Notch配体Delta1对人牙髓干细胞分化的影响

目的:探讨Notch配体Delta1对体外人牙髓干细胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)向成牙本质细胞分化能力的影响。方法:利用逆转录病毒载体建立高表达人Delta1基因的人牙髓干细胞系;实验分三组,正常牙髓干细胞组、转导细胞组及混合组(正常与转导细胞比例为100∶1),分别进行体外分化诱导。倒置显微镜观测各组细胞各生长期出现的时间;VonKossa染色计数各组形成钙化结节数;Westernblot法检测各组细胞牙本质涎磷蛋白表达。结果:与正常牙髓干细胞相比,转导细胞各生长期出现时间明显提前,形成的钙化细胞结节数目显著增加,牙本质涎磷蛋白表达显著升高。结论:Delta1基因转导牙髓干细胞仍保持了体外向成牙本质细胞分化的能力;Notch-Delta1信号与分化诱导因子协同作用可促进人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化。     

Notch信号通路在牙髓干细胞增殖和分化中的调控作用

Notch信号通路是进化过程中高度保守的信号转导机制,通过细胞与细胞间的相互作用控制细胞的命运。牙髓干细胞是一种具有高度增殖和多向分化潜能的成体干细胞,在组织再生中发挥重要作用。该文就该信号通路的组成及其对牙髓干细胞调控的分子机制作一综述。     

Notch配体Delta-1对人牙髓干细胞体外增殖的影响

目的:探讨Notch配体Delta-1对人牙髓干细胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)体外增殖活性的影响。方法:用Delta-1-EGFP重组逆转录病毒感染培养的人牙髓干细胞,获得稳定高表达人Delta-1蛋白的人牙髓干细胞系;利用CFU-F计数、四唑盐(MTT)比色法及流式细胞仪等方法检测Delta-1基因转导人牙髓干细胞的克隆形成率、细胞生长曲线和细胞周期变化。结果:与正常牙髓干细胞相比,Delta-1转导人牙髓干细胞的CFU-F计数为62～89clones/103cell,约为前者的10倍;接种1～7d,转导细胞的活细胞数量增加显著;S期细胞比例及增殖指数,分别从转导前的20.6%和35.8%提高到63.8%和75.7%。结论:Notch配体Delta-1可显著促进人牙髓干细胞的体外增殖,Notch-Delta-1信号转导途径在人牙髓干细胞的自我更新中起重要作用。     

人恒牙牙髓干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的:研究人恒牙牙髓组织来源的牙髓干细胞在体外分化为成骨细胞的能力,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙中分离牙髓组织,应用酶消化法获得牙髓细胞.单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞,第3代牙髓干细胞用成骨向诱导培养基向成骨细胞诱导分化.用碱性磷酸酶染色和Vo...     

人牙髓细胞条件培养液对人牙囊细胞成骨分化作用的体外研究

目的:探索人牙髓细胞条件培养液(HDPSCs-CM)对人牙囊细胞(HDFSCs)向成骨分化的作用.方法:利用胶原酶消化法获得HDFSCs,经纯化鉴定后培养于HDPSCs-CM中;CCK-8检测HDFSCs增殖活性,观察细胞形态改变;碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红S染色定性分析细胞成骨能力的改变.qRT-PCR检测HDFSCs中骨膜蛋白(POSTN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)以及骨桥蛋白(OPN)的mRNA表达情况.结果:经HDPSCs-CM诱导后,HDFSCs形态发生成牙骨质或成骨样改变;诱导组HDFSCs增殖活性受到明显抑制(P<0.05或P<0.01);诱导组ALP染色强于对照组,茜素红S染色矿化结节多于对照组;诱导组POSTN、Col-Ⅰ、ALP、BSP、OPN的表达量明显增高(P<0.05或P<0.01).结论:HDPSCs-CM能促进HDFSCs成骨分化.     

Effects of Notch ligand Delta1 on the proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells in vitro

Objective

Notch signalling controls cell fate decisions in adult and embryonic tissues. The Notch ligand Delta1 is known to influence proliferation and differentiation of many kinds of tissue specific stem cells. In the present study, we investigated the role of Delta1 in the regulation of dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro.

Methods

DPSCs were isolated from impacted third molars. Expression of human Notch1, 2 and Delta1 in DPSCs were detected by immunochemistry. Delta1 overexpressed DPSCs were constructed by a retroviral method. Delta1 transduced DPSCs proliferation changes were examined by means of colony-forming assay, BrdU incorporation assay and cell cycle analysis. Delta1 transduced DPSCs were cultured in differentiation-inductive medium. The nodule formation and DSPP expression were evaluated.

Results

It was shown that the Notch receptors and Delta1 ligand were expressed throughout the proliferation and differentiation process of cultured dental pulp stem cells. Furthermore, it was found in our study that Delta1 could significantly enhance the proliferation of DPSCs and permit DPSCs differentiating into odontoblast-like cells in differentiation-inductive environments.

Conclusions

Our findings verified that Notch-Delta1 signalling was expressed in human DPSCs in vitro and appeared to play pivotal role in DPSCs proliferation enhancement and differentiation regulation, thereby consistent with the hypothesis that the Notch pathway controls stem cell fate during pulp regeneration.     

人恒牙牙髓干细胞分化为脂肪细胞的体外实验研究

目的验证人恒牙牙髓组织来源的牙髓干细胞在体外向脂肪细胞的定向分化,并对分化后的细胞进行鉴定。方法从正畸治疗减数拔除的恒前磨牙中分离牙髓组织,应用酶消化法获得牙髓细胞。单抗Stro-1标记、免疫磁珠阳性分选系统分选获得牙髓干细胞,第3代牙髓干细胞用成脂肪向诱导培养基向脂肪细胞诱导分化。用油红O染色鉴定成脂肪向分化,RT-PCR检测脂肪细胞的特异相关或标志基因。以同期培养的未诱导的普通培养基培养的DPSCs做阴性对照;以同期培养的骨髓间充质干细胞成脂肪向分化的结果做阳性对照。结果人恒牙牙髓干细胞经成脂肪向培养基诱导后表现出脂肪细胞特性,油红O染色结果为阳性,RT-PCR检测成脂肪向分化相关基因过氧化物酶增殖物激活受体γ2、脂肪酶结合蛋白aP2和脂蛋白脂酶均有阳性表达。结论人恒牙牙髓干细胞在体外具有分化为脂肪细胞的潜能。     

GLUD1基因对人牙髓干细胞的体外增殖、分化和矿化的影响

目的:探索谷氨酸脱氢酶1 (Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1)基因在人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hPDCSs)体外增殖、成骨分化和矿化中的作用.方法:体外分离培养hPDCSs,利用慢病毒感染方式沉默GLUD1基因的表达,分别采用RT-PCR和Western免疫印迹检测mRNA及蛋白水平的沉默效率.采用CCK8法检测细胞的体外增殖水平.对hDPSC进行体外成骨诱导分化培养,采用茜素红染色法检测矿化结节的形成,利用RT-PCR和免疫荧光染色分别检测Runx2、OCN基因的表达.采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析.结果:hDPSCs经过成骨诱导分化培养后,GLUD1的表达量较对照组明显上升;hDPSCs经shGLUD1病毒转染后,GLUD1表达明显下调;沉默GLUD1表达的hDPSCs体外增殖能力减弱;经成骨诱导分化培养后,与对照组相比,矿化结节形成明显减少;成骨早期标志基因Runx2上调,成骨晚期标志物OCN在mRNA和蛋白水平均显著下调.结论:沉默GLUD1表达抑制hDPSCs的体外增殖和矿化形成,影响晚期成骨分化;GLUD1在hDPSCs的成骨分化中具有重要作用.     

体外持续培养对人牙髓细胞分化能力的影响

目的：探讨人牙髓细胞在体外持续培养时，其分化能力的变化趋势。方法：体外持续培养人牙髓细胞，检测不同代次细胞的碱性磷酸酶活性、钙化能力及Ⅰ型胶原表达，并对比分析。结果：随着体外培养细胞代次的增多，在同等刺激分化条件下，人牙髓细胞的碱性磷酸酶活性整体呈下降趋势，钙化结节的数目和面积逐渐减少，Ⅰ型胶原表达合成逐渐减少。结论：人牙髓细胞在体外持续培养时，分化能力逐渐下降，可能与其含有的未分化细胞（人牙髓干细胞）数目逐渐减少有直接关系。     

瘦素对人牙髓干细胞增殖及分化的影响

目的 探讨瘦素(leptin)对体外培养的牙髓干细胞增殖、分化的影响.方法 体外培养牙髓干细胞,采用MTT法及流式细胞技术检测不同浓度瘦素对牙髓干细胞增殖作用的影响,通过碱性磷酸酶、Yon Kossa染色及矿化相关蛋白(DSP、OCN)的免疫组化染色来检测瘦素对牙髓干细胞分化的影响.结果 瘦素对牙髓干细胞增殖没有显著作用,但是对牙髓干细胞的ALP活性呈浓度依赖性促进.Von Kossa染色可见矿化结节形成,DSP及OCN表达阳性.结论 瘦素可促进牙髓干细胞向成牙本质细胞分化.     

miR-103对牙髓干细胞增殖及其向成牙本质细胞分化的影响

目的:探讨miR-103对牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的影响.方法:从即刻拔除的成入第三磨牙中分离培养人牙髓干细胞,将培养的细胞分为对照组、miRNA阴性对照组、miR-103过表达组和miR-103降低表达组,利用CCK-8法检测人牙髓细胞的增殖能力变化,利用q-PCR和Western Bolt技术检测人牙髓细胞中R...     

DLX3 mutation negatively regulates odontogenic differentiation of human dental pulp cells

ObjectivesThe purpose of this study was to investigate the role of a novel mutant DLX3 on the odontogenic differentiation of human dental pulp cells (hDPCs) in tricho-dento-osseous (TDO) syndrome.DesignhDPCs were obtained from the healthy premolars, stably-expressing wild-type DLX3 (WT), novel mutant DLX3 (Mu) and control vector (NC) cells were generated using recombinant lentiviruses. The proliferation rates of WT-hDPCs and Mu-hDPCs were measured by CCK8 assay. Odonto-differentiation of hDPCs was assessed by alkaline phosphatase (ALP) activity assay, and mineralization ability was assessed by Alizarin red staining. Odontogenic markers, including DMP-1, DSPP, Nes, ALP, and DLX5, were analyzed using real-time polymerase chain reaction (qPCR). DMP-1 and DSPP expressions were further confirmed by Western blotting.ResultsCCK8 results showed that the novel mutant DLX3 decreased the proliferation rate of hDPCs compared with wild-type DLX3. qPCR showed that the novel mutant DLX3 weakened odontogenic differentiation by downregulating the expression of odontogenic genes. These results were further confirmed by Western blotting and ALP activity assay. Additionally, Alizarin red staining showed that the novel mutant DLX3 decreased the mineralization of hDPCs compared with wild-type DLX3.ConclusionsNovel de novo mutation of DLX3 significantly decreases the proliferation rate and inhibits the odontogenic differentiation and mineralization of hDPCs, suggesting that this novel mutation of DLX3 can influence the dentinogenesis in TDO syndrome.     

组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞成牙本质向分化的影响研究

目的研究组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成牙本质向分化的影响。方法原代分离培养DPSCs,用流式细胞术和茜素红染色鉴定DPSCs。体外诱导DPSCs成牙本质向分化不同时间(0、3、5、7、14 d),qRT-PCR检测Jmjd3及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)的表达情况。用不同浓度(0、1、10μmol/L)的Jmjd3抑制剂GSK-J4处理DPSCs 14 d,q RT-PCR检测DSPP、DMP1的表达情况。结果原代培养的DPSCs表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD29、CD146,体外诱导培养具有成骨分化潜能。DPSCs成牙本质向分化过程中,Jmjd3、DSPP、DMP1表达水平均上调(P<0.05),且可能具有时间依赖性。10μmol/L GSK-J4处理DPSCs可明显抑制DSPP、DMP1的表达(P<0.05)。结论Jmjd3在DPSCs成牙本质向分化过程中发挥正调节作用,且与其去甲基化酶活性相关。     

牙髓干细胞分化过程中L型钙离子通道羧基末端的表达

目的:探讨牙髓干细胞(DPSCs)分化过程中L型钙离子通道羧基末端的表达。方法:利用酶消化法体外分离、培养大鼠牙髓干细胞;吉姆萨染色法检测大鼠牙髓干细胞的克隆形成能力;神经诱导体系下诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化,免疫荧光染色检测细胞分化后胶质纤维酸蛋白(glial fibrillary acidic pro-tein,GFAP)的表达和细胞分化前后L型钙离子通道Cav 1.2及羧基末端的表达。结果:牙髓干细胞的克隆形成能力为每1 000个细胞形成2～17个克隆;免疫荧光染色检测诱导后细胞GFAP表达阳性;免疫荧光染色检测显示:牙髓干细胞分化前L型钙离子通道Cav 1.2羧基末端表达于细胞膜上,细胞分化后羧基末端同时表达于细胞膜上和细胞核中。结论:L型钙离子通道Cav 1.2羧基末端在牙髓干细胞分化过程中发生核转位,羧基末端可能在牙髓干细胞的分化过程中发挥着一定的作用。     

釉基质蛋白（EMPs）对大鼠牙髓干细胞体外增殖、分化能力的影响

目的：研究釉基质蛋白（Enamel Matrix Proteins,EMPs）对大鼠牙髓干细胞（rat Dental Pulp Stem Cells,rDPSCs）体外增殖分化能力的影响。方法：酶消化培养法获得大鼠牙髓干细胞,有限稀释法分离纯化大鼠牙髓干细胞,形态学观察,计算细胞克隆形成率。乙酸法制备EMPs,用不同浓度的EMPs进行诱导,利用四唑盐比色法（MTD检测和分析诱导后细胞增殖活性的变化。检测诱导后培养液中的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）。免疫组化染色和RT-PCR方法检测牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein,DSP）、牙本质基质蛋白1（dentin matrixprotein 1,DMP—1）和牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphopmtein,DSPP）的mRNA表达。结果：大鼠牙髓干细胞呈集落状生长,在体外具有一定的克隆形成能力。EMPs对大鼠牙髓干细胞的增殖有促进作用,并呈现剂量和时间依赖性。200gg／ml EMPs组可显著促进大鼠牙髓干细胞的增殖。EMPs作用组能显著提高大鼠牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性。经细胞因子刺激后细胞表达DSP、DMP-1蛋白和DSPP mRNA。结论：EMPs在大鼠牙髓干细胞增殖和向成牙本质细胞分化方面具有积极的作用。     

干细胞表面标志物在牙髓干细胞中的表达

目的:探讨磁珠分选后培养的人牙髓干细胞的表面标记抗原随培养代数增加的变化情况。方法:改良组织块法培养的人牙髓细胞,至第2代（P2）时,用磁珠方法分选出STRO-1阳性细胞,用流式细胞术分别检测P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8代的干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105、 CD166、STRO-1。取P3代细胞,分别进行成骨诱导和成脂诱导。21 d后,分别行茜素红染色和油红O染色,观察矿化物形成情况和脂滴形成情况,同时以未诱导细胞为对照。结果:STRO-1在牙髓干细胞表面随代数增加而下降,CD73、CD90、CD105、 CD166的表达比较稳定,茜素红染色可见矿化结节形成,油红O染色显示形成大量脂滴。结论:STRO-1在牙髓干细胞表面随代数增加而下降,其他干细胞标志物比较稳定。