miR-130a在卵巢癌顺铂耐药细胞株中的表达及其意义

目的分析miR-130a在卵巢癌顺铂耐药细胞株中的表达,探讨miR-130a与卵巢癌对顺铂耐药的关系。方法以浓度梯度递增法构建卵巢癌耐顺铂细胞株,MTT法对耐药细胞株进行鉴定并测定耐药指数,应用荧光实时定量PCR检测并分析各细胞株中miR-130a的表达。结果成功构建卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/CIS1、A2780/CIS2和SKOV3/CIS(P<0.05),其耐药指数分别为30.2、5.3和24.5。荧光实时定量PCR结果显示miR-130a在卵巢癌耐药细胞株中存在稳定的异常高表达(P<0.05),A2780/CIS1、A2780/CIS2以及SKOV3/CIS中miR-130a表达分别较亲本细胞平均上调30.51倍、4.87倍和24.43倍。各耐药细胞中miR-130a表达上调倍数接近于各自的顺铂耐药指数。结论 miR-130a表达的上调可能与卵巢癌细胞株对顺铂的耐药性密切相关。推测抑制miR-130a的表达有助于逆转卵巢癌顺铂耐药性,miR-130a有望成为逆转卵巢癌顺铂耐药性的潜在基因治疗靶点。     

miR-141-3p表达与卵巢癌细胞顺铂化疗敏感性的相关性研究

［摘要］ 目的 探讨miR-141-3p在卵巢癌细胞对顺铂耐药中的表达和作用。 方法 采用实时荧光定量PCR法检测A2780/DDP细胞中miR-141-3p的表达水平;下调/过表达miR-141-3p后,采用CCK-8法检测卵巢癌细胞对顺铂的增殖率并计算药物IC50;采用Western blot法检测增殖相关蛋白（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表达水平。 结果 miR-141-3p在顺铂耐药的卵巢癌细胞株A2780/DDP中的表达显著高于顺铂敏感的卵巢癌细胞株A2780（P＜0.05）。与对照组比较,A2780细胞中过表达miR-141-3p后可显著增加细胞对顺铂的IC50,增殖相关蛋白PCNA表达亦增加（P＜0.05）。与对照组比较,A2780/DDP细胞中下调miR-141-3p表达后,细胞对顺铂的IC50显著下降,增殖相关蛋白PCNA表达下降（P＜0.05）。 结论 miR-141-3p在顺铂耐药卵巢癌细胞的耐药机制中表达增加,下调miR-141-3p可增加顺铂耐药的卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。     

缺氧诱导因子-1α基因沉默逆转卵巢癌细胞SKOV3/DDP耐药性的机制

目的：观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)沉默后人卵巢癌细胞顺铂耐药株SKOV3/DDP 的HIF-1α、多药耐药基因1 （MDR1）和B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）mRNA及蛋白产物的表达,探讨HIF-1α逆转SKOV3/DDP耐药性的机制。方法：体外培养卵巢癌细胞株SKOV3（敏感组）及其顺铂耐药株SKOV3/DDP（耐药组）,部分耐药株转染HIF-1α干扰质粒 pshRNA-HIF（转染组）及对照质粒pshRNA-Control（对照组）。RT-PCR法检测各组细胞HIF-1α、MDR1和Bcl-2 mRNA表达量;Western blotting和免疫组织化学法测定HIF-1α、P-gp（MDR1基因编码蛋白）和Bcl-2蛋白的表达量。结果：RT-PCR检测,敏感组和转染组HIF-1α、MDR1和Bcl-2 mRNA表达量明显低于耐药组（P<0.05)。Western blotting检测,敏感组和转染组HIF-1α、MDR1和Bcl-2蛋白表达量明显低于耐药组(P<0.05) ;免疫组织化学法,敏感组和转染组HIF-1α、MDR1和Bcl-2蛋白表达量明显低于耐药组(P<0.05);MDR1、Bcl-2 mRNA及蛋白在敏感组与转染组的表达量差异无统计学意义（P>0.05）。HIF-1α表达与MDR1、Bcl-2 mRNA表达量均呈正相关关系（r=0.908,P=0;r=0.916,P=0);HIF-1α表达与P-gp、Bcl-2蛋白表达呈正相关关系(r=0.773,P=0.003;r=0.862,P=0）。结论：HIF-1α沉默逆转人卵巢癌细胞顺铂耐药株SOV3/DDP耐药性可能与MDR1和Bcl-2表达降低有关联。
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miR-200b与miR-200c靶向DNA甲基转移酶对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

目的探讨miR-200b与miR-200c靶向DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNMT3A和DNMT3B对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响。方法以人卵巢癌细胞株(A2780)、人卵巢癌顺铂耐药细胞株(A2780/DDP)作为研究对象,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测A2780、A2780/DDP细胞株中miR-200b与miR-200c表达量。耐药细胞株A2780/DDP转染后分为si-miR-200b组、si-miR-200c组、si-NC组,MTT法检测转染后3组细胞IC50值;蛋白印迹免疫法(Western blotting)检测转染后3组细胞DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平;流式细胞术检测转染后细胞凋亡率。结果qRT-PCR结果显示A2780细胞系中miR-200b与miR-200c表达高于A2780/DDP细胞系(P＜0.05)。 si-miR-200b组和si-miR-200c组IC50值、DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B 蛋白表达水平低于si-NC组(P＜0.05)。结论miR-200b与miR-200c高表达能抑制DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因表达,从而逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。     

卵巢癌细胞系Smac基因的表达及意义

目的 探讨Smac基因在卵巢癌细胞系A2780、COC1及其顺铂(DDP)耐药株A2780/DDP、COC1/DDP中的表达及其意义.方法 半定量逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹法检测卵巢癌细胞A2780、COC1及其顺铂耐药株A2780/DDP、COC1/DDP中Smac mRNA和蛋白的表达.结果 卵巢癌细胞A2780、COC1及其顺铂耐药株A2780/DDP、COC1/DDP四种细胞系中均有Smac mRNA和蛋白的表达;Smac在A2780、COC1中的表达高于其顺铂耐药株.结论 低表达Smac抑制凋亡,低表达Smac可能与耐药有关.     

肺耐药蛋白与卵巢癌顺铂耐药表型的相关性

目的探讨肺耐药蛋白（lung resistance protein，LRP）与人卵巢癌顺铂耐药细胞A2780／DDP顺铂耐药表型的关系及其分子机制。方法应用Lipofectamine^TM介导反义寡核苷酸（AsODN）体外转染人卵巢癌细胞；采用RT-PCR和Western blot法检测转染前后细胞中LRP基因的表达；应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞仪检测顺铂对转染前后细胞的杀伤效应；通过高效液相色谱仪（HPLC）检测经LRP AsODN或抗LRP单克隆抗体作用后，顺铂在A2780／DDP细胞质、核中的吸收和排泄情况。结果与非耐药亲本细胞A2780相比，A2780／DDP细胞内LRP表达明显增高。LRP AsODN能明显降低A2780／DDP细胞中LRP表达水平，逆转其顺铂耐药表型。经LRP AsODN或抗-LRP单克隆抗体作用后，A2780／DDP细胞中顺铂含量明显增高，尤以胞核中的含量上升为甚，而其从核中的排泄受到显著性抑制。结论LRP可能参与介导人卵巢癌细胞顺铂耐药表型的产生，并可能与顺铂在卵巢癌细胞胞质囊泡以及细胞核质交换中的代谢过程密切相关。     

切除修复交叉互补基因表达与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系

目的:探讨卵巢癌细胞系COC1、COC1/DDP、A2780、A2780/DDP中切除修复交叉互补基因(ERCC1)表达与顺铂耐药的关系.方法:采用RT-PCR方法检测4种卵巢癌细胞系中ERCC1基因的表达,MTT检测各细胞系对顺铂的敏感性.结果:4种细胞系中均有ERCC1基因表达,耐药细胞中的表达量明显高于敏感细胞(P＜0.05).DDP作用于COC1、COC1/DDP细胞72小时后,随着ERCC1基因表达的升高,细胞对顺铂的耐药性增加.结论:卵巢上皮性癌细胞系中ERCC1基因表达的升高与卵巢癌顺铂耐药相关.     

香菇多糖体外逆转A2780卵巢癌细胞顺铂耐药及可能机制

目的:研究香菇多糖体外逆转A2780卵巢癌细胞顺铂耐药及可能机制。方法:根据药物处理方法将A2780卵巢癌细胞分为CON组(未行香菇多糖或顺铂处理)、DDP组(仅用顺铂处理)、LEN组(仅用香菇多糖处理)及D+L组(香菇多糖联合顺铂处理),比较四组细胞增殖、细胞周期及凋亡率和耐药基因mRNA表达的差异。结果:D+L组细胞第1-7天的吸光度、S期、G2/M期和PI均显著低于CON组、DDP组和LEN组细胞(均P<0.05),G0/G1期和细胞凋亡率均显著高于CON组、DDP组和LEN组细胞(均P<0.05);LEN组和D+L组细胞MDR1和MRP1基因mRNA表达无明显差异(均P>0.05),CON组和DDP组细胞MDR1和MRP1基因mRNA表达显著高于LEN组和D+L组细胞(均P<0.05)。结论:香菇多糖体外可逆转卵巢癌细胞对顺铂耐药性,可能与降低MDR1和MRP1表达有关。     

抑制miR-23a表达增强卵巢癌顺铂敏感性的分子机制

目的分析抑制miR-23a表达后,耐药卵巢癌A2780细胞对化疗药物顺铂的敏感性变化及其分子机制。方法选择顺铂耐
药卵巢癌A2780细胞株为研究样本,并分为两组,其中对照组仅加入顺铂,实验组加入顺铂及antagomir-23a。应用MTT法检测
antagomir-23a抑制miR-23a并经顺铂处理后细胞增殖抑制率;应用流式细胞仪分析细胞周期分布情况;应用Hoechst33258染色
分析细胞凋亡形态学变化;应用Western blot法分析耐药糖蛋白P-gp的表达变化。结果抑制miR-23a并经顺铂处理后,细胞增
殖抑制率显著上升（P<0.01）,顺铂中效浓度（IC50）为17.89 μmol/L,比对照组IC50 110.18 μmol/L降低了83.76%（P<0.01）,细胞被
阻滞于G0/G1期且凋亡率增加（P<0.01）;Hoechst33258染色见细胞核浓缩、染色增强。Western blot检测提示细胞P-gp蛋白表
达随着顺铂浓度加大而逐渐减低（P<0.01）。结论抑制耐药卵巢癌A2780细胞内miR-23a表达后,细胞对顺铂的敏感性显著增
加,这可能miR-23a靶基因负性调控因素得以缓解,并由此引发P-gp蛋白表达受抑有关。
     

Drosha基因在人卵巢癌顺铂耐药细胞中的表达研究

目的 探讨Drosha基因和卵巢癌顺铂耐药的关系.方法 分别采用实时定量PCR和免疫印迹法检测Drosha基因mRNA及其蛋白在A2780/DDP及A2780细胞中表达的差异.结果 A2780/DDP细胞中Drosha基因mRNA及其蛋白的表达量分别是A2780细胞表达量的(56.79±1.65)%和(50.16±1.34)%,两者比较差异均有统计学意义(P＜0.001).结论 Drosha基因在A2780/DDP细胞中明显下调,提示Drosha基因和卵巢癌顺铂耐药相关.     

MDR1 and MDR3 Genes and Drug Resistance to Cisplatin of Ovarian Cancer Cells

To investigate the relationship between MDR1 and MDR3 gene and drug resistance to cisplatin of ovarian cancer cells. Two siRNAs (MDR1, MDR3) which specifically targeted MDR1 and MDR3 genes were transfered into A2780/DDP cells. Then double staining with Annexin- V-FITC/PI was used to detect cell apoptosis by the flow cytometry (FCM). A2780/DDP cell viability was determined by MTT. MDR1 and MDR3 mRNA were assessed by RT-PCR. Caspase-3 protein was detected by Western blotting. Transfection of MDR1 and MDR3 siRNA into A2780/DDP cells failed to reverse the drug-resistance of A2780/DDP cells to cisplatin (P>0.05). No significant differ- ence in the apoptosis efficiency was observed between the MDR1 and MDR3 siRNA, pSuppressor- Neo vector transfection cells and untreated cells (P>0.05). In the presence of cisplatin of different concentrations, the viability of A2780/DDP cells was not significantly decreased after the transfection. No changes in MDR1 and MDR3 mRNA were found in MDR1 and MDR3 siRNA-transfected A2780/DDP cells. As compared with pSuppressorNeo and untreated groups, no significant difference existed in the expression of MDR1 and MDR3 mRNA (P>0.05). The expression of caspase-3 protein in MDR1 and MDR3 siRNA transfected A2780/DDP cells was not significantly increased. It is con- cluded that multidrug resistance induced by cisplatin in ovarian carcinoma cell lines is not due to overexpression of MDR1 and MDR3 gene. The drug resistance of ovarian carcinoma cells to cisplatin is not mediated by P-glycoprotein.     

MDR1 and MDR3 genes and drug resistance to cisplatin of ovarian cancer cells

Summary To investigate the relationship between MDR1 and MDR3 gene and drug resistance to cisplatin of ovarian cancer cells. Two siRNAs (MDR1, MDR3) which specifically targeted MDR1 and MDR3 genes were transfered into A2780/DDP cells. Then double staining with Annexin-V-FITC/PI was used to detect cell apoptosis by the flow cytometry (FCM). A2780/DDP cell viability was determined by MTT. MDR1 and MDR3 mRNA were assessed by RT-PCR. Caspase-3 protein was detected by Western blotting. Transfection of MDR1 and MDR3 siRNA into A2780/DDP cells failed to reverse the drug-resistance of A2780/DDP cells to cisplatin (P>0.05). No significant difference in the apoptosis efficiency was observed between the MDR1 and MDR3 siRNA, pSuppressorNeo vector transfection cells and untreated cells (P>0.05). In the presence of cisplatin of different concentrations, the viability of A2780/DDP cells was not significantly decreased after the transfection. No changes in MDR1 and MDR3 mRNA were found in MDR1 and MDR3 siRNA-transfected A2780/DDP cells. As compared with pSuppressorNeo and untreated groups, no significant difference existed in the expression of MDR1 and MDR3 mRNA (P>0.05). The expression of caspase-3 protein in MDR1 and MDR3 siRNA transfected A2780/DDP cells was not significantly increased. It is concluded that multidrug resistance induced by cisplatin in ovarian carcinoma cell lines is not due to overexpression of MDR1 and MDR3 gene. The drug resistance of ovarian carcinoma cells to cisplatin is not mediated by P-glycoprotein.     

miR-181a在卵巢癌细胞中对顺铂的耐药作用

目的探讨miR-181a在卵巢癌化疗抵抗方面的影响及其机制。方法 qRT-PCR检测卵巢癌细胞A2780及A2780/DDP中miR-181a的表达;对A2780及A2780/DDP细胞分别进行miR-181a mimics和inhibitors的转染,并利用qRT-PCR技术验证;MTT法检测转染前后细胞对顺铂的敏感性,利用TargetScan、miRDB与miRwalk 3个MicroRNA靶基因数据库预测miR-181a下游靶点,并通过Western blot技术分析预测基因的表达。结果与A2780细胞相比,miR-181a在A2780/DDP细胞中的表达明显减弱(P <0.05)。干扰miR-181a表达后,A2780细胞对顺铂的抵抗作用减弱(P <0.05),而上调miR-181a表达,A2780/DDP细胞对顺铂的抵抗作用增强(P <0.05)。通过TargetScan、miRDB、miRwalk三个数据库预测到PRKCD可作为miR-181a下游靶基因,下调miR-181a表达可使PRKCD蛋白表达明显增强(P <0.05);反之,上调miR-18...     

miR-194对非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨microRNA-194(miR-194)对非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响及其可能的作用机制?方法:采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测非小细胞肺癌耐药细胞A549/DDP及其亲本细胞株A549中miR-194的表达差异,并在A549/DDP细胞中转染miR-194-inhibitor后检测miR-194的表达变化;应用MTT法?克隆形成实验?流式细胞术检测转染后A549/DDP细胞对DDP的敏感性?细胞增殖能力及凋亡变化;Western blot检测转染后A549/DDP细胞中Bax和Bcl-2的表达变化?结果:miR-194在耐药细胞A549/DDP中的表达量显著高于其亲本细胞株A549(P < 0.05),A549/DDP在转染miR-194-inhibitor 24 h后miR-194的表达水平较对照组显著下降(P < 0.05)?抑制miR-194表达后,相对于对照组,DDP对转染miR-194-inhibitor的A549/DDP细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)减低(P < 0.05),转染miR-194-inhibitor的A549/DDP细胞增殖能力减弱,经DDP处理后凋亡细胞增多(P < 0.05)?Western blot结果显示,与对照组相比,转染miR-194-inhibitor的A549/DDP细胞Bax表达水平升高,Bcl-2表达水平降低?结论:miR-194可能通过抑制细胞凋亡,上调Bcl-2蛋白及下调Bax蛋白表达而增加A549/DDP细胞对DDP的耐药性,抑制miR-194的表达可逆转A549/DDP细胞的耐药性?     

miR-373-3p调控小窝蛋白1逆转膀胱癌细胞顺铂耐药的机制研究

目的 探讨微小RNA-373-3p(miR-373-3p)靶向小窝蛋白1(Cav1)对膀胱癌细胞顺铂(DDP)耐药性的影响。方法 建立膀胱癌DDP耐药细胞株T24/DDP,RT-qPCR检测T24细胞与T24/DDP细胞中miR-373-3p表达,在T24/DDP细胞中过表达miR-373-3p或抑制Cav1表达,每组实验设置6个复孔,MTT法检测DDP对T24/DDP细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)及细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫印迹法检测细胞中Cav1、多药耐药相关蛋白(MRP)、P-糖蛋白(P-gp)蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证miR-373-3p与Cav1的靶向关系。结果 与T24细胞比较,T24/DDP细胞中miR-373-3p表达水平降低(0.34±0.06 vs. 1.00±0.18,t=8.521,P<0.001),Cav1蛋白表达水平升高(0.95±0.10 vs. 0.41±0.06,t=11.342,P<0.001);双荧光素酶报告基因实验证明miR-373-3p可靶向负调控Cav1表达;T24/DDP细胞中过表...     

MiR-130a 在上皮性卵巢癌铂类敏感与耐药患者血清中的表达及相关机制研究

目的 分析miR-130a在上皮性卵巢癌铂类敏感与耐药患者血清中的表达情况,探讨其耐药的相关机制。方法 选取32例上皮性卵巢癌铂类化疗耐药患者及30例化疗敏感患者,采用实时荧光定量PCR检测受试者血清中miR-130a表达差异,ELISA法检测血清中人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)、B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,BCL-2）表达情况。结果 耐药组患者血清miR-130a和BCL-2表达均高于敏感组,而PTEN表达低于敏感组（P均＜0.05）。且随着组织学分级增加及淋巴转移的发生,耐药组患者血清miR-130a表达量显著升高（P<0.05）。结论 MiR-130a可能通过抑制PTEN激活PI3K/AKT信号通路、上调BCL-2抑制肿瘤细胞凋亡参与上皮性卵巢癌铂类化疗耐药的产生,miR-130a有望成为逆转上皮性卵巢癌化疗耐药的基因治疗新靶点。