抑制肝癌细胞β-catenin表达能降低缺氧诱导的侵袭转移潜能

目的 研究β-catenin表达对缺氧环境中肝癌细胞侵袭转移潜能的影响.方法 利用100 μmol/L氯化钴处理高转移性MHCC97肝癌细胞模拟体外缺氧;将红色荧光标记的上述细胞(MHCC97-R)行肝脏原位种植并肝动脉结扎,构建体内缺氧模型.在此基础上,以RNAi技术敲除上述细胞内β-catenin基因,观察其对缺氧环境中肝癌细胞侵袭、转移能力的影响.结果 缺氧抑制MHCC97肝癌细胞增殖及MHCC97-R移植瘤生长,但增加其体外侵袭及体内转移.敲除β-catenin不能进一步加强缺氧对细胞增殖的抑制效应,但可明显减少由缺氧诱导的侵袭、转移.结论 缺氧环境中,肝癌细胞增强的侵袭转移潜能与β-catenin功能相关.     

应激激素肾上腺素激活ERK1/2促进人肝癌细胞生长

目的 探讨应激激素肾上腺素(EPI)对人肝癌细胞生长的影响及其作用机制.方法 采用噻唑蓝(MTT)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot等方法,分析EPI对人肝癌HepG2和MHCC97H细胞生长的影响,与α1-/β2-肾上腺素受体(α1-/β2-ARs)、腺苷环化酶/蛋白激酶A(AC/PKA)、促分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1/2(MAPK/ERK1/2)和磷脂酸激醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT/PKB)的关系.结果癌细胞增殖与EPI的作用呈剂量和时间依赖关系(P<0.05),10μmol/L EPI作用24～48 h时其增殖能力最强[HepG2/(215±4)%和MHCC97H/(207±10)%],而正常肝细胞L-02的变化不明显(P>0.05).在HepG2和MHCC97H细胞中,α1-AR蛋白表达仅为L-02的30%和34%,而β2-AR蛋白表达上升至331%和309%.β2-AR阻滞剂ICI 118551可抑制EPI的促增殖作用.β-AR激动剂异丙肾上腺素(ISO,10μmol/L)具有类似EPI的促进增殖作用,其作用可分别被ICI118551和MEK抑制剂U0126显著抑制,被PKA抑制剂H-89和PI3K抑制剂LY294002部分抑制.ISO孵育15 min～8 h,在HepG2中p-ERK1/2蛋白水平上升3.49/3.02倍,在MHCC97H中上升3.15/2.73倍,该作用可被ICI 118551和U0126所阻断.结论 人肝癌HepG2和MHCC97H细胞过表达β2-AR,EPI通过β2-AR激活ERK1/2依赖性和非依赖性信号通路促进癌细胞的生长,其中MAPK/ERK1/2信号通路可能起主要作用.     

应用HBV-Alu-PCR研究肝癌细胞株中乙型肝炎病毒整合

目的探讨常见肝癌细胞株中整合的乙型肝炎病毒(HBV)序列和整合位点。方法分别将来源于HBV感染者的肝癌细胞株(MHCC97H、MHCC97L、MHCCLM3和PLC/PRF/5),稳定转染HBV的肝癌细胞株(Hep G2.2.15、Hep AD38和DE19),和无HBV感染者来源的肝癌细胞株(Hep G2、Hu H-7)培养72 h,检测培养上清中乙型肝炎病毒表面抗原(HBs Ag)、乙型肝炎病毒E抗原(HBe Ag)及HBV DNA滴度。采用HBV-Alu-PCR方法,扩增肝癌细胞株中整合的HBV基因X/C/S片段及其侧翼的人基因组DNA片段,对扩增片段进行测序确定HBV整合在人类染色体的精确位置,并用生物信息学分析确定其上下游基因。结果 MHCC97H、MHCC97L和MHCCLM3未检出HBs Ag和HBe Ag,但HBV DNA滴度为2.00×105~4.00×105 IU/ml;Hep G2.2.15、Hep AD38、DE19和PLC/PRF/5 HBs Ag阳性,且HBV DNA滴度5.00×105 IU/ml,其中Hep G2.2.15、Hep AD38 HBe Ag阳性;Hep G2、Hu H-7 HBs Ag、HBe Ag和HBV DNA均低于检测下限。除Hep G2和Hu H-7未检测到整合外,其余细胞株中可检测到1个或多个整合的不同HBV亚基因组片段:Hep G2.2.15检测到5个HBx和HBc整合片段,Hep AD38和PLC/PRF/5各检测到2个HBx整合片段,DE19检测到一个HBc整合片段。3个MHCC97的衍生细胞株:MHCC97L(低转移潜能肝癌细胞)、MHCC97H(高转移潜能肝癌细胞)和MHCCLM3(MHCC97H肺转移肝癌细胞)检测到完全相同的HBc片段整合在16q13上IRX3和IRX5基因之间的非编码区。此外,各细胞株HBV整合位点上下游的基因主要包括肿瘤相关基因,核糖体蛋白编码基因和钙信号相关基因。结论 HBV感染者来源和稳定转染HBV的肝癌细胞株存在HBV整合;HBV基因X/C片段比S片段有更高的整合频率;同一个克隆来源的肝癌细胞株的HBV整合位点稳定,提示HBV整合分析可能对肝细胞癌原发灶和转移灶癌细胞克隆来源的鉴定提供参考。     

siRNA对肝癌HepG2细胞β-catenin表达和细胞增殖的抑制作用

目的 研究siRNA对肝癌HepG2细胞β-catenin基因表达,β-catenin蛋白翻译及细胞增殖的抑制作用.方法 利用RT-PCR检测β-catenin基因表达,WesternBlotting方法检测肝癌HepG2细胞株β-catenin表达和HepG2细胞增殖曲线的变化.结果 shRNA转染后1dA和B组β-catenin表达弱于C和D组,2dA和B组β-catenin表达更弱,3d几乎未见表达.A和B组问比较无显著差异(P>0.05),A,B与C、D组比较相差非常显著(P<0.01).A,B两处理组细胞转染后每天所检测抑制率均显著高于对照组(P<0.01),表明细胞经A、B处理后生长受到明显抑制;两处理组细胞生长抑制率5d内逐渐增高.A与B和C与D组间差异无统计学意义(P>0.05).加入siRNA的两实验组(A,B组)β-catenin蛋白表达明显较少,对照C,D组β-catenin蛋白表达较多,提示siRNA抑制了HepG2细胞的β-catenin蛋白表达.结论 针对β-catenin的sbRNA能够抑制β-cateninmRNA表达,使胞浆中的β-cateninmRNA下降,细胞β-catenin蛋白表达明显减少,HepG2细胞增殖受到明显的抑制,这种作用对临床肿瘤有潜在的治疗价值.     

5氮胞苷与丁酸抑制人肝癌细胞转移的实验研究

目的　了解5氮胞苷和丁酸对肝癌细胞转移及肝癌细胞蛋白表达的影响。方法　使用5氮胞苷与丁酸处理人肝癌细胞株HepG2及Hep3B,观察处理后肝癌细胞转移、粘附及增殖的改变以及细胞周期抑制蛋白p21waf1、p27kip1和p53表达的改变。结果　5氮胞苷和丁酸联合使用能够完全阻断两种肝癌细胞的转移,转移细胞数均为0/膜;而对照组HepG2和Hep3B转移细胞数分别为(91±17)/膜和(117±74)/膜,P<0.01;两种药物均可抑制肝癌细胞的粘附及增殖;接种后6d　5氮胞苷与丁酸处理组的HepG2细胞数分别为(13.2±0.6)×10     

Hedgehog信号通路在人肝癌细胞株中的表达及意义

目的 探讨Hedgehog信号通路在人肝细胞癌细胞系中的表达及意义。 方法 采用半定量 RT-PCR 法检测PLC/PRF/5、HepG2及 SMMC-7721肝癌细胞株中Shh、Ptch1、Smo、Gli1、Gli2 mRNA 的表达;Western blot法检测PLC/PRF/5、HepG2及 SMMC-7721肝癌细胞株中Gli2蛋白的表达。 结果 除Shh外, Ptch1、Smo、Gli1、Gli2 mRNA在PLC/PRF/5、HepG2及 SMMC-7721细胞中均有不同程度表达。其中,Ptch1、Smo、Gli1、Gli2 mRNA在PLC/PRF/5及SMMC-7721细胞中的表达强度显著高于成人正常肝细胞,而Gli1 mRNA在HepG2细胞中的表达量与正常肝细胞无明显差异;Gli2蛋白在成人正常肝细胞中几乎没有表达,在HepG2细胞中的表达也与正常肝细胞无明显差别,而在PLC/PRF/5及 SMMC-7721细胞中,尤其是SMMC-7721细胞,Gli2的表达量异常增高。 结论 Hedgehog 信号通路的异常激活参与了肝细胞癌的发生发展过程,Gli2可能成为肝细胞癌重要生物学标志和生物治疗靶点。     

趋化因子受体在肝癌细胞中的表达及其意义

目的 观察趋化因子受体(CCR1 CCR7 CXCB3 CXCR4)在人肝癌细胞系(Hep3BHepG2 HLE和HLF)的表达,并探讨其作用机制.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、细胞免疫组织化学、流式细胞仪测定趋化因子受体在肝癌细胞表面的表达,通过肝癌细胞Hep3B体外侵袭实验即重组大鼠巨噬细胞激动蛋白(CCL3)-1对Hep3B细胞穿透人工重组基底膜能力的影响来检测趋化因子受体在肝癌侵袭转移时所起的作用,并通过激光共聚焦显微镜观察趋化因子受体在肝癌细胞侵袭转移过程中的作用机制.结果 通过RT-PCR,流式细胞术可检测到CCR1 mR-NA及蛋白在肝癌细胞中表达,免疫组织化学显示CCR1在肝癌细胞包膜和胞质内都有表达.细胞侵袭实验提示Hep3B在CCL3的刺激下,实验组Hep-3B细胞通过基底膜的数量(213±12)多于对照组细胞通过基底膜的数量(102±11),差异有统计学意义(P<0.01).运用激光共聚焦检测到实验组胞内钙离子的浓度增加到.结论 肝癌细胞系(Hep3B HepG2 HLE和HLF)的表面的表达CCRl,且CCR1在肝癌细胞侵袭转移中发挥重要的作用,其作用机制与细胞内钙离子浓度有很关.     

Ad.mda-7高选择性杀伤不同转移潜能肝癌细胞的研究

目的利用携带人MDA-7／IL-24基因的复制缺陷型腺病毒（Ad．mda7）作为载体，感染不同转移潜能的肝癌细胞MHCC97H，MHCC97L，Hep3B和正常的肝细胞L02，观察该基因对肝癌的选择性杀伤作用和增殖抑制作用。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad．mda-7感染正常肝细胞L02和肝癌细胞MHCC97H，MHCC97L和Hep3B，通过RT-PCR和ELISA方法观察MDA7基因的表达，通过四甲基偶氮哩蓝染色法（MTT）观察该基因对肝癌细胞的生长抑制，Hoechst染色和流式细胞仪观察MDA-7对肝癌细胞的杀伤作用，流式细胞仪检测细胞周期变化。结果RT-PCR提示复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株MHCC97H，MHCC97L，Hep3B和正常细胞L02中高效表达；ELISA方法检测提示细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达，而且随着感染时间延长表达量升高；MTT实验结果表明MDA7能明显抑制肝癌细胞的生长，Hoechst染色和流式细胞仪提示MDA7能促进肝癌细的凋亡；细胞周期检测提示肝癌细胞大量被阻滞在G2／M期，正常细胞没有增殖阻滞作用。各项结果提示MDA7对正常的肝细胞没有促进凋亡和增殖阻滞的作用。结论Ad．mda-7选择性的杀伤肝癌细胞，促进细胞增殖阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡与肝癌细胞的转移潜能无关。     

基因芯片筛选人肝癌细胞株MHCC97中血管生成拟态相关基因

目的 通过观察三维培养条件下高、低转移人肝癌细胞株MHCC97-H、MHCC97-L形成血管生成拟态(VM)的差异,探讨VM形成与细胞外基质和粘连分子相关机制.方法 建立MHCC97-H、MHCC97-L三维培养体系,倒置显微镜下观察血管样结构形成差异.以人脐静脉内皮细胞、无转移人肝癌细胞株Hep3B及正常人肝细胞株HL-7702作对照.应用细胞外基质和粘连分子基因芯片筛选MHCC97-H和MHCC97-L中差异表达的基因,并采用RT-PCR和Western blot验证芯片的结果.组间比较采用两样本t检验.结果 三维培养24h,MHC097-H形成的血管样结构长度为(474±16)mm/cm2,MHCC97-L为(320±41)mm/cm2,两者比较,差异有统计学意义(t=6.119,P＜0.05).Hep3B及HL-7702均不形成血管样结构.在113个细胞外基质和粘连分子相关基因中,MHCC97-H表达较MHCC97-L上调的有7个,下调的有3个.选取差异性表达的腱糖蛋白-C和细胞外基质蛋白1经RT-PCR及Western blot验证,结果与基因芯片结果基本一致.结论 高转移人肝癌细胞株MHCC97-H体外形成VM能力明显较低转移人肝癌细胞株MHCC97-L强,其原因可能与MHCC97-H差异表达某些细胞外基质和粘连分子相关基因有关.     

体外化疗后残余肝癌细胞侵袭转移潜能变化及其机制

目的 探讨体外化疗后残余肝癌细胞侵袭转移潜能变化及其机制.方法 以2 mol/L奥沙利铂对人肝癌细胞株MHCC97L和HepG2进行体外冲击化疗,获得残癌细胞株MHCC97L-oxa和HepG2-oxa.对比研究残癌细胞株和母细胞株的侵袭、运动、增殖能力以及分子表型的差异.结果 与母细胞株比较,MHCC97L-oxa和HepG2-oxa细胞显示出显著增强的运动能力(19.17 ±2.64比29.50±5.28,P＜0.01和12.33±2.73比21.17±3.13,P＜0.01)和侵袭能力(增强0.89倍,P＜0.01和增强1.58倍,P＜0.01),而增殖能力则显著下降.MHCC97L-oxa和HepG2-oxa细胞在形态和分子表型上明显区别于MHCC97L和HepG2,呈现出间质细胞形态,伴E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达显著下调,N-cadherin、波形蛋白(vimentin)以及转录因子Snail表达显著增强,细胞呈现上皮-间质转化.结论体外化疗后残余肝癌细胞发生上皮-间质转化,侵袭转移潜能增强.     

Musashi RNA结合蛋白2通过Wnt/β-catenin信号通路对肝癌细胞增殖的影响

目的探究Musashi RNA结合蛋白2(MSI2)如何通过Wnt/β-catenin信号通路发挥调控肝癌细胞增殖的作用。方法通过转染短发夹RNA(shRNA)抑制MSI2表达, 将细胞分为转染对照质粒(sh-Ctrl)组和sh-MSI2组。MSI2过表达实验中将细胞分为对照组(Vector组, 转染空白质粒Vector)和过表达组(MSI2组, 转染MSI2重组质粒)。CCK-8和平板克隆实验检测细胞增殖。蛋白质印迹法检测干预MSI2后β-catenin、转录因子7(TCF7)和淋巴增强因子1(LEF1)的表达。Rescue回复实验中将细胞分为MSI2+sh-Ctrl组(同时转染MSI2重组质粒和sh-Ctrl质粒)和MSI2+sh-β-catenin组(同时转染MSI2重组质粒和sh-β-catenin质粒)。在过表达MSI2的基础上敲低β-catenin进行肝癌细胞增殖能力检测。结果 sh-MSI2组HepG2和MHCC97H细胞的增殖率均低于sh-Ctrl组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。MSI2组的SMMC-7721和MHCC97L细胞增殖率均高于Vector组...     

丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2在肝癌细胞系中的表达及其促凋亡作用

目的：探讨Omi/HtrA2丝氨酸蛋白酶活性对肝癌细胞HepG2凋亡的影响。方法：检测O-mi/HtrA2在正常肝上皮细胞L02细胞系和肝癌细胞系HepG2、Hep3B、PLC中的表达。用脂质体法将Omi/HtrA2小干扰RNA表达载体（psiRNA-Omi/HtrA2）转染至人HepG2细胞中,以RT-PCR和Western Blot法评价psiRNA-Omi/HtrA2对Omi/HtrA2表达的沉默效应。用MTT法和流式细胞仪检测siRNA导致Omi/HtrA2基因沉默后HepG2细胞凋亡的变化。结果：在L02细胞系和3种肝癌细胞系中,所有细胞系在mRNA水平和蛋白质水平均表达Omi/HtrA2,在肝癌细胞系中的Omi/HtrA2 mRNA和蛋白质表达水平均高于正常肝上皮细胞L02。psiRNA-Omi/HtrA2载体可特异性抑制HepG2细胞中Omi/HtrA2的表达。转染psiRNA-Omi/HtrA2载体的HepG2细胞凋亡下调。结论：Omi/HtrA2在肝癌细胞系中表达增高,它可能在促进肝癌细胞凋亡中有重要作用,Omi/HtrA2为肝癌的治疗提供了一个新的选择靶点。     

Wnt/β-Catenin信号通路在肝癌发生中的分子机制研究

目的探讨Wnt/β-Catenin信号通路在肝癌细胞增殖、迁移方面的影响和其在肝癌发生发展中的可能作用。方法体外培养HepG2和L02细胞,采用免疫荧光和Western Blot检测Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin、GSK3β、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平。培养的HepG2细胞分别用浓度100ng/ml的Wnt3α和20 ng/ml的DKK1处理,采用CCK-8检测细胞增殖活力,流式细胞实验检测细胞周期,Western Blot检测β-catenin、GSK3β、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平,Trans-well检测HepG2的迁移情况。结果与正常肝细胞L02相比,HepG2细胞高表达β-catenin,cyclin D1和c-myc,低表达GSK3β。Wnt3α能够显著促进HepG2细胞的增殖活力,而DKK1能够显著抑制其增殖。与Wnt3α组相比,DKK1处理组细胞G0/G1期细胞比例增加,(68.6±0.5)%VS(47.5±1.5)%(P0.01),而S期细胞比例减少(17.4±0.5)%VS(28.6±0.5)%,(P0.01)。Western Blot检测结果说明,Wnt3α提高了β-catenin、cyclin D1和c-myc的表达水平,抑制了GSK3β的表达,而DKK1抑制了β-catenin、cyclin D1和c-myc的表达。迁移实验透膜细胞数对照组为(176.40±12.98)、Wnt3α组为(238.20±18.38)、DKK1组为(110.40±9.46),P0.05。结论 Wnt/β-catenin信号通路在促进HepG2细胞的增殖和迁移方面起重要作用,在肝癌的发生发展和转移中起着重要的作用,是肝癌发生的重要分子机制。     

奥沙利铂对不同p53状态肝癌细胞中DNA损伤修复基因GADD45β的诱导差异及调控机制

目的 探索奥沙利铂对不同p53状态肝癌细胞的DNA损伤修复基因(GADD45β)诱导差异及可能调控机制.方法 转染p53全序列建立Hep3B+p53.体外合成GADD45β近端启动子序列群(-618至-314),构建荧光素表达质粒,转染肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Hep3B+p53.以实时荧光定量PCR比较奥沙利铂对GADD45β表达诱导及其近端启动子活性影响差异;比较对DNA合成和细胞克隆形成能力抑制差异;通过Caspase-3的表达变化测定凋亡的发生和发展.结果 奥沙利铂对Hep3B中GADD45β诱导并不明显.转染p53全基因序列后,Hep3B+p53对奥沙利铂的敏感性明显增加,并呈现出剂量-效应的正相关关系.荧光素分析提示奥沙利铂作用Hep3B+p53后的启动子NF-κB(-618/+6)和E2F-1(-470/+6)活性较Hep3B明显增强约1.5倍和0.8倍.奥沙利铂能够更加明显地抑制Hep3B+p53的DNA合成能力和细胞克隆形成能力,100 μmol/L奥沙利铂作用后Hep3B+p53DNA合成率为30.41％,对细胞克隆形成能力的抑制率则达到75.60％,与Hep3B相比差异显著.奥沙利铂作用后Hep3B+p53的Caspase-3能够迅速地启动凋亡的发生和发展.结论 p53对铂类化疗药物对肝癌细胞的GADD45β诱导具有重要作用,增强转录调节因子的表达水平是其可能的作用机制.     

抗肝肠钙粘连蛋白单克隆抗体对肝癌细胞生物学行为的影响

目的 观察抗肝肠钙粘连蛋白(CDH17)单克隆抗体Lic5对肝癌细胞生物学行为的影响.方法 Western blot和实时定量聚合酶链反应(PCR)检测细胞株MHCC97H、MHCC97L、PLC/PRF/5及MIHA中CDH17的表达.噻唑蓝(MTT)比色法、细胞划痕法、Transwell法及平板克隆法检测Lic5对肝癌细胞生物学行为的影响.结果 CDH17仅在细胞株MHCC97H、MHCC97L中表达,Lic5可结合肝癌细胞表面的CDH17,并抑制CDH17表达.Lic5 50mg/L组、100mg/L组、小鼠IgG组4 d细胞增殖抑制率在MHCC97H为26.1%、43.6%、6.4%,MHCC97L为26.0%、40.7%、7.7%;Lic5100mg/L组、小鼠IgG组、磷酸盐缓冲液(PBS)组48h细胞迁移抑制率在MHCC97H为36.7%、8.4%、5.6%,MHCC97L为42.3%、10.2%、7.4%(P＜0.05);穿膜细胞数在MHCC97H为(39.20±9.56)、(106.50±7.56)、(96.60±13.02)个,MHCC97L为(26.00±8.61)、(86.00±10.26)、(90.40±12.04)(P＜0.05);克隆形成数在MHCC97H为(59.30±11.68)、(141.70±19.40)、(150.30±14.64),MHCC97L为(57.20±10.21)、(132.50±9.07)、(121.70±11.93)(P＜0.01).Lic5对PLC/PRF/5及MIHA细胞的生物学行为无明显影响.结论 单克隆抗体Lic5能够下调肝癌细胞CDH17表达,抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力.

Abstract：

Objective To investigate the effect of monoclonal antibody against liver-intestine cadherin (CDH17) on the cell proliferation, migration, invasion and colony formation of hepatocellular carcinoma cell lines. Methods Hepatocellular carcinoma cell lines MHCC97H, MHCC97L, PLC/PRF/5 and MIHA were examined for CDH17 expression by Western blotting and quantitative real-time polymerase chain reaction (PGR). The combination capacity between bepatocellular carcinoma cell lines and monoclonal antibody Lic5 was detected by the way of immunofluorescence staining. The cell lines were treated with Lic5, PBS and mouse IgG respectively. Methyl thiazol tetrazolium (MTT) assay, wound healing assay, Transwell invasion assay and colony formation assay were used to study the changes in cell proliferation, migration, invasion and colony formation of hepatocellular carcinoma cell lines. Results High expression level of CDH17 was detected in MHCC97H and MHCC97L cell lines. CDH17 protein level was down-regulated but there was no significant effect on CDH17 mRNA after treatment with Lie5 in MHCC97H and MHCC97L. Cellular growth rate of MHCC97H in Lic5 (50 mg/L), Lic5 ( 100 mg/L) and mouse IgG groups was decreased by 26. 1%, 43.6% and 6. 4%, and by 26. 0%, 40. 7% and 7. 7% in MHCC97L on the 4th day respectively (P ＜0. 05 ). The inhibition rate of cell migration at 48 h was 36. 7%, 8. 4% and 5.6% in Lic5 ( 100 mg/L), mouse IgG and PBS groups in MHCC97H, and 42. 3%, 10. 2% and 7. 4% in MHCC97L respectively ( P ＜ 0. 05 ). The number of invasion cells was ( 39. 20 t 9. 56),(106.50±7.56) and (96.60±13.02) in MHCC97H, and (26.00±8.61), (86.00±10.26) and (90.40±12.04) in MHCC97L in Lic5 (50 mg/L), Lic5 (100 mg/L) and mouse IgG groups, respectively (P ＜ 0. 05 ). The number of colony formation was ( 59. 30 ± 11.68 ), ( 141.70 ± 19. 40 ) and (150.30 ±14.64) in MHCC97H, and (57.20 ± 10.21), (132.50 ±9.07) and (121.70 ±11.93) in MHCC97L in Lie5 (50 mg/L), Lic5 (100 mg/L) and mouse IgG groups, respectively (P＜ 0. 01 ).There was no significant difference between Lic5 treatment groups and controls in PLC/PRF/5 and MIHA cell lines. Conclusion The anti-CDH17 monoclonal antibody Lic5 can down-regulate CDH17 expression and inhibit the cell proliferation, migration, invasion and colony formation in hepatocellular carcinoma cell lines.     

RNA干扰Oct4的表达对肝癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨干细胞相关基因Oct4与Wnt/β-catenin在人肝癌组织及肝癌细胞系中的相互作用.方法 PCR法检测Oct4、Wnt/β-catenin及其他相关基因在肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织的表达差异.使用SiRNA-Oct4沉默人肝癌HepG2细胞Oct4的表达,实时荧光定量PCR法检测Wnt/β-catenin基因表达.检测RNAi后细胞迁移以及克隆形成能力.结果 肝癌患者的上述组织中,Oct4和β-catenin在癌内表达最高,癌旁次之,正常肝最低.使用SiRNA-Oct4沉默人肝癌HepG2细胞Oct4后,Oct4表达明显下调,β-catenin、Wnt10b表现为与Oct4表达呈正相关,TCF3表达与Oct4呈负相关.RNAi后HepG2细胞的迁移能力、克隆形成能力均下降.结论 Oct4在肝癌组织内高表达而在正常肝细胞中的表达极低.RNAi后HepG2细胞的迁移能力、克隆形成能力均下降可能与Wnt/β-catenin通路功能减弱有关.

Abstract：

Objective To investigate the expression of Oct4 in liver cancer, and the interrelation of the Oct4 and Wnt/β-catenin genes in hepatocellular carcinoma( HCC) cell line HepG2. Methods RTPCR technique was used to detect the expression of Oct4 and β-Catenin in HCC specimens; RNAi was used to knock-down the expression of Oct4 in HepG2, and the change of Wnt/β-catenin related genes were detected by Real time-PCR. Results In HCC specimens, the expression of Oct4 and β-Catenin in tumor and cirrhotic liver tissues were stronger than normal liver tissues. In SiRNA Oct4 HepG2 cells, the expression of Oct4 was downregulated, and β-catenin as well as Wnt10b were in a positive correlation with Oct4, TCF3 was in negative correlation with Oct4. Clone formation and move ability of the HepG2 were downregulated. Conclusions The expression of Oct4 was higher in tumor tissues than in normal liver tissues. Silencing Oct4 by SiRNA-0ct4 in HepG2 resulted in decreased ability of clone formation and cell movement.     

缺氧环境中Netrin-1对肝癌细胞骨架重组的作用研究

目的 研究缺氧对人肝癌细胞HepG2细胞骨架重组的影响及Netrin-1在细胞骨架重组中的作用.方法 通过1%O_2 低氧培养建立人肝癌细胞HepG2物理缺氧模型,观测缺氧对细胞形态的改变.构建针对Netrin-1 mRNA的干扰质粒pshRNA-Netrin-1及阴性对照质粒pGensil-1,并将其转染HepG2细胞,筛选稳定转染细胞株.观测转染pshRNA-Netrin-1质粒前后,鬼笔环肽检测缺氧对肝癌细胞对HepG2细胞骨架重组的影响,细胞迁移实验检测缺氧条件下干扰Netrin-1对细胞迁移能力的影响.同时构建Netrin-1真核表达质粒pGNET1转染HepG2细胞,观测Netrin-1对肝癌细胞骨架重组的作用.结果 低氧培养HepG2细胞胞体变得狭长,细胞连接松散.Netrin-1蛋白表达水平显著升高(P＜0.05).HepG2细胞稳定转染pshRNA-Netrin-1后,Netrin-1 mRNA表达显著下降.抑制率达73.32%±4.12%(P＜0.01).鬼笔环肽检测F-actin结果 显示,缺氧促进HepG2细胞骨架重组,转染pshRNA-Netrin-1后,缺氧促进HepG2细胞骨架重组受到显著抑制.细胞迁移实验结果 显示,缺氧条件下干扰Netrin-1的表达显著抑制HepG细胞迁移能力(P＜0.05).转染 pGNET1后,HepG2细胞骨架发生重组.结论 缺氧促进HepG2细胞骨架重组与Netrin-1表达水平升高相关,Netrin-1表达的上调可能是缺氧促进肝癌细胞骨架重组进而促进侵袭转移的机制之一.     

Tspan8过表达与肝癌转移潜能及预后的关系

目的:探讨Tspan8表达与肝癌侵袭转移及预后之间关系。方法:用q RT-PCR和Western blot检测不同肝癌细胞系及80例肝癌患者手术标本中Tspan8的m RNA与蛋白表达;应用组织芯片检测352例肝癌组织样本中Tspan8的表达,分析Tspan8表达与肝癌临床病理因素及复发与预后的关系。结果:Tspan8的m RNA与蛋白表达在高转移潜能肝癌细胞系(MHCC97-H、MHCC97-L)中的表达明显高于低转移潜能的肝癌细胞系(PLC/PRF/5、SMMC7721、Hep G2),在肝癌组织中的表达明显高于癌旁与正常肝组织,且在有肝内转移或血管侵犯患者癌组织中的表达明显高于无肝内转移及血管侵犯患者的癌组织(均P0.05)。Tspan8高表达是肝癌术后复发转移(HR=1.64,95%CI=1.21~2.23,P=0.002)和术后生存(HR=1.66,95%CI=1.23~2.25,P=0.001)的独立危险因素,Tspan8高表达患者术后5年总生存率明显低于Tspan8低表达组,术后复发时间明显短于低表达患者(均P0.05)。结论:Tspan8促进肝癌侵袭转移,Tspan8高表达患者预后不良。     

聚糖蛋白抗体的制备及其在肝癌组织及细胞系蛋白表达检测中的应用

目的制备聚糖蛋白3(glypican-3,GPC3)抗体并应用其对肝癌组织及细胞系中GPC3蛋白表达进行研究,探讨GPC3蛋白作为肝癌潜在的新的肿瘤标志物的可能性。方法利用原核表达系统诱导表达了GPC3抗原并制备了特异性好的兔抗GPC3多克隆抗体,应用该纯化的抗体对40例组织(正常肝7例,肝细胞型肝癌26例,胆管细胞型肝癌7例)及4个细胞系(肝癌细胞系HepG2、HuH-7、Hep3B,非肝癌细胞系Hela)进行了蛋白印记杂交试验。结果Western blot结果显示,肝癌组织及肝癌细胞系HepG2、HuH-7、Hep3B细胞系中有相对相对分子质量约70000的蛋白主带,与GPC3的核心蛋白带相对分子质量大小相一致;正常肝组织不表达GPC3蛋白,肝细胞型肝癌中癌组织(HCC)及癌旁组织表达GPC3蛋白的比例分别为84.6%(22/26)及30.8%(8/26),7例胆管细胞型肝癌(ICC)中有2例癌组织及其旁组织表达GPC3。结论GPC3蛋白广泛存在于肝癌组织中,很可能成为一种新的肝癌肿瘤标志物。     

利用噬菌体肽库筛选高转移潜能人肝癌细胞结合肽

目的筛选高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽。方法以高转移潜能人肝癌细胞系HCCLM3作为靶细胞，低转移潜能人肝癌细胞系MHCC97L为吸附细胞对噬菌体随机7肽库进行差减筛选，采用噬菌体结合实验和抗噬菌体免疫细胞化学染色对阳性克隆的特异性进行鉴定。结果经3轮筛选，随机挑选48个噬菌体克隆进行DNA序列分析，展示AWYPLPP肽的噬菌体被高度富集77％（37／48）；噬菌体结合实验显示，与低转移潜能人肝癌细胞系MHCC97L、PLC／PRE／5和无转移潜能入肝癌细胞系Hep3B以及正常入肝细胞系CCLl3相比，AWYPLPP噬菌体特异性与高转移潜能人肝癌细胞系HCCLM3、HCCLM6、MHCC97H和MHCC97结合（P〈0．01）；抗噬菌体免疫细胞化学染色证实AWYPLPP噬菌体特异性靶向高转移潜能人肝癌细胞系HCCLM3、HCCLM6、MHCC97H和MHCC97。结论从噬菌体肽库中获得与高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽，可作为肝癌转移复发靶向治疗研究的载体。