杂色曲霉素致人胚肺细胞p53及Ki-ras基因突变研究

为探讨中国恶性肿瘤高发区粮食中优势污染霉菌毒素－杂色曲霉素（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｃｙｓｉｎ,ＳＴ）的致癌作用,运用银染ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法分析了不同浓度的ＳＴ（１μｇ／ｍｌ和３μｇ／ｍｌ）对体外培养的人胚肺细胞恶性转化过程中抑癌基因ｐ５３第５、６、７、８显外子及癌基因Ｋｉ－ｒａｓ的突变情况。结果显示ＳＴ处理后第２２周,人胚肺成纤维细胞ｐ５３基因的第８外显子和Ｋｉ－ｒａｓ癌匀出现异常泳动带型,表明Ｓ     

Cr（VI）对人胚肺细胞p53及抑癌基因p21（WAF1）表达的影响

目的研究人类致癌物Ｃｒ（ＶＩ）对抑癌基因ｐ５３及其下游的抑癌基因ｐ２１（ＷＡＦ１）在多阶段致癌中的作用。方法采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术，观察不同浓度Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７对人胚肺细胞内ｐ５３及ＷＡＦ１表达的影响。结果Ｃｒ（ＶＩ）对ｐ５３表达的影响呈双相作用，０～１．２５０μｍｏｌ／Ｌ范围内Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７抑制ｐ５３的表达；１．２５０～５．０００μｍｏｌ／ＬＫ２Ｃｒ２Ｏ７可刺激ｐ５３的表达。ＷＡＦ１的变化趋势与ｐ５３相一致，即１．２５０μｍｏｌ／ＬＫ２Ｃｒ２Ｏ７可明显抑制ＷＡＦ１的表达，而随着Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７浓度的增加，ＷＡＦ１的表达也呈升高趋势。结论低剂量Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７影响下的ｐ５３及ＷＡＦ１的低表达可能在Ｃｒ（ＶＩ）多阶段致癌中起重要作用。     

膀胱癌中CDl5与p53、C-erbB-2和PCNA的表达及相关性研究

为研究ＣＤ１５、癌基因和抑癌基因蛋白产物在膀胱癌组织中的表达与病理分级、临床分期、复发和转移的关系,并探讨ＣＤ１５与癌基因和抑癌基因蛋白表达的相关性。应用微波－ＬＳＡＢ免疫组织化学法,检查５２例膀胱癌组织中ＣＤ１５、ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＢ－２和增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）的表达水平。结果显示在膀胱癌中ＣＤ１５、ｐ５３、ｅｒｂＢ－２和ＰＣＮＡ阳性表达率分别为６９．２％、４８．１％、３８．１％和５３．８％     

应用PCR-SSCP检测转化细胞中p53基因突变

利用化学致突变物甲基丙烯酸环氧丙酯体外诱导人胚肺成纤维细胞，使之发生转化，分离转化细胞克隆。经ＰＣＲ特异性扩增ｐ５３基因外显子第５和第８，银染单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析，结果表明转化细胞中ｐ５３基因外显子第８发生突变，揭示出ｐ５３基因在化学致突变物诱导细胞转化中起着重要作用。     

硒酸酯多糖对人乳腺癌细胞株（BCaP—37）生物学作用的研究

为探讨硒酸酯多糖的抗肿瘤机理，用细胞培养技术、图像细胞分析技术（ＩＣＭ）和ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ方法检测，经硒酸酯多糖作用后中国人乳腺癌细胞株（ＢＣａＰ－３７）的增殖、细胞周期、总ＤＮＡ含量、细胞核面积以及表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）、癌基因Ｃ－ｅｒｂＢ２ｍＲＮＡ的表达水平。结果发现，硒酸酯多糖（３．０～１２０ｍｇ／Ｌ）对ＢＣａＰ－３７增殖有抑制作用，且有时间和剂量依赖效应。经硒酸酯多糖（１５ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ）处理４天的细胞，在图像细胞分析反映细胞增殖能力的指标中，细胞核面积均显著低于对照组。６０ｍｇ／Ｌ硒酸酯多糖处理的细胞其ＥＧＦＲ、Ｃ－ｅｒｂＢ２ｍＲＮＡ表达水平受到明显抑制。提示硒酸酯多糖能抑制乳腺癌细胞增殖，其机理可能是对ＥＧＦＲ，Ｃ－ｅｒｂＢ２ｍＲＮＡ表达水平的调节。     

上皮性卵巢肿瘤C—myc与p53蛋白的表达及意义

用免疫组化ＬＳＡＢ方法检测５例正常卵巢组织和３５例卵巢肿瘤组织中的Ｃ－ｍｙｃ（原癌基因）和ｐ５３（抑癌基因）蛋白的表达水平。结果从良性卵巢腺瘤、交界性到恶性卵巢囊腺癌，Ｃ－ｍｙｃ和ｐ５３阳性表达呈增高趋势。其阳性表达率与卵巢肿瘤的细胞增殖状态、肿瘤分化及临床分期有关。检测卵巢肿瘤中Ｃ－ｍｙｃ及ｐ５３基因表达可了解卵巢囊腺癌的发生、发展，找出原癌基因及抑癌基因表达与卵巢瘤生物学行为间的关系。     

石棉相关肿瘤p53基因突变的免疫组化及PCR—SSCP研究

为了分析石棉相关肿瘤ｐ５３基因的突变特点，对石蜡包埋的石棉相关肿瘤ｐ５３基因突变体蛋白的表达进行了免疫组化观察，提取染色体ＤＮＡ，对ｐ５３基因的第５、７、８外显子进行ＰＣＲ－ＳＳＣＰ及测序分析。免疫组化观察发现：在分析的１０例病例中有５例阳性。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析发现７例（８处）发生突变，其中４处集中在第８外显子上。５例腺癌中有４例发生ｐ５３基因突变。测序发现热点区突变。提示：石棉相关肿瘤ｐ５３基因突变率高。     

产气荚膜梭菌β-毒素基因的克隆及CPB-ST融合基因的构建

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从Ｂ型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了９３０ｂｐ的β－毒素基因。用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ对ＰＣＲ产物进行双酶切处理，然后，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的载体质粒ｐＥＴ－２８Ｃ（＋）的多克隆位点，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切分析和ＰＣＲ扩增检测。证明重组质粒ｐＥＣＢ２中含有产气荚膜梭菌的β－毒素基因。经核苷酸序列分析，明确了克隆的β－毒素基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的。利用已构建的另一重组质粒ｐＸＳＴ１（带有肠毒素性大肠杆菌的耐热性肠毒素ＳＴ基因），通过ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切处理，将切下的ＳＴ基因片段定向连接到ｐＥＣＢ２重组质粒中ＣＰＢ基因的下游。经特定酶切分析鉴定，得到了理想重组子质粒ｐＥＣＢＳＴ１，ＣＰＢ－ＳＴ融合基因在重组质粒ｐＥＣＴ－ＳＴ１中的连接向位是正确的     

职业性肺癌中热应激蛋白70、热应激蛋白27与p53表达的相关性研究

目的探讨ＨＳＰｓ（ｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｐｒｏｔｅｉｎｓ）与抑癌基因在职业性肺癌（ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌｌｕｎｇｃａｎ－ｃｅｒ，ＯＬＣ）癌变过程中相互关系及其作用机制。方法采用免疫组化技术，观察了ＨＳＰ７０与ｐ５３在ＯＬＣ中的表达情况。结果ＯＬＣ中的ＨＳＰ７０表达较癌旁组织和正常肺组织高，且表达部位有一定特异性；ＯＬＣ中ＨＳＰ７０与ｐ５３有共同表达，显示两者在ＯＬＣ中的癌变过程中有联合作用。结论在ＯＬＣ的发生发展过程中ＨＳＰ７０与抑癌基因有着密切的内在联系     

用聚合酶链反应研究乙型肝炎病毒的灭活

建立测定乙肝病毒脱氧核糖核酸（ＨＢＶ ＤＮＡ）的聚合酶链反应－溴乙锭法（ＰＣＲ－ＥＢ），该方法特异性好，灵敏度为１ｐｇＨＢＶ ＤＮＡ，可能检出ＨＢＶ敏感动物黑猩猩的最小感染量。应用ＰＣＲ－ＥＢ法测定氯消毒剂对ＨＢＶ的灭活作用表明，有效氯１２５０ｍｇ／Ｌ作用６０分钟或２ ５００ｍｇ／Ｌ作用３０分钟可使１０倍ＰＣＲ灵敏度的纯化ＨＢＶ ＤＮＡ转阴；有效氯２ ５００ｍｇ／Ｌ作用３０分钟或１ ２５０ｍｇ／     

石蜡包埋的石棉肺癌组织中p53基因突变的分析方法

为了利用石蜡包埋的病理组织来研究石棉肺癌的基因突变情况，选用１０例石蜡包埋的石棉肺癌组织进行ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析，检测其抗癌基因ｐ５３的第５、第７和第８外显子的突变情况。经银染检查，发现４个病例的ｐ５３基因的第７或第８外显子片段呈突变阳性。用放射性自显影的ＰＣＲ－ＳＳ－ＣＰ方法分析这１０例病例，检测到７个病例的ｐ５３基因第７或第８外显子片段呈突变阳性。用两种方法检测均未发现这１０个病例的第５外显子呈突变阳性。银染ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测可检出放射性自显影ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析结果的６０％，二者的结果相符合。因而，简便、灵敏而且危害性小的银染检测方法，可以代替放射性自显影用于ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析，研究石棉肺癌的基因突变情况。     

丹皮酚对人大肠癌HT-29细胞bcl-2和bax基因表达的影响

目的探讨丹皮酚（Pae）对人大肠癌HT-29细胞的增殖抑制、凋亡诱导作用及可能的作用机制,为寻求大肠癌治疗的新策略提供理论依据。方法应用荧光显微镜和透射电镜技术观察不同浓度的Pae对HT-29细胞增殖的抑制及凋亡诱导作用;应用免疫细胞化学技术检测用药前后凋亡相关基因bcl-2、bax表达的变化。结果荧光显微镜及透射电镜观察到Pae作用后HT-29细胞出现典型的细胞凋亡形态;Pae在15.63 mg/L、62.5 mg/L、250 mg/L3种浓度下作用48 h均可诱导HT-29细胞凋亡;免疫细胞化学结果显示Pae作用后HT-29细胞bcl-2蛋白表达显著降低,bax蛋白表达无显著改变。结论Pae可抑制HT-29细胞增殖并诱导其凋亡,并呈现明显的剂量-效应关系和时间-效应关系,其作用机制可能与下调bcl-2/bax的表达比例有关。     

应用依赖随机化末端连接物聚合酶链反应技术研究重铬酸钾对大鼠肺p53基因DNA损伤

应用依赖随机化末端连接物PCR(RandomizedTerminalLinker-dependentPCR ,RDPCR)技术于体内试验的研究 ,从而检测特定基因的DNA损伤。腹腔注射重铬酸钾染毒大鼠 ,提取肺组织基因组DNA ,经p5 3基因外显子 7特异性引物P1重复直线延伸后与接头 (Linker)连接 ,用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR扩增 ,电泳、转印 ,再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果显示 ,在 2 0 .0mg kg和 40 .0mg kg剂量下 ,出现了两条清晰的杂交带 ,表明重铬酸钾可引起大鼠肺p5 3基因外显子 7的DNA损伤 ,且有两个损伤位点。此结果有助于进一步探讨六价铬化合物的致突变机制 ,同时也拓展了RDPCR技术在毒理学领域的应用     

Effects of propolis and CAPE on proliferation and apoptosis of McCoy-Plovdiv cell line

The mechanisms of action of propolis can be studied in detail by comparing the effects of propolis and the effects of its constituent components. AIM: To clarify and compare the effects of Bulgarian propolis and caffeic acid phenethyl ester (CAPE, a chemically synthesized component of propolis)--by using a set of cellular, molecular-biological and immunological techniques. MATERIAL AND METHODS: The McCoy-Plovdiv cell line was treated with propolis and CAPE in increasing concentrations (0.01, 0.1, 1.0, 10 mg/L, and 2.5, 4, 8, 16 mg/L, respectively). The expression of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and the tumour-suppressor protein p53 was studied immunocytochemically. Apoptosis was measured using a highly sensitive microgel electrophoresis technique (comet assay). RESULTS: The results of the study showed corresponding changes in the expression of the examined proliferative antigens. PCNA was detected in all examined concentrations of the tested substances the expression being dose-dependent. Molecule localization changed from the nucleus to the cytoplasm. Treatment with CAPE brought about gradual attenuation of PCNA expression. High propolis concentrations induced increased synthesis of p53. No p53 expression was found when cells were treated with CAPE. The studied substances in their highest concentrations (10 mg/L propolis and 16 mg/L CAPE) had a cytotoxic effect. The comet assay showed DNA degradation kinetics characteristic for apoptosis. CONCLUSIONs: The present study demonstrates that high concentrations of propolis and CAPE cause apoptosis-induced cell death in McCoy-Plovdiv cells.     

利用激光捕获显微分离技术和突变分析法检测肺癌病人痰细胞的K-ras和p53基因突变

[目的]探索激光捕获显微分离技术在检测肺癌病人K-ras和p53基因突变的应用。[方法]以3种不同的基因突变分析法对20例患者的痰细胞进行基因突变分析：①以PCR＋DGGE方法分析K—ras基因突变,以PCR＋SSCP方法分析p53基因突变;②以PCR十MAE＋DGGE方法分析K—ras基因突变;以PCR＋MAE＋SSCP方法分析p53基因突变;③以激光捕获显微分离技术和突变分析法检测肺癌病人痰细胞的K—ras和p53基因突变。[结果]在20例患者中,以现有的方法仅发现有15％（3／20）的基因突变,而激光捕获显微分离技术则发现有60％（12／20）的基因突变。[结论]激光捕获显微分离技术和突变分析法能高效灵敏检测肺癌病人痰细胞的K—ras和p53基因突变。     

应用RDPCR技术检测饮用水有机浓集物对大鼠p53基因的损伤作用

目的 运用依赖随机化末端连接物聚合酶链式反应(RDPCR)技术检测环境中混合污染物的DNA损伤作用。方法 将水样有机浓集物腹腔注射染毒SD大鼠,提取肝、肺、肾及白细胞的DNA,运用RDPCR技术检测其对大鼠p53基因外显子7的DNA损伤作用。结果 水样有机浓集物对大鼠的基因组DNA具有断裂作用;经RDPCR、杂交显色后在大鼠肝、肾组织中检测到了杂交条带,而血及肺组织中未检测到杂交条带。结论 RDPCR技术可成功地运用于检测环境混合污染物。水样有机浓集物对大鼠p53基因外显子7具有DNA损伤作用,其主要靶器官为肝和肾。     

Dietary selenium and arsenic affect DNA methylation in vitro in Caco-2 cells and in vivo in rat liver and colon

Selenium is an essential trace element for human health, and it has received considerable attention for its possible role as an anticarcinogenic agent. The purpose of the present study was to determine whether changes in the amount and the chemical form of selenium would affect DNA methylation and whether this effect would be modified by arsenic. Caco-2 cells, a human colon cancer cell line, were exposed to 0, 1 or 2 micromol supplemental selenite/L and 0, 1 or 2 micromol supplemental arsenite/L for 7 d. DNA isolated from Caco-2 cells not treated with selenite was significantly (P: < 0. 0001) hypomethylated compared with that from cells treated with 1 or 2 micromol selenite/L. DNA isolated from Caco-2 cells not treated with arsenite was significantly (P: < 0.0001) hypomethylated compared with DNA isolated from cells treated with 1 or 2 micromol arsenite/L. In addition, methylation of the p53 promoter region of Caco-2 cells decreased when cells were cultured in the absence of selenite and in the absence of arsenite. Sixty weanling male Fischer 344 rats were fed a torula yeast-based diet supplemented with 0, 0.1 or 2 mg selenium/kg diet as either selenite or selenomethionine in the presence or absence of 5 mg arsenic/kg diet as arsenite for 6 wk. Similar to the results with Caco-2 cells, rats fed selenium-deficient diets had significantly (P: < 0.0001) hypomethylated liver and colon DNA compared with rats fed 0.1 or 2.0 microg selenium/g diets as either selenite or selenomethionine. Thus, alterations in DNA methylation may be a potential mechanism, whereby deficient dietary selenium increases liver and colon tumorigenesis.     

辛硫磷对大鼠骨髓间充质干细胞DNA损伤、细胞凋亡及P53蛋白表达的影响

目的研究辛硫磷对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)DNA的损伤作用及其对氧化损伤、细胞凋亡和P53蛋白表达的影响。方法 Percoll离心法分离培养大鼠BMSCs,正常传代。取第3代BMSCs,调整细胞密度为1.0×106/瓶,当细胞至亚融合状态,分别以0(对照)、0.2、2和20μg/L的辛硫磷浓度染毒24h。采用MTT法检测BMSCs的存活率,分光光度比色法检测BMSCs超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,单细胞凝胶电泳检测BMSCs的DNA损伤,流式细胞术检测大鼠骨髓间充质干细胞凋亡率,Western blotting检测BMSCs的P53蛋白表达水平。结果与对照组相比,0.2～20μg/L辛硫磷染毒24h,可诱发大鼠BMSCs的DNA损伤,且具有剂量-效应关系;各染毒组大鼠BMSCs的存活率、SOD和CAT活性均显著下降(P<0.05),细胞凋亡率和MDA含量均显著升高(P<0.05);辛硫磷染毒可以诱导大鼠BMSCs P53蛋白表达水平的增加(P<0.05)。结论辛硫磷可诱导大鼠BMSCs氧化损伤、DNA损伤、细胞凋亡和P53蛋白表达,且具有剂量-效应关系。     

饮水中有机致突物对小鼠体细胞遗传损伤的分子机制研究

通过居家饮水中提取的有机浓缩物亚急性染毒小鼠后,在动物肝、肾、肠组织观察到显微病理及超微病理学变化;各实验组小鼠胸骨骨髓嗜多染红细胞微核率高于阴性对照组。用PCR- SSCP方法可检出高剂量组肝、肾、肠组织DNA p53基因点突变,尤以第7外显子突变频率较高。提示用分子生物学技术研究饮水有机致突物在实验小鼠体内遗传毒性机制的可行性