树突状细胞激活的肿瘤浸润性淋巴细胞体外对自体肝癌细胞杀伤活性的研究

目的:探讨树突状细胞(DC)激活的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)体外对自体肝癌细胞杀伤活性.方法:从肝癌患者外周血获取DC,应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)和肿瘤抗原激活DC,然后用DC来激活TIL,观察TIL在体外对自体肝癌细胞的杀伤活性.结果:DC激活的TIL具有很高的对自体肝癌细胞杀伤活性,杀伤率为(89.39±3.05)%,明显高于未经DC激活的TIL、CD激活的T淋巴细胞和未经DC激活的T淋巴细胞对自体肝癌细胞的杀伤率.结论:肝癌患者外周血DC能诱导TIL产生高效而特异的抗肝癌免疫.     

树突状细胞激活效应细胞的最佳效靶比及其体外杀伤活性的研究

目的:探讨树突状细胞(DC)激活肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和小鼠脾淋巴细胞(小鼠脾LC)的最佳效靶比并观察被有效激活的TIL和小鼠脾LC等对小鼠H22肝癌细胞的体外杀伤作用.方法:从荷瘤小鼠四肢长骨提取DC,联合应用GM-CSF、IL-4和小鼠H22肝癌细胞全细胞性抗原致敏DC,然后依据不同的激活效靶比用致敏DC体外激活TIL、小鼠脾LC,分别检测、比较被不同程度激活的TIL、小鼠脾LC以及未激活的小鼠脾LC、未激活的TIL对小鼠H22肝癌细胞的杀伤活性.结果:①当DC:靶细胞(E/T)为1:400和1:200时,所激活的TIL或小鼠脾LC的杀伤活性较弱;当E/T为1:100时,杀伤活性有较明显的提高,与前两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05);当E/T=1:50时,杀伤活性增加,与前三者比较差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);而当E/T=1:25、1:12.5和1:6.25时,杀伤活性与E/T=1:50时比较无明显变化(P＞0.05);②当E/T=1:50时,未经DC激活的小鼠脾LC(A组)杀伤率为(9.73±1.40)%,未经DC激活的TIL(B组)和DC激活的小鼠脾LC(C组)杀伤率分别为(50.91±2.36)%和(49.70±2.70)%,DC激活的TIL(D组)的杀伤率为(73.49±2.46)%.A组与其他组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);B组和C组比较差异无统计学意义(P＞0.05);D组与其他各组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论:①当E/T=1:50时,DC能很好的发挥抗原提呈作用,使小鼠脾LC和TIL得以充分激活;②充分激活的小鼠脾LC或TIL对小鼠H22肝癌细胞的体外杀伤活性较未激活的小鼠脾LC或未激活的TIL均具有明显的提高,尤以激活的TIL的杀伤活性最强.     

肿瘤浸润性淋巴细胞的体外培养及肿瘤细胞的杀伤作用

以 观上当瑟一淋巴细胞体外扩增速度及对肿瘤细胞的杀伤作用。肿瘤组织经处理后，用淋巴细胞分液可分离得到ＴＩＬ，用含ｒＩＬ－２的完全培养基培养ＴＩＬ，并作ＴＩＬ对肿瘤细胞的杀伤率。结论：ＴＩＬ在含ｒＩＬ－２的完全培养基中可大量扩增，ＴＩＬ对肿瘤的杀伤作用与效靶比例 及培养时间有关。     

脐带血树突状细胞疫苗体外诱导杀伤人肝癌细胞

目的 :制备人脐带血来源的树突状细胞 (DC )疫苗 ,并观察其在体外对人肝癌细胞的杀伤活性。方法 :rhGM CSF10 0 μg/mL、rhTNF α 5 0u/mL诱导人脐带血CD3 4+ 干细胞向DC分化 ,用超声破碎的人肝癌细胞BEL 740 2裂解物冲击DC ,制备DC疫苗。活细胞计数和中性红比色法检测DC疫苗致敏的脐带血或外周血淋巴细胞在体外对BEL 740 2的杀伤活性。结果 :脐带血CD3 4+ 细胞在细胞因子诱导下 ,细胞体积增大 ,变为不规则形 ,细胞数量增多 ,形成细胞集落。在培养后期集落周围的细胞伸出长的树枝状突起并不断从集落脱落下来。活细胞计数和中性红比色法显示负载肿瘤抗原的DC致敏的淋巴细胞在体外对BEL 740 2的杀伤活性明显强于未致敏的淋巴细胞 (P <0 0 1) ,DC致敏的脐带血来源淋巴细胞和DC致敏的外周血来源淋巴细胞的杀伤活性分别为 44 0 9%和 47 92 % (P >0 0 5 )。结论 :人脐带血干细胞在细胞因子的诱导下扩增并分化为DC。经肝癌细胞裂解抗原致敏、人脐带血来源的DC疫苗 ,能增强淋巴细胞对相应人肝癌细胞的体外杀伤效应 ,而且DC疫苗对脐带血来源的初始型淋巴细胞和外周血来源的淋巴细胞有同样的激活作用     

树突状细胞激活的肿瘤浸润淋巴细胞体外抗小鼠乳腺癌活性的研究

目的:探讨致敏的树突状细胞(DC)激活的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)体外抗小鼠乳腺癌活性.方法:从小鼠四肢长骨骨髓中获取DC,应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)和肿瘤全细胞性抗原致敏DC,然后用DC激活TIL,观察TIL在体外对小鼠C127乳腺癌细胞、小鼠MA782乳腺癌细胞和小鼠B16黑色素瘤细胞的杀伤活性.结果:经C127细胞全细胞性抗原致敏的DC激活的TIL具有很强的对C127细胞的杀伤活性[杀伤活性为(70.21±2.86)%],明显高于其对MA782和B16细胞的杀伤活性[杀伤活性分别为(51.31±3.25)%,(31.41±2.65)%],也明显高于未经DC激活的TIL、C127-DC-小鼠脾淋巴细胞和未经DC激活的小鼠脾淋巴细胞对C127细胞杀伤活性[杀伤活性分别为(48.30±2.97)%,(47.76±3.43)%和(17.23±2.56)%]和对MA782细胞杀伤活性[杀伤活性分别为(38.52±2.87)%,(36.62±2.75)%和(18.07±2.40)%]以及对B16细胞杀伤活性[杀伤活性分别为(25.38±2.63)%,(24.82±2.81)%和(17.34±2.81)%],同时B16细胞全细胞性抗原致敏的DC激活的TIL(TIL来源于C127瘤体)也可诱导相对较低的对B16细胞的特异性细胞杀伤活性.结论:经C127细胞全细胞性抗原致敏的DC能诱导TIL产生高效而特异的体外抗小鼠乳腺癌免疫.     

树突状细胞体外激活的CTL杀伤效应

目的 :研究树突状细胞 (dendriticcell,DC)激活的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的特异性杀伤效应。方法 :从人外周血中分离出外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcell,PBMC) ,在GM -CSF和IL - 4的作用下培养 7天诱导出DC ,然后PBMC或DC为刺激细胞在体外诱导出HBsAg特异性CTL ;在调节好一定浓度靶细胞 (人肝癌细胞系HepG2及人肺腺癌细胞系A5 4 9)中加入效应细胞 (DC或PBMC) ,4 8h后瑞氏染色计数残存细胞数 ,计算杀伤率。结果 :DC激活的CTL对HepG2 杀伤率为 71.6 % ,而PBMC(APC ,非T细胞 )激活的CTL杀伤率为 4 3.8% ,两者有显著性差异 ,P <0 .0 1。此外 ,DC诱导的肝癌细胞抗原特异性CTL对肺癌细胞的杀伤率仅为 2 3%。结论 :DC诱导的CTL比PBMC高效 ,而且具有较高的特异性。     

人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞的体外肿瘤杀伤实验

目的:探讨人肝癌细胞总RNA电转染人树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)后诱导特异性效应T细胞及其效应T细胞抗肝癌的特异性.方法:通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,采用细胞因子体外培养诱导其成为未成熟树突状细胞(Immature Dendritic Cell,imDC)和成熟树突状细胞(Mature Dendritic Cell,mDC).培养肝癌细胞,Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA.通过电转染法将人肝癌细胞总RNA导入imDC内;观测电转染的转染率;采用免疫细胞化学检测电转染前后的imDC形态及其表面标志;通过混合淋巴细胞实验,获取mDC激活的特异性效应T细胞.用MTT法测定效应T细胞的抗肝癌特异性.结果:电转染方法可将人肝癌细胞总RNA导入imDC.电转染前后imDC分子表达无显著差异,mDC的分子表达与imDC相比发生了变化.转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞.效应T细胞可特异性的杀伤人肝癌细胞,而对不相关的MG-63细胞无特异性的杀伤作用.结论:电转染不影响imDC的形态和原有的蛋白表达;转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞;效应T细胞具有抗人肝癌细胞的特异性.     

肿瘤浸润性淋巴细胞的体外培养及对肿瘤细胞的杀伤作用

目的：观察肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）体外扩增速度及对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：肿瘤组织经处理后，用淋巴细胞分离液可分离得到ＴＩＬ，用含ｒＩＬ２的完全培养基培养ＴＩＬ，并作ＴＩＬ对肿瘤细胞的杀伤率。结果：培养４０ｄ的黑色素瘤ＴＩＬ，扩增达９７７３倍。ＴＩＬ对黑色素瘤、卵巢囊腺癌、大网膜转移性腺癌和癌性腹水等自体瘤细胞的效靶比例为４０∶１时，培养１５ｄ的ＴＩＬ对肿瘤细胞的杀伤作用明显高于２０∶１；当效靶比例相同（２０∶１）时，培养２０ｄ的ＴＩＬ对肿瘤细胞的杀伤作用高于１５ｄ，而在４０∶１时培养２０ｄ与１５ｄ的杀伤率无差别。ＴＩＬ对Ｋ５６２肿瘤细胞株也有较强的杀伤作用。结论：ＴＩＬ在含ｒＩＬ２的完全培养基中可大量扩增，ＴＩＬ对肿瘤细胞的杀伤作用与效靶比例及培养时间有关。     

肝癌患者自体细胞因子诱导杀伤细胞治疗后免疫活性细胞的检测及其临床意义

目的　观察肝癌患者自体细胞因子诱导杀伤细胞 (CIK细胞 )回输后 ,外周血中T细胞亚群及树突状细胞亚群的变化 ,评价CIK细胞治疗肝癌的临床效果。方法　采用成份血采血机采集13例肝癌患者的外周血单个核细胞 (PBMC) ,经多种细胞因子诱导后 ,于培养的第 4、7、10、13、15天流式细胞仪检测细胞表型 ;CIK细胞回输前及回输后取病人外周血 ,流式细胞仪测定Ⅰ型树突状细胞(DC1)和Ⅱ型树突状细胞 (CD2 )的比例。结果　诱导培养后 ,CD3+ CD8+ ,CD3+ CD5 6 + ,CD2 5 + 效应细胞的比例明显升高 ,分别由最初的 33 5 %± 10 1%、7 7%± 2 8%和 12 3%± 4 5 % ,上升至 36 6 %±9 0 %、18 9%± 6 9%和 16 4 %± 5 9% ,其中CD3+ CD8+ 可维持较高水平 ,CD2 5 + 和CD3+ CD5 6 + 比例分别于培养后的第 7天和第 13天开始下降。CD3+ CD4 + 和NK细胞比例略有下降 ,但差异无显著意义。CIK细胞回输后DC1和CD2细胞亚群的比例明显升高 ,分别由回输前的 0 5 9%± 0 2 3%和0 2 6 %± 0 12 %上升至回输后的 0 85 %± 0 2 7%和 0 4 3%± 0 2 0 %。CIK细胞治疗后患者临床症状明显改善 ,无明显副作用。结论　CIK细胞治疗可以提高肝癌患者的细胞免疫功能 ,提高对肿瘤细胞的杀伤作用。     

人实体瘤肿瘤浸润淋巴细胞的高效扩增及功能评价

目的体外高效扩增肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ），为进一步开展基因治疗肿瘤奠定基础。②方法采用机械分离、酶消化和不连续密度梯度离心法分离提取ＴＩＬ前体细胞；以ＩＬ－２作为诱导剂，采用液相三步扩增方法扩增培养，并分别用ＭＴＴ和ＩＦＡ法与对照的自体ＬＡＫ细胞比较细胞动力学。同时对Ｋ５６２细胞和自体肿瘤细胞（ＡＴＣ）进行杀伤试验以及表型检测。③结果从２８例实体瘤组织和肿瘤引流淋巴结中获取的ＴＩＬ前体细胞，２６例培养成功，其中２３例ＴＩＬ数量达到治疗数量级；ＴＩＬ细胞对ＡＴＣ杀伤作用强于自体ＬＡＫ细胞（ｔ＝１１．４，１８．９，Ｐ＜０．０１）。ＴＩＬ细胞表型特点为ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８淋巴细胞亚群。④结论ＴＩＬ细胞具有高效杀肿瘤细胞作用，ＴＩＬ细胞可作为基因治疗的理想载体细胞。     

肝癌瘤苗激活的TIL在体外抗肿瘤活性的研究

目的：为了提高肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）的抗瘤活性。方法：使用肝癌瘤苗来激活ＴＩＬ，观察其抗瘤活性的改变。结果：经瘤苗激活的ＴＩＬ在培养护增１０、２０、３０和４０ｄ的体外对自体肝癌细胞的杀伤率均有明显提高，其中以培养扩增３０ｄ时为最高。结果：经肝癌瘤苗激活的ＴＩＬ具有更高的体外杀伤自体肝癌细胞的能力。     

大肠癌手术切除并用肿瘤浸润淋巴细胞治疗的临床研究

对１４例大肠癌患者进行切除手术并用肿瘤浸润淋巴细胞（ｔｕｍｏｒｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ＴＩＬ）免疫治疗，经临床应用研究显示，手术切除并用ＴＩＬ免疫治疗能使患者在提高机体免疫功能的基础上明显增强了抗癌消瘤能力。     

恶性肿瘤胸腹水中TIL的体外扩增及抗肿瘤作用

①目的探讨恶性肿瘤胸腹水中肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）的体外诱导扩增及其抗肿瘤作用。②方法用不连续密度梯度离心法从９例癌性胸水和６例癌性腹水中提取ＴＩＬ进行体外诱导培养，同时用ＭＴＴ单波长比色法测定ＴＩＬ的活性。③结果ＴＩＬ对自体肿瘤靶细胞的杀伤活性达７６％以上，且呈现一定的靶细胞特异性，体外扩增可达１１００倍。④结论ＴＩＬ对肿瘤细胞有明显的杀伤活性，其活性高峰期在诱导培养的７～１５ｄ．     

CD3 AK细胞与LAK细胞的诱导和体外杀伤活性的比较

目的：探讨CD3AK细胞与LAK细胞的诱导、增殖动力学和杀伤活性的变化。方法：采用抗CD3单克隆抗体（anti-CD3McAb)和rIL-2及PHA（植物血凝素）共刺激法诱生扩增CD3AK细胞,用等量rIL-2 t PHA共刺激法诱生LAK细胞。观察它们的增殖动力学变化;用MTT法以K562细胞和H7402细胞为靶细胞,测量CD3AK细胞和LAK细胞的杀伤活性。结果：微量的anti-CD3McAb辅以少量的rIL-2和PHA就能诱导和大量扩增CD3AK细胞,其扩增能力显著高于LAK细胞（P<0.001);CD3AK细胞对K562细胞和H7402细胞的杀伤活性显著高于LAK细胞（P<0.05)。结论：CD3AK细胞的扩增能力及杀伤活性均较LAK细胞为强,是更为有效的杀瘤效应细胞。     

应用肿瘤坏死因子基因转染肿瘤浸润淋巴细胞进行肝癌基因治疗的实验研究

目的：探讨转基因肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytem,TIL)治疗肝癌的价值。方法：用转基因技术将肿瘤坏死因子(TNF—α)基因导人人肝癌肿瘤浸润淋巴细胞，构建转基因TIL。用肝癌细胞株BEL7404注射裸鼠建立裸鼠肝癌移植瘤，用转基因TIL分原位及异位进行治疗，并用TIL作对照。结果：转基因TIL表现出较高的抑制肿瘤作用，对肿瘤的生成率、生长速度的抑制作用比未转基因TIL强。原位注射转基因TIL的抗肿瘤作用较强，优于异位注射治疗。结论：转基因TIL对裸鼠移植性肝癌的实验治疗具有较好作用，本研究为人肝癌的基因治疗研究提供依据。     

树突状细胞活化肝癌肿瘤浸润淋巴细胞抗瘤免疫的体外研究

目的　研究负载肿瘤抗原的树突状细胞 (DC)对原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)体外增殖和细胞毒作用的影响。方法　联合应用GM -CSF和IL - 4对原发性肝癌病人外周血分离的单核细胞进行体外诱导 ,加入自体癌细胞匀浆粗提物进行刺激 ,制备负载肿瘤抗原的DC后 ,与自体TIL在含有低浓度IL - 2的完全培养基中混合培养 ,计数TIL增殖数量 ,ELISA法检测培养上清中IFN -γ和TNF -α的含量 ,LDH法测定TIL对自体肝癌细胞、K5 6 2肿瘤细胞的细胞毒作用 ,与单纯在含有低浓度IL - 2的完全培养基中培养的TIL进行比较。结果　TIL在含低浓度IL - 2的完全培养基中与负载肿瘤抗原的DC混合培养 ,较单纯在含低浓度IL - 2完全培养基中培养增殖效果明显 (P <0 .0 1) ;分泌IFN -γ和TNF -α的量明显提高 (P <0 .0 1) ;对自体肝癌细胞的细胞毒作用显著性增强 (P <0 .0 1) ;两组TIL对自体肝癌细胞的细胞毒作用明显高于对K5 6 2肿瘤细胞的细胞毒作用 (P <0 .0 5 ) ,对K5 6 2肿瘤细胞的细胞毒作用无显著性差异(P >0 .0 5 )。结论　负载肿瘤抗原的DC与TIL混合培养 ,可增强TIL的抗肿瘤活性 ,且具有促增殖作用。