直肠癌P27基因表达及血清转化生长因子β1水平的变化

目的 探讨直肠癌中p27的表达和血清转化生长因子β1(TGF-β1)的水平。以及TGF-β1对p27的调控关系。方法 对37例直肠癌、22例直肠腺瘤和19例正常对照者用免疫组化二步法检测其p27的表达情况。用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清TGF-β1水平。结果 p27在正常直肠组织和直肠腺瘤组织中呈高表达。其表达阳性率分别为89．47％和90．91％，阳性表达定位于细胞核；直肠癌组织中p27表达阳性率降为64．87％，与前两者比较，差异有统计学意义(P=0．025)，且伴有p27细胞浆表达者占45．83％。血清TGF-β1在正常对照组的表达阳性率为21．05％，直肠腺瘤组为27．27％，而直肠癌组则升至51．35％(P=0．045)。p27的表达与直肠癌的分化程度、淋巴结转移和浸润深度有关；血清TGF-β1表达水平与直肠癌的淋巴结转移、浸润深度和CEA水平有关。血清TGF-β1阴性组中p27表达阳性率为88．89％，血清TGF-β1阳性组中p27表达阳性率降为42．11％。差异有显著性意义(Mantel-Haenszel χ^2=6．755，P=0．009)。结论 p27对于判断直肠癌的恶性程度和预后有指导作用，血清TGF-β1可作为直肠癌的辅助诊断指标，TGF-β1可下调直肠癌中p27的蛋白表达。     

TGF-β1通过miR-21d-5p调控BMP7表达诱导肾小管上皮细胞增殖及迁移

目的:探讨转化生长因子-β₁(TGF-β₁)可能通过微小RNA-21d-5p(miR-21d-5p)对骨形态发生蛋白7(BMP7)的调控,从而对肾小管上皮细胞的增殖以及迁移的影响及可能机制。方法:观察TGF-β₁处理的肾小管上皮细胞HK-2并检测miR-21d-5p的表达,在HK-2细胞中分组转染miR-21d-5p或anti-miR-21d-5p,再使用TGF-β₁处理,观察过度表达或抑制表达miR-21d-5p对TGF-β₁诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响。分析TGF-β₁、miR-21d-5p与BMP7的靶向关系。共转染miR-21d-5p和pcDNA3.1-BMP7,或anti-miR-21d-5p和si-BMP7,使用TGF-β₁处理,评估TGF-β₁、miR-21d-5p与BMP7的在肾小管上皮细胞的增殖以及迁移的相互关系。结果:TGF-β₁处理HK-2细胞后,miR-2...     

蛋白酶体抑制剂对肾间质成纤维细胞增殖、凋亡及其相关蛋白的影响

目的 探讨蛋白酶体抑制剂MG-132对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导下的大鼠肾间质成纤维细胞（NRK-49F）增殖、凋亡及其相关蛋白的影响。 方法 用5 μg/L的TGF-β1作用于NRK-49F。不同浓度（0~5 μmol/L）MG-132预处理NRK-49F细胞后,MTT法检测细胞增殖;应用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率;DNA凝胶电泳法观察细胞的凋亡情况;Western印迹检测p53、p27、p21、caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的变化。 结果 TGF-β1（5 μg/L）可促进NRK-49F细胞增殖,而MG-132（0.25~5 μmol/L）呈剂量依赖性地抑制这种效应,使细胞生长停滞在G1期。TGF-β1（5 μg/L）单独不能诱导NRK-49F的凋亡（3.880%±0.365%比4.723%±1.582%）,而MG-132（0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、2.50 μmol/L）预处理可呈剂量依赖性地促进细胞凋亡（调亡率分别为8.8％、18.7％、22.8％、31.3％、37.7％、38.9％）。MG-132（2.5 μmol/L）+TGF-β1组及 MG-132（2.5 μmol/L）组在DNA电泳中呈典型的梯状条带现象。Western印迹结果显示,MG-132可剂量依赖性地激活TGF-β1诱导的细胞周期及凋亡相关蛋白p53蛋白表达,促进caspase-3的活性片段产生,Bcl-2表达下调,并能使Bax和p21表达上调,但对p27没有明显的影响。 结论 MG-132可抑制TGF-β1诱导的肾间质成纤维细胞增殖,并促其凋亡。该作用可能与MG-132对细胞周期及凋亡相关蛋白p53、p21、caspase-3、Bcl-2和Bax的调节有关,提示泛素蛋白酶体抑制剂可能成为将来防治肾间质纤维化的一个潜在的治疗手段。     

TGF—β1基因修饰诱导脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

[目的]本研究通过选择对软骨细胞ECM合成具有促进作用的TGF-β1转染脂肪干细胞(ADSCs),观察转染后目的基因的稳定表达和对软骨细胞外基质(ECM)的两种重要组分:Ⅱ型胶原(type Ⅱ collage,ColⅡ)和aggrecan的合成,为构建新型的组织工程软骨提供实验依据.[方法]TGF-β1基因转染脂肪干细胞及阳性细胞克隆株的筛选;RT-PCR检测TGF-β1、纤连蛋白(fibronectin,FiN)、ColⅡ、Aggrecan的表达;Western-blot检测TGF-β1.[结果]RT-PCR结果显示:实验组(TGF-β1稳定转染组)的TGF-β1、FN、Col Ⅱ、Aggrecan的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01);Western blot检测实验组(TGF-β1稳定转染组)TGF-β1蛋白的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01).[结论]成功分离培养脂肪干细胞;以脂质体介导法将TGF-β1目的基因成功转染ADSCs,转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多,表明转染TGF-β1基因可以促使ADSCs向软骨细胞方向分化,从而为软骨组织工程提供新的思路和方法.     

LncRNA MEG3调控miR-133a-3p/TGF-β1/Smads轴促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制

目的 探究LncRNA MEG3调控miR-133a-3p/TGF-β1/Smads信号轴对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell, hBMSC)成骨分化中的影响。方法 通过构建慢病毒载体及慢病毒包装,将含有目的基因的慢病毒感染细胞。将hBMSC分为Control组、NC组、MEG3、sh-MEG3、MEG3+miR-133a-3p sponge及MEG3+miR-133a-3p组,成骨诱导后,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色和茜素红染色检测ALP活性及钙盐沉积,qRT-PCR检测各组细胞中MEG3、miR-133a-3p、TGF-β1、TGF-βR1、smad2、smad3、smad4、Runx2及OPN mRNA表达水平,Western blot检测TGF-β1、TGF-βR1、smad2、smad3、smad4、Runx2及OPN蛋白表达量。结果 与NC组比较,MEG3组的ALP活性及茜素红钙盐沉积明显减弱,MEG3 mRNA上调,miR-133a-3p mRNA表达显著升高,TG...     

TGF-β1对大鼠腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p67phox表达的影响及黄芪的干预作用

目的:探讨TGF-β1对大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs)活性氧(ROS)和NADPH氧化酶亚基p67phox表达的影响及黄芪注射液(AGI)对其的干预作用。方法:体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞至第二代,静止24h后,随机分为:正常对照组(A组),AGI(2g/ml)组(B组),TGF-β1(10ng/ml)组(C组),TGF-β1+AGI(2g/ml)组(D组,AGI预处理1h)。用荧光染料(DCF)及激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧(ROS)。RT-PCR检测NADPH氧化酶亚基p67phox mRNA的表达;Western印迹检测p67phox的蛋白表达。结果:TGF-β1可显著增加大鼠腹膜间皮细胞ROS产生,刺激20min后,ROS的表达较对照组显著上升(P<0.05)。AGI可显著抑制TGF-β1刺激后ROS的产生(P<0.05);大鼠腹膜间皮细胞经TGF-β1刺激后,NADPH氧化酶亚基p67phox mRNA和蛋白的表达均上升,AGI可抑制TGF-β1诱导的p67phox mRNA和蛋白的表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TGF-β1可诱导大鼠腹膜间皮细胞产生的ROS增加、NADPH氧化酶亚基p67phox表达上调;AGI可抑制NADPH氧化酶的表达和活性ROS的产生,从而为AGI防治腹膜纤维化提供了理论依据。     

转化生长因子β1对人腹膜间皮细胞结缔组织生长因子的影响

目的 观察转化生长因子(TGF)β1对人腹膜间皮细胞(HPMCs)结缔组织生长因子(CTGF)的mRNA和蛋白表达影响并探讨其可能的机制。方法 原代培养HPMCs，用5ng／ml TGF-β1刺激第3代细胞，采用免疫组织化学染色、Western印迹、ELISA和RT-PCR等方法，观察CTGF的mRNA和蛋白表达、纤连蛋白(FN)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)的mRNA和蛋白表达，细胞内磷酸化Smad2／3(p-Smad2／3)的蛋白表达以及在细胞内的迁移。结果 (1)刺激组CTGF的mRNA表达与对照组比均显著增加，其中48h为峰值；对照组细胞内仅有少量CTGF的蛋白表达，在TGF-β1刺激后24h表达明显增加，48h达峰值。(2)刺激组FN和ColⅠ的mRNA表达与对照组比均呈时间依赖性显著增加，上清液FN和细胞内ColⅠ的蛋白表达与对照组比也呈时间依赖性显著增加。(3)对照组细胞内几乎不表达p-Smad2／3(阳性细胞率3％)，在刺激后15min表达增加(29％)，细胞着色主要分散在胞质中；1h增加最明显(84％)，细胞着色加深且集中在胞核及周边；2h明显回落(37％)，细胞着色转淡并又分散至胞质中。结论TGF-β1在致腹膜纤维化过程中诱导了HPMCs内CTGF的转录和蛋白表达，可能与TGF-β1激活了HPMcs内Smad信号通路有关。     

周期性张力对骨髓间充质干细胞分化的血管平滑肌细胞的表型调节

目的 探讨周期性张力对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导分化的血管平滑肌细胞(VSMCs)的表型的调节机制.方法 原代全骨髓法培养大鼠BMSCs,流式细胞术鉴定细胞.作成脂、成骨、成平滑肌细胞方向诱导,验证BMSCs的多向分化潜能.将细胞分为4组:A组用含10 μg/L转化生长因子-β1(TGF-β1)的完全培养基培养,B组用幅度10％、频率1 Hz周期性张力诱导,C组采用TGF-β1+周期性张力联合诱导,D组用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基培养作对照.3d后观察诱导后的细胞形态,并行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肌动蛋白(α-actin)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)、钙调节蛋白1(calponin1)、钙调节蛋白3(calponin3)的mRNA表达水平,Western blot观察细胞内α-actin、SM-MHC、calponin1、calponin3蛋白表达水平.结果 经流式细胞术鉴定,所培养细胞为BMSCs.诱导3d后,A、B、C3组的VSMC标志物均较D组明显升高,以SM-MHC和calponin3增加为主.A组(0.919 2±0.028 1)较B组(0.823 6±0.024 6)的SM-MHC蛋白表达水平高,但低于C组(1.043 1±0.090 7),其差异均有统计学意义(P＜0.05).C组中calponin3 mRNA表达量比蛋白表达量变化更明显,而calponin1蛋白表达量和mRNA表达量同步增高.结论 周期性张力能够诱导BMSCs分化为VSMCs,对分化的VSMCs的表型调节还需要细胞因子的参与.     

丹酚酸B对马兜铃酸诱导的HK-2细胞TGF-β1与p38MAPK表达的影响

目的：观察丹酚酸B对马兜铃酸（AA）诱导的肾小管上皮细胞（HK-2）TGF-β1与p38 MAPK表达的影响。方法：HK-2细胞传代培养并同步后,培养液中加入不同药物,分为AA诱导组：AA20μg/ml;丹酚酸B干预组：以AA20μg/ml诱导,并分别加入不同浓度丹酚酸B（5、10、20、40μg/ml）;对照组（不加任何药物）。培养24 h、48 h、72 h后,实时荧光定量PCR检测细胞TGF-β1mRNA表达,ELISA检测TGF-β1蛋白合成,免疫印迹检测MKK、p38 MAPK蛋白表达。结果：AA诱导24 h、48 h后,细胞TGF-β1 mRNA及蛋白表达增加,MKK、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）蛋白合成增加。丹酚酸B干预后,可降低TGF-β1 mRNA及蛋白的过表达,MKK、p-p38 MAPK蛋白的合成有下降趋势,在干预48 h后,对TGF-β1的抑制作用随丹酚酸B剂量增加而作用明显。结论：丹酚酸B可能通过下调TGF-β1的表达,部分抑制了p-p38 MAPK的过表达,从而可能减轻马兜铃酸诱导的HK-2细胞凋亡、转分化及炎细胞浸润等病变。     

丹参抑制骨骼肌肌源性干细胞合成胶原蛋白的机制研究

目的 研究丹参抑制体外骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)合成胶原纤维的机制.方法 采用差速贴壁法分离大鼠骨骼肌MDSCs,利用TGF-β1诱导MDSCs表达胶原纤维,观察丹参对细胞的作用.将体外培养的细胞分为四组,A组:对照组；B组:150 mg/L丹参组；C组:10 μg/L TGF-β1组；D组:10μg/LTGF-β1+ 150 mg/L丹参组.利用免疫细胞化学方法,RT-PCR及Western Blot检测MDSCs中Smad3和COLⅠ表达.结果 在体外,TGF-β1能加强Smad3表达,诱导MDSCs表达胶原蛋白,丹参能拮抗TGF-β1的作用,降低细胞Smad3和COL Ⅰ的表达和合成水平.结论 丹参可以抑制MDSCs表达和合成细胞外基质,其机制是通过干预TGF-β1-Smad3信号通路,抑制MDSCs分化,从而降低细胞合成和分泌胶原纤维.     

三七总皂苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞表型转分化的影响

目的:探讨三七总皂苷(PNS)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化的影响.方法:采用流式细胞仪(FCM)结合免疫荧光法(IF)检测PNS对TGF-β1诱导的HK-2细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性细胞百分率的影响;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测PNS对TGF-β1诱导的HK-2细胞α-SMA信使核糖核酸(mRNA)表达.结果:流式细胞仪(FCM)结合免疫荧光法(IF)示:PNS 200～800 mg/L可使TGF-β1诱导的HK-2细胞增加的α-SMA阳性细胞百分率回降;RT-PCR示:PNS 200～800 mg/L剂量和时间依赖性地使TGF-β1诱导的HK-2细胞增加的α-SMA mRNA的基因表达回降.结论:PNS可通过抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞表型转分化,从而参与延缓肾间质纤维化的进程.     

TGF-β1诱导人肝癌细胞系凋亡信号转导机理的研究

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肝癌细胞系凋亡及其与p53基因及Smad4的关系。方法选用3种含有不同p53基因状态的人肝癌细胞系,均分为TGF-β1诱导组(实验组)和对照组;应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)对TGF-β1诱导的肝癌细胞的凋亡进行定量检测;另外,应用Lipofectamine2000把含有Smad4结合元件和荧光素酶基因的TGF-β1可诱导的荧光素酶报告质粒对细胞进行转染,再经TGF-β1作用,分别检测其相对荧光素酶活性。结果在应用TUNEL检测的3个细胞系中,TGF-β1能诱导HepG2细胞(野生型p53)凋亡,其细胞凋亡率实验组明显高于对照组(P<0.05);而Huh-7(突变型p53)和Hep3B细胞(缺失型p53)凋亡细胞较少,其细胞凋亡率实验组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。荧光素酶检测提示,HepG2细胞的Smad4表达活性实验组明显高于对照组(P<0.05);而Huh-7和Hep3B细胞的Smad4表达较低,实验组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论HepG2细胞系比Huh-7和Hep3B细胞系更易发生TGF-β1诱导的凋亡,Smad4是TGF-β1信号转导途径的主要调控因子之一。     

小鼠单侧输尿管梗阻诱导肾脏纤维化模型中Cadherin6的表达变化

目的研究钙黏蛋白6(cadherin6,CDH6)在肾脏纤维化中表达的变化。方法建立单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型,术后21天收获肾脏组织,HE染色观察肾间质纤维化程度,RT-q PCR检测肾组织FSP-1、TGF-β1、CDH6 m RNA表达量,免疫组化染色检测肾组织FSP-1、CDH6蛋白表达量;TGF-β1刺激人肾小管上皮细胞HK-2,RT-q PCR及Western Blot分别检测FN1、PAI-1、CDH6 m RNA表达量及CDH6蛋白表达量。结果 HE染色显示UUO组小鼠肾脏出现肾小管萎缩、大量基质沉积,与Sham组相比,UUO组小鼠肾脏组织FSP-1、TGF-β1、CDH6 m RNA表达量及FSP-1、CDH6蛋白表达量均上调;细胞实验结果显示,与空白对照组相比,TGF-β1诱导的HK-2细胞形态向成纤维细胞转变,FN1、PAI-1m RNA表达水平上调,CDH6 m RNA及蛋白表达水平上调。结论 TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞CDH6及纤维化相关因子表达上调,伴随上皮细胞向间质表型转化,可能参与单侧输尿管梗阻诱导的小鼠肾脏纤维化的发展。     

苦参碱调控Snail2表达水平抑制转化生长因子β1诱导的人腹膜间皮细胞上皮间充质转分化

目的 研究苦参碱对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导腹膜间皮细胞上皮间充质转分化(EMT)后转录因子Snail2的影响.方法 采用TGF-β1刺激人腹膜间皮细胞并同时予不同浓度苦参碱干预处理,实验分为空白对照组、TGF-β1(5 ng/ml)诱导组、TGF-β1+0.4 mg/ml苦参碱干预组、TGF-β1+0.6 mg/ml苦参碱干预组、TGF-β1+0.8 mg/ml苦参碱干预组和TGF-β1+1.0 mg/ml苦参碱干预组.实时荧光定量PCR和Western印迹检测Snail2、上皮标志分子E钙黏蛋白(E-cadherin)和间质标志分子α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)、胶原Ⅲ(ColⅢ)的表达,Western印迹检测Smad2、Smad3和细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的蛋白磷酸化水平.结果 TGF-β1(5 ng/ml)刺激能上调人腹膜间皮细胞Snail2、α-SMA、FN和ColⅢmRNA和蛋白的表达水平,上调Smad2、Smad3和ERK1/2的蛋白磷酸化水平,下调E-cadherinmRNA和蛋白的表达水平;苦参碱(0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml)干预处理后能下调Snail2和α-SMA、FN和ColⅢmRNA和蛋白的表达水平以及ERK1/2的蛋白磷酸化水平,上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平.结论 TGF-β1能诱导人腹膜间皮细胞EMT,苦参碱可能通过ERK1/2信号通路下调Snail2的表达水平来抑制TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞EMT.     

乙醛脱氢酶1A1表达与乳腺癌淋巴结转移及预后关系研究

目的:研究乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase,ALDH1)亚型ALDH1A1在乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌淋巴结转移和临床预后的关系。方法:采用免疫组化方法检测72例原发性乳腺癌组织中ALDH1A1的表达,分析其表达与乳腺癌病人淋巴结转移、肿瘤分化、TNM分期及病人总生存期等临床因素间的关系。结果:72例乳腺癌病人中,淋巴结转移组(n=37)ALDH1A1阳性表达21例,占56.8%;非淋巴结转移组(n=35)ALDH1A1阳性表达8例,占22.9%,两组具有统计学差异(P<0.01)。ALDH1A1在伴淋巴结转移乳腺癌病人的表达显著高于不伴淋巴结转移者(P0.05)。Kaplan-Meier生存分析表明,ALDH1A1高表达组病人的总生存期、无病生存期、5年生存率和5年无病生存率均显著低于ALDH1A1低表达组,两组具有统计学差异(P<0.05)。单因素及多因素统计分析显示,ALDH1A1表达、淋巴结转移和TNM分期是与乳腺癌预后相关的重要独立因素,ALDH1A1高表达组病人预后显著差于ALDH1A1低表达组(P<0.05)。结论:乳腺癌ALDH1A1表达与淋巴结转移及预后显著相关,可作为预测乳腺癌淋巴结转移以及判断病人临床预后的重要指标。     

TGF-β1、dNCPs及TGF-β1/dNCPs复合物对组织工程牙髓形成促进作用的研究

目的研究转化生长因子(TGF-β1)、牙本质非胶原蛋白(dNCPs)及TGF-β1/ dNCPs复合物对组织工程牙髓形成的促进作用. 方法使用Ⅰ型胶原及牙本质粉构建牙髓细胞的三维培养模型,按不同分组分别在组织工程牙髓中加入TGF-β1、dNCPs及TGF-β1/ dNCPs复合物;对照组中不加入以上物质.培养3、6和14天,在不同时间点行HE染色,观察细胞的形态变化.牙本质涎蛋白(DSP)免疫组织化学观察牙髓细胞向成牙本质细胞的诱导. 结果胶原可形成凝胶网状结构,牙髓细胞的生长状况与体内牙髓细胞相似.加入TGF-β1和dNCPs后,培养第6天部分牙髓细胞开始出现成牙本质样细胞的一些特性,出现单侧细胞突起;培养第14天,牙本质粉区域附近细胞呈高柱状平行排列,形成类似体内的牙本质牙髓复合物.免疫组织化学染色可见部分细胞出现DSP的表达,其中TGF-β1组阳性细胞最多,复合物组次之,dNCPs组最少;而对照组未发现DSP的表达. 结论 TGF-β1和dNCPs可不同程度地刺激牙髓细胞向成牙本质样细胞转化,促进组织工程牙髓的形成.     

大鼠肝星状细胞TGF-β3/TGF-β1mRNA比值与TGF-β1、MMP-9、TIMP-1表达的关系

目的 探讨大鼠肝星状细胞(HSC-T6)中转化生长因子-β3(TGF-β3)和转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA比值变化与TGF-β1、MMP-9、TIMP-1表达的关系.方法 构建质粒pcDNA 3.1(+)-TGF-β3和pcDNA 3.1(+)-TGF-β1.将pcDNA 3.1(+)-TGF-1β1转染HSC-T6细胞株,经筛选建立高表达TGF-β1的HSC-T6细胞阳性克隆.pcDNA 3.1(+)-TGF-β3转染该阳性克隆,48 h后荧光定量PCR法和Western blot法分别检测TGF-β3、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1 mRNA和蛋白的变化.结果 空白组、对照组、阳性克隆组及TGF-β3干预组中,TGF-β3/TGF-β1mRNA比值分别为0.286±0.070、0.874±0.141、0.448±0.327和1.277±0.244;阳性克隆组与空白组和对照组相比,TGF-β1和TIMP-1的mRNA及蛋白表达明显增高(P<0.05),MMP-9的mRNA及蛋白表达明显减少(P<0.05);TGF-β3干预组与阳性克隆组相比,TGF-β1蛋白和TIMP-1 mRNA及蛋白表达明显下降(P<0.05),MMP-9 mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.05).结论 TGF-β3能下调TGF-β1蛋白表达;当TGF-β3/TGF-β1mRNA比值>1时,TGF-β1和TIMP-1表达减少,MMP-9表达增加;当TGF-β3/TGF-β1mRNA比值<1时,TGF-β1表达减少,TIMP-1和MMP-9表达无变化.     

Smad4 siRNA对乳腺癌细胞侵袭力和MMP-9表达的影响

目的:探讨Smad4特异性小分子干扰RNA(siRNA)对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭力及MMP-9表达的影响。方法:构建Smad4 siRNA,将细胞分为空白对照组,Smad4 siRNA转染组,TGF-β处理组,Smad4 siRNA转染+TGF-β处理组。首先用Western blot法检测转染Smad4 siRNA后细胞中Smad4蛋白的表达,以及用荧光素酶报告基因法检测TGF-β处理后细胞Smad结合元件(4xSBE)的活性;然后用Transwell小室模型和Western blot法检测各组细胞的黏附侵袭能力以及基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达水平。结果:转染Smad4 siRNA后,乳腺癌细胞的Smad4蛋白表达及其TGF-β诱导的4xSBE活性增强均被明显抑制(均P<0.05);与对照组细胞比较,细胞经TGF-β刺激后的侵袭能力及MMP-9的表达量均明显增加(均P<0.05),但预先转染Smad4 siRNA的细胞的上述TGF-β刺激作用被明显抑制(均P<0.05),单纯Smad4 siRNA转染对细胞的侵袭能力及MMP-9的表达量无明显影响。结论:Smad4 siRNA能减弱TGF-β诱导的MDA-MB-231细胞的侵袭能力,该作用可能与其抑制MMP-9的表达有关。     

Smad7在肌腱粘连组织中的表达及对肌腱成纤维细胞纤维化的作用

[目的]通过观察人肌腱粘连组织中Smad7的表达情况,并在TGF-β1诱导的肌腱成纤维细胞(TDFs))中沉默或过表达Smad7,观察细胞纤维化相关指标的变化,讨论Smad7在肌腱粘连中的作用及调控机制。[方法]收集肌腱粘连组织及正常肌腱腱周组织,Western blotting检测Smad7蛋白含量。设计并合成针对Smad7基因编码区的siRNA,同时构建Smad7基因表达载体,经脂质体转染至TDFs细胞,Real Time-PCR检测胞内Smad7基因含量,Western-blot检测细胞中Smad7蛋白表达;使用TGF-β1诱导转染后TDFs细胞,CCK-8检测细胞增殖活性变化,Western blotting检测纤维化相关的蛋白指标。[结果]与正常腱周组织比较,肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少。siRNA及Smad7基因过表达载体转染TDFs,可以明显抑制或者上调细胞内Smad7基因含量及蛋白表达,与未转染组比较,差异均有统计学意义(P0.05);TGF-β1诱导的TDFs细胞,可以明显增强细胞增殖活性(P0.01,vs未诱导组),siRNA转染后,TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标上升的趋势进一步增强,Smad7基因表达载体转染则使得TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标增强的趋势得到明显抑制,基因干预且诱导组与只诱导组细胞活性和蛋白含量相比较,差异均有统计学意义(P0.05)。[结论]肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少,提示肌腱粘连发生过程中Smad7表达受抑制;Smad7基因过表达可以抑制TGF-β1诱导TDFs细胞纤维化。     

TGF-β1诱导胃癌细胞上皮间质转化及促进干细胞特性获得的研究

目的 观察TGF-β1能否诱导胃癌KATO-Ⅲ细胞上皮间质转化及促进胃癌细胞干细胞特性的获得.方法 5 ng/mL TGF-β1处理胃癌KATO-Ⅲ细胞72 h后,置于倒置显微镜下观察其形态学变化,CCK-8法检测TGF-β1对KATO-Ⅲ细胞增生的影响,RT-PCR与Western blotting法检测上皮间质转化相关因子Snail、E-cadherin、N-cadherin,胚胎干细胞相关因子Sox2、OCT4、Nanog、EGFR及肿瘤起始细胞相关标志物CD44、CD133表达的变化.单克隆形成实验研究TGF-β1对KATO-Ⅲ细胞克隆形成能力的影响.结果 TGF-β1处理KATO-Ⅲ细胞后,细胞形态由上皮细胞形态向间质细胞样形态转变;TGF-β1处理组KATO-Ⅲ细胞Snail、N-cadherin mRNA表达相对灰度值为(0.5219±0.0147)、(0.6640±0.0124),显著高于对照组(0.2049±0.0214,P=0.004;0.2722±0.0098,P=0.001),TGF-β1处理组Snail、N-cadherin蛋白表达相对灰度值为(0.4769±0.0234)、(0.5014±0.0216),显著高于对照组(0.2534±0.0345,P=0.02;0.2026±0.0268,P=0.009),TGF-β1处理组中E-cadherin mRNA及蛋白表达相对灰度值分别为(0.4701±0.0215)、(0.1349±0.0258),显著低于对照组(0.6792±0.0157,P=0.01;0.6055±0.0227,P=0.004);TGF-β1处理后KATO-Ⅲ细胞增生能力明显降低(P＜0.05).与对照组相比(0.143±0.013、0.156±0.025、0.325±0.046),胚胎干细胞相关因子Sox2、OCT4、Nanog mRNA表达相对灰度值显著增加(0.594±0.039,P=0.001; 0.438±0.033,P=0.001;0.489±0.037,P=0.03),TGF-β1处理组CD44与CD133 mRNA表达相对灰度值分别为(0.437±0.037)与(0.543±0.028),显著高于对照组(0.247±0.024,P=0.000;0.139±0.016,P=0.000);TGF-β1处理组CD44与CD133蛋白表达相对灰度值分别为(0.429±0.034)与(0.316±0.027),显著高于对照组(0.152±0.014,P =0.000;0.110±0.010,P=0.000).TGF-β1处理后,KATO-Ⅲ细胞克隆形成数目及直径均显著高于对照组(P＜0.01).结论 TGF-β1能诱导胃癌KATO-Ⅲ细胞发生上皮间质转化转变,同时促进其干细胞特性获得.