动脉瓣成形 4例。手术取材作病理检查 5例。结果　本组 3 6例中手术死亡 2例 ( 5 .6% )。存活的 3 4例病人均经门诊复查或通信随访 0 .3～ 18年 ,其中 2例死亡。病理检查见RASV合并VSD的瘤壁为纤维素样坏死或玻璃样变性。结论　主动脉窦壁纤维素样或玻璃样变性可能是其形成的病理基础。合并主动脉瓣关闭不全时应探查其病变程度 ,酌情一期矫正 ,瓣膜损伤明显时宜行主动脉瓣置换 ,对主动脉瓣环细小的病例 ,可借修补VSD和RASV的补片扩大主动脉瓣环。     

鼻尖、鼻翼缺损修复方法的探讨

１９５７年以来共收治鼻尖、鼻翼缺损１１９例，据情分别采用以下四种方法修复：①全层皮片移植２７例；②游离耳廓复合组织片移植３６例；③鼻唇沟皮瓣移转１２例；④上臂内侧皮管移植４４例，效果较为满意。我们在文章中就选用的原则、手术方法及注意事项等进行了探讨     

食管穿孔83例分析

８３例不同原因引起的食管穿孔，保守治疗５７例；手术２６例，行单纯食管修补术２０例、开胸行纵隔和／或胸腔引流２例、切除贲门肿物行胃食管吻合１例、颈部食管外置２例（其中１例并行二期结肠代食管手术）、１例开胸取异物形成食管瘘后，行二期修补瘘术。全组死亡８例，其中死于纵隔胸腔感染和主动脉破裂出血各４例。总治愈率８５％。并指出异物假牙造成食管穿孔的重要性，对严重的腐蚀性食管灼伤应早期行食管镜检，并针对食管穿孔部位、种类、间隔期、纵隔与胸腔的感染程度及病人具体情况采取相应的治疗措施。     

手部深度烧伤的临床治疗分析

目的 总结手部深度烧伤的临床治疗经验. 方法 46例54只深度烧伤手,其中深Ⅱ度烧伤30例33只手,Ⅲ度烧伤16例21只手.根据伤情不同,早期选择不同手术方式修复创面,术后早期进行功能锻炼. 结果 54只手的修复方式:中厚皮片移植33只手,异体脱细胞真皮与自体薄皮片复合移植12只手,腹部带蒂皮瓣1只手,前臂骨问背动脉逆行皮瓣3只手,股前外侧皮瓣5只手.治疗后,51只手移植皮片、皮瓣均成活,仅3只手移植皮片后有局灶性坏死,创面得到有效覆盖.按关节活动范围( range of motion,ROM)评定,本组优31只手(57.4％),良17只手(31.5％),中4只手(7.4％),差2只手(3.7％). 结论 手部深度烧伤后,选择合适术式,早期手术修复创面及功能锻炼,可取得很好的疗效.