hBMP9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的内源性表达

目的:研究人骨形态发生蛋白(Human bone morphogenetie protein,hBMP)9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的内源性表达,为下一步研究hBMP9对骨肉瘤的体内外作用奠定实验基础.方法:利用免疫细胞化学法和Western blot法检测hBMP9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的内源性表达.结果:在MG63、U2OS和143B中,hBMP9均呈不同程度的阳性表达,并且两种检测方法所得结果一致.结论:hBMP9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中均有内源性表达.     

人骨形态发生蛋白2，3，6，12对大鼠骨肉瘤 细胞株UMR106的作用

目的：研究人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic proteins, hBMP）对大鼠骨肉瘤细胞株UMR106的作用。方法：用hBMP2,3,6,12重组腺病毒（AdBMP2,3,6,12）干预大鼠骨肉瘤细胞株UMR106,利用台盼蓝拒染法、TUNEL法、吖啶橙/溴乙啶（AO/EB）荧光双染法、Transwell小室和碱性磷酸酶活性测定法分别检测细胞增殖、凋亡、迁移以及成骨分化能力的变化。结果：与空白对照组和实验对照组比较,AdBMPs的干预致骨肉瘤细胞株细胞存活率降低,并呈一定的时间依赖性;凋亡率均随时间延长而增加,并且TUNEL和 AO/EB两种检测方法的结果一致;3个检测时间点的细胞穿膜数均明显减低;碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性在干预第3天开始逐渐增加,至第9天仍可观测到,以上差异均有统计学意义(P＜0.01)。结论：以腺病毒介导基因转入的作用方式,hBMP2,3,6,12可以抑制大鼠骨肉瘤细胞株UMR106的增殖和迁移,并诱导其凋亡和向成骨细胞分化。     

人骨形态发生蛋白-2基因腺病毒载体异位成骨

目的：评价人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)基因腺病毒表达载体(recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene, AdBMP-2)成骨能力并探讨其成骨机制。方法：应用 AdBMP-2体外感染兔骨髓间质干细胞（BMSC），7 d后观察hBMP-2和碱性磷酸酶(ALP)的表达,21 d后观察感染细胞钙结节形成能力。同时将AdBMP-2行裸鼠腓 肠肌组织内注射，术后20 d取材，观察hBMP-2的表达及肌组织内异位成骨情况。结果：AdBMP-2可高效感 染BMSC并获得hBMP-2的有效表达，ALP表达增高并形成钙结节。AdBMP-2在体内同样表达hBMP-2， 并且以软骨化骨的方式启动成骨。结论：感染AdBMP-2的BMSC向成骨细胞分化，AdBMP-2在体内有着良好的成骨能力。     

Inhibition of nordihydroguaiaretic acid on adhesion,migration and invasion of osteosarcoma cell

目的 研究去甲二氢愈创木酸(NDGA)对骨肉瘤MG63细胞株黏附、迁移和侵袭特性的影响,并初步探讨其相关机制.方法 不同浓度的NDGA处理MG63 细胞,用CCK-8法、细胞划痕试验和Transwell小室模型分别测定其黏附力、迁移力和侵袭力,Western blot法检测MG63细胞基质金属酶(MMPs)表达量的变化.结果 NDGA明显抑制骨肉瘤MG63细胞株黏附、迁移和侵袭力(P<0.05);NDGA抑制MG63细胞的黏附、迁移和侵袭力呈剂量依赖性;Western blot检测表明MG63细胞MMP-2和MMP-9 的表达明显下调.结论 NDGA可抑制骨肉瘤MG63细胞的体外黏附,迁移和侵袭,这种抑制效应可能是通过减少骨肿瘤细胞MMP-2和MMP-9的表达来实现.     

去甲二氢愈创木酸抑制骨肉瘤细胞黏附、迁移和侵袭

目的研究去甲二氢愈创木酸(NDGA)对骨肉瘤MG63细胞株黏附、迁移和侵袭特性的影响,并初步探讨其相关机制。方法不同浓度的NDGA处理MG63细胞,用CCK-8法、细胞划痕试验和Transwell小室模型分别测定其黏附力、迁移力和侵袭力,Western blot法检测MG63细胞基质金属酶(MMPs)表达量的变化。结果 NDGA明显抑制骨肉瘤MG63细胞株黏附、迁移和侵袭力(P<0.05);NDGA抑制MG63细胞的黏附、迁移和侵袭力呈剂量依赖性;Westernblot检测表明MG63细胞MMP-2和MMP-9的表达明显下调。结论 NDGA可抑制骨肉瘤MG63细胞的体外黏附,迁移和侵袭,这种抑制效应可能是通过减少骨肿瘤细胞MMP-2和MMP-9的表达来实现。     

β-catenin降低外源性hS100A6对骨肉瘤细胞的抑制作用

目的 研究外源件hS100A6抑制骨肉增细胞作用与Wnt/β.catenin信号途径的关系.方法 用携带人β-catenin及其siRNA基因的重组腺病毒Adβ-catenin和AdSiβ-catenin分别上调和下调MG63和U2OS细胞中β-catenin水平,再用重组hS100A6处理这些细胞,然后通过MTT法检测细胞增殖能力的变化,Hochest染色法检测细胞凋亡的变化,划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞迁移能力的变化.结果 ①外源性hS100A6抑制2株骨肉瘤细胞的增殖(P<0.05);β-catenin过表达和低表达则分别减弱和增强hS100A6对这2株细胞的增殖抑制作用(P<0.05);②外源性hS100A6促进2株骨肉瘤细胞的凋亡(P<0.05);β-catenin过表达和低表达则分别增强和减弱hS100A6对这2株细胞的促凋亡作用(P<0.05);③外源性hS100A6抑制骨肉瘤细胞株MG63的迁移(P<0.05);β-catenin过表达和低表达则分别减弱和增强hS100A6对MG63的迁移抑制作用(P<0.05).结论 β-catenin负性调节hS100A6对骨肉瘤的抑制作用;hS100A6对骨肉瘤的抑制作用可能经由Wnt信号途径及其他信号途径共同调控.     

抑癌基因IDH1在骨肉瘤中的表达

目的:探讨IDH1和P53基因在入骨肉瘤MG63、U2OS细胞株及病理组织标本中的表达及其与骨肉瘤组织临床病理学特征之间的关系.方法:培养入骨肉瘤细胞MG63、U2OS,以Western Blot法检测MG63、U2OS细胞中IDH1、P53蛋白的表达情况;以免疫组织化学染色法检测44例骨肉瘤临床病理标本中IDH1、P...     

激活素A和卵泡抑素对MG-63细胞株OCN、BMP-2蛋白表达的影响

目的 探讨激活素A (activin A)和卵泡抑素(follistatin,FS)对骨肉瘤细胞株(MG-63)骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨形态形成蛋白-2(BMP-2)蛋白质表达的影响以及骨形成作用.方法 采用细胞培养结合Western blot检测,观察不同浓度激活素A以及加用卵泡抑素后对MG-63细胞OCN、BMP-2蛋白质表达的影响,并采用PNPP底物比色法检测MG-63细胞的碱性磷酸酶含量.结果 激活素A明显上调MG-63细胞OCN、BMP-2蛋白质表达(P＜0.05),随着激活素A剂量增加以及作用时间延长,OCN、BMP-2蛋白质表达量逐渐加大,并促进碱性磷酸酶的生成,但加用卵泡抑素后该作用得到抑制.结论 激活素A上调OCN、BMP-2蛋白质表达及促进骨形成,而卵泡抑素抑制该效应.     

MicroRNA-638在骨肉瘤中表达下调及对其细胞增殖的影响

目的 探讨miR-638在人骨肉瘤(OS)细胞增殖行为中的影响。方法通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miRNA-638在人OS组织及癌旁组织、人OS细胞株(MG63、U2OS、HOS、SaOS2)和正常人成骨NHOst细胞株中的表达;用LipofectamineTM 2000转染miR-638模拟物或抑制物,细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)检测转染后的吸光光度值,平板克隆形成实验检测菌落数量。结果miR-638在各组细胞中均有表达;OS细胞株中miR-638的表达明显下调(P＜0.05);高表达miR-638能抑制OS MG63和U2OS细胞的增殖(P＜0.05)。 结论miR-638高表达能抑制OS细胞的增殖。     

二甲双胍抑制骨肉瘤MG63细胞的迁移和侵袭能力

目的 观察二甲双胍对骨肉瘤MG63细胞的迁移侵袭能力的影响.方法 以骨肉瘤MG63细胞株为研究对象,二甲双胍处理后分别采用transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力的变化,采用明胶酶谱实验检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的活性,采用real-time PCR法检测细胞中埃兹蛋白(Ezrin) mRNA的表达,采用Western blot检测Ezrin蛋白的表达;Li-pofectamine 2000转染Ezrin质粒到细胞中观察其对二甲双胍诱导的细胞迁移侵袭抑制及对下游信号通路的影响.结果 二甲双胍可显著抑制MG63细胞的迁移和侵袭,并降低MMP-2和MMP-9的酶活性.用药48 h后,MG63细胞内Ezrin的mRNA和蛋白水平均明显下降,且上调Ezrin可减弱二甲双胍诱导的骨肉瘤细胞迁移和侵袭抑制及二甲双胍诱导的MAPK/Erk信号通路抑制.结论 二甲双胍可抑制MG63细胞的迁移和侵袭能力,可能是通过下调Ezrin和MAPK/Erk信号通路而实现.     

下调Notch3表达对骨肉瘤细胞生物学特性的影响

目的 观察Notch3在骨肉瘤细胞中的表达及下调Notch3表达后对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭迁移的影响,探讨Notch3在骨肉瘤细胞生物学功能中的作用.方法 体外培养人骨肉瘤细胞MG63、Saos2、U20S,采用Real-time PCR和Western blot检测3种骨肉瘤细胞系中Notch3的mRNA和蛋白表达水平;利用siRNA敲低Notch3在骨肉瘤U20S细胞中的表达,并将细胞分为siNotch3组和阴性对照组,检测下调Notch3的表达后骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭、迁移等生物学特性的变化.结果 Notch3在骨肉瘤细胞MG63、Saos2、U20S中均呈阳性表达,并且在低级别骨肉瘤细胞系MG63中的表达明显低于高级别细胞系Saos2和U20S(P ＜0.05),下调Notch3的U20S细胞(siNotch3组)增殖、侵袭、迁移能力较阴性对照组减弱,凋亡率增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在骨肉瘤细胞U20S中下调Notch3的表达可明显抑制细胞的增殖、侵袭、迁移能力,促进凋亡.Notch3可能是Notch 通路在骨肉瘤中的关键受体之一,并参与了骨肉瘤的发生、发展.     

帕金森病相关蛋白DJ-1对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响

目的：研究帕金森病相关蛋白DJ-1对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及其作用机制。方法： Western 印迹检测骨肉瘤细胞株(MG-63,Saos-2和U2OS)及正常人成骨细胞株hFOB1.19中DJ-1和第10号染色体上缺失的 磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10,PTEN)基因的表达。DJ-1 siRNA处 理人骨肉瘤细胞后,采用Western印迹检测DJ-1的蛋白表达水平;细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细 胞存活率;膜联蛋白V(annexin V)-异硫氰酸荧光素(fl uorescein isothiocyanate,FITC)/碘化吡啶(propidium iodide,PI)双染 检测细胞凋亡;Transwell侵袭和迁移实验检测细胞侵袭和迁移水平。结果：与hFOB1.19细胞比较,骨肉瘤细胞DJ-1蛋 白表达水平显著升高(均P<0.05),其中U2OS细胞升高最为显著(P<0.01)。DJ-1 siRNA可显著降低U2OS细胞中DJ-1蛋白 表达水平、降低细胞存活率、促进细胞凋亡、抑制细胞侵袭和迁移水平,以及增加PTEN蛋白表达水平(均P<0.05)。 另外,与hFOB1.19细胞比较,PTEN在骨肉瘤细胞中的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论：DJ-1可抑制人骨肉瘤 细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞侵袭和迁移水平,其机制可能与增加PTEN蛋白的表达水平有关。     

α干扰素增强骨肉瘤细胞对依托泊苷敏感性的实验研究

目的探讨α干扰素(IFN-α)在人骨肉瘤U2OS和MG63细胞中对依托泊苷敏感性的作用及其机制。方法采用IFN-α和依托泊苷单独或联合处理骨肉瘤U2OS和MG63细胞72 h,应用流式细胞术和DNA Ladder检测细胞凋亡的变化,Western blot法检测PARP、p53、MDM2、Bax、Bcl-2的表达。结果流式细胞术表明IFN-α在p53正常的U2OS细胞中明显增强依托泊苷诱导的凋亡(P<0.05),却对依托泊苷诱导p53突变的MG63细胞凋亡无明显影响(P>0.05);DNA Ladder表明与单药组相比,IFN-α与依托泊苷联用72 h在U2OS细胞出现明显的DNA梯形条带,而在MG63细胞中无此现象;Western blot结果表明在U2OS细胞中联合用药组出现PARP的明显裂解活化,并且IFN-α明显增强依托泊苷引起的p53信号通路p53、MDM2、Bax等凋亡基因的表达,并抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达,而在MG63细胞中则无此现象。结论 IFN-α能够通过激活p53依赖性信号通路增强依托泊苷诱导的骨肉瘤U2OS细胞凋亡,联合应用IFN-α和传统化疗药物如依托泊苷可能成为提高骨肉瘤化疗敏感性的有效途径。     

二膦酸盐对人骨肉瘤细胞诱导凋亡作用的实验研究

目的：探讨二膦酸盐对人骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用及其可能的作用机制。方法将人骨肉瘤M G‐63细胞株培养、传代后将细胞分为两组：二膦酸盐400μg／m L干预组、生理盐水空白对照组,孵育72 h后,对两组人骨肉瘤M G‐63细胞株行免疫荧光检测,观察两组细胞中凋亡因子Caspase‐3、Fas的表达;行流式细胞术检测,观察两组细胞的细胞凋亡率。结果二膦酸盐作用于人骨肉瘤MG‐63细胞株72 h后,免疫荧光检测结果可见二膦酸盐400μg／mL干预组细胞中凋亡因子Caspase‐3、Fas大量表达,而生理盐水空白对照组几乎见不到凋亡因子Caspase‐3、Fas的表达;流式细胞术检测结果观察到二膦酸盐400μg／mL干预组细胞的细胞凋亡率为54．00％,远大于生理盐水空白对照组的细胞凋亡率3．10％,差异有统计学意义（ P＜0．05）,存在明显的诱导凋亡现象。结论二膦酸盐对体外人骨肉瘤M G‐63细胞株存在很强的诱导凋亡作用。     

miR-335及ROCK1在骨肉瘤中表达及相互关系研究

目的：探讨miR‐335及rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1（ROCK1）在骨肉瘤组织及细胞系中表达的情况及两者的相关性。方法临床选取18例骨肉瘤组织标本及配对正常骨骼肌组织标本;设定人正常成骨细胞为对照组,骨肉瘤细胞系M G‐63和U2‐OS为实验组,RT‐PCR检测骨肉瘤组织与各组细胞中 miR‐335与 ROCK1 mRNA 的表达差异;miR‐335 mimic转染MG‐63和U2‐OS两细胞系,检测miR‐335过表达对 ROCK1 mRNA和蛋白表达的影响。结果 miR‐335在骨肉瘤组织及细胞系中特异性低表达,而ROCK1则呈高表达,两者呈负相关;转染miR‐335 mimic后,miR‐335 mRNA过表达,ROCK1 mRNA和蛋白表达在MG‐63和U2‐OS两细胞系中受到显著抑制。结论 miR‐335与ROCK1表达在骨肉瘤组织学水平和细胞学水平均成负相关;过表达miR‐335可降低ROCK1的表达。     

人成骨肉瘤顺铂耐药细胞系的建立

目的建立顺铂诱导的人成骨肉瘤多药耐药细胞系(MG63/R)并观察其生物学特性。方法以顺铂为诱导剂,采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法诱导人成骨肉瘤MG63细胞,建立多药耐药系MG63/R。MTT法检测药物敏感性;光镜、透射电镜观察MG63、MG63/R细胞形态及超微结构变化;生长曲线、克隆形成试验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数、P-pg、bcl-2、P53蛋白表达。结果经顺铂186d的诱导,建立了MG63/R,其对顺铂的耐药指数为83.557±4.841,对阿霉素、长春新碱、氨甲基蝶呤、环磷酰氨亦产生不同程度的交叉耐药;光镜观察可见MG63/R细胞排列不规则,形态呈三角形、多角形及多核现象;透射电镜显示MG63/R细胞表面突起增加,粗面内质网丰富;细胞周期分析显示细胞增殖能力明显增加而细胞凋亡明显降低;MG63/R细胞P-pg、bcl-2阳性表达较MG63细胞明显增加,P53表达则明显降低。结论本研究建立了稳定的人成骨肉瘤多药耐药细胞系MG63/R,为进一步研究顺铂的多药耐药机制和耐药治疗提供了一种新的实验模型。     

骨肉瘤细胞中端粒酶逆转录酶mRNA的表达及意义

目的研究不同骨肉瘤细胞中人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA成分的表达情况。方法用全基因组芯片检测人骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63、SAOS-2及人成骨细胞hFOB1．19中hTERTmRNA表达;用逆转录PCR、实时定量PCR法检测人宫颈癌细胞株HeLa、人骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63、SAOS-2及人成骨细胞hFOBl．19中hTERTmRNA表达。结果全基因组芯片法显示MG-63、SAOS-2、U2-OS、hFOB1．19细胞系中hTERTmRNA表达强度分别为0．9、-0．1、-0．8、11．4,各细胞系均处于相对低表达水平;荧光实时定量PCR法显示MG-63、Hela细胞系中hTERTmRNA相对表达水平分别为1．00±0．08和2．13±0．11,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论hTERTmRNA在骨肉瘤各细胞系中表达率较低,端粒延伸替代机制可能在骨肉瘤端粒维持方面发挥重要作用。