牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的 分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性.方法 采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定.透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况.结果 纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%.原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线.电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体.结论 通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料.两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异.     

人、猪虹膜色素上皮细胞培养的比较研究

目的建立人、猪虹膜色素上皮细胞培养的方法,比较人、猪虹膜色素上皮细胞形态及生长特性.方法用酶辅助的显微刮除 酶消化法获得的人、猪IPE细胞进行培养,行组织学观察.结果原代培养的人、猪IPE细胞在形态及生长特性上存在一定的差异,但随着传代差异减小或无差异.结论在IPE细胞的培养中,酶消化时间的长短对单层IPE细胞的获得和细胞活力的保持非常重要.     

牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性。方法采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定。透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况。结果纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%。原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线。电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体。结论通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料。两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异。     

TCP液在兔眼虹膜色素上皮细胞培养中的应用

目的寻求一种更好的培养兔眼虹膜色素上皮细胞的方法。方法采用TCP液和胰酶消化与培养IPE细胞,对比消化后的细胞形态及贴壁率。结果TCP液消化获取IPE细胞分散均匀,细胞呈圆形,胞质内充满棕黑色颗粒,几乎见不到细胞核,贴壁率为83.6%±2.3%。胰酶消化细胞多呈现絮状、团块及集落样,单个细胞散在,数量较低细胞贴壁率为67.7%±3.5%。结论TCP液对于消化获取IPE细胞较胰酶有更好的效果。     

兔眼虹膜色素上皮细胞向晶状体上皮细胞转分化的实验研究

目的：在体外成功分离培养虹膜色素上皮细胞,并观察其在特定条件下转分化为晶体上皮细胞的现象.方法：采用酶辅助机械分离法分离并培养兔眼虹膜色素上皮细胞.传代过程中在DMEM培养基内加入苯硫脲、透明质酸酶、重组人成纤维细胞生长因子-4及L-抗坏血酸-2-磷酸完成转分化过程.分别对培养起始和终末的细胞进行光镜、电镜观察和免疫组化染色鉴定.结果：成功分离并培养出原代的虹膜色素上皮细胞,经过特定条件的培养最终转分化为晶体上皮细胞,免疫组化鉴定虹膜色素上皮细胞和晶状体上皮细胞均有其各自特异染色.结论：酶辅助机械分离法是进行虹膜色素上皮细胞原代培养较好的方法.在体外培养条件下,虹膜色素上皮细胞可转分化为晶状体上皮细胞,而透明质酸酶、苯硫脲、L-抗坏血酸-2-磷酸、重组人成纤维细胞生长因子-4等因素可能参与了对上述转分化过程的调节.     

家兔虹膜色素上皮细胞移植的实验研究

目的比较直接分离和体外培养的继二代有色素家兔虹膜色素上皮(IPE)细胞移植于无色素家兔视网膜下间隙后的存活状况。方法分别选用经酶-显微解剖-酶分离法直接分离的有色素家兔虹膜色素上皮细胞,和经过体外培养至继二代的有色素家兔虹膜色素上皮细胞,制成相同密度的IPE细胞悬液。采用术中检眼镜定位的外路移植法将其植入无色素家兔视网膜下间隙。术后每日直接检眼镜观察眼底,并分别于术后的第1、2、4、8、12、16周对兔眼移植区作光镜检查。结果两种不同方式制备的有色素家兔虹膜色素上皮细胞均可在无色素家兔视网膜下间隙存活。其中,经体外培养的虹膜色素上皮细胞移植后呈较均匀的单层排列。植入的虹膜色素上皮细胞在观察期内均未见明显炎症和排斥反应。结论检眼镜定位的外路法可以将供体家兔IPE细胞成功移植在受体眼视网膜下间隙,经体外培养的继二代家兔虹膜色素上皮细胞存活形态好于直接分离的家兔虹膜色素上皮细胞。     

腺相关病毒介导色素上皮衍生因子转染人虹膜色素上皮细胞的体外研究

目的探讨以腺相关病毒(AAV)为载体,对体外培养的人虹膜色素上皮(IPE)细胞进行色素上皮衍生因子(PEDF)转染,获得高效表达PEDF转基因细胞的可行性。方法构建携带PEDF基因的重组AAV载体AAV-PEDF,体外培养人IPE,用1×106pfu的AAV-PEDF按感染复数(MO I)为0、2、10和20分别感染体外培养的IPE细胞;荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达情况;流式细胞术检测细胞转染效率;RT-PCR和W estern b lotting法鉴定PEDF在IPE细胞中的表达。结果 AAV-PEDF转染后,IPE细胞生长正常,用荧光显微镜、RT-PCR和W estern b lotting均检测到PEDF表达。在MO I为20时,细胞感染阳性率达64.22%。结论 AAV-PEDF能有效地转染体外培养的IPE细胞并有效表达PEDF。     

人视网膜色素上皮细胞的培养

目的 :培养人视网膜色素上皮细胞 ,为采用视网膜色素上皮移植治疗色素变性奠定基础。方法 :用胰酶消化法获取人胎儿视网膜色素上皮细胞进行原代及传代培养。角蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。结果 :视网膜色素上皮细胞在体外生长良好 ,胞浆内含有丰富的色素颗粒。抗角蛋白反应阳性。结论 :体外培养视网膜色素上皮细胞成功为细胞移植提供了一个良好的来源     

活体染料标记原代IPEC眼内移植的研究

目的 探讨应用活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)标记原代的兔自体虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelial cell,IPEC),并移植于视网膜神经上皮层下的可行性.方法 取原代兔眼自体虹膜色素上皮细胞消化分离,经CFDA-SE染色后移植到视网膜神经上皮层下.术后不同时间应用彩色眼底照相、激光扫描检眼镜(SLO)、光学相干断层扫描(OCT)进行活体观察,不同时间点对移植眼进行切片并常规染色及免疫组化,用光学显微镜对移植细胞进行观察和评价.结果 自体移植术后观察显示移植区界限清晰;SLO可观察到移植区内荧光分布;OCT和HE染色均显示移植区神经上皮层下有移植物堆积,并随时间推移逐渐变平.免疫组化显示移植区ZO-1、Actin呈棕色点,有规律地间断分布在Bruch膜上,IPEC嵌插在原始的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell,RPEC)间,且形成完整的单层.结论 CFDA-SE作为活体染料标记自体IPEC进行移植时,是一种快捷、稳定、安全的活体细胞染料,可作为理想的标记物应用.     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对虹膜色素上皮细胞增殖及细胞周期的影响

目的:了解重组腺相关病毒(rAAV)载体介导碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因转染对体外培养的虹膜色素上皮细胞(IPE)增殖及细胞周期的影响.方法:在体外培养的IPE细胞中加入转染rAAV-bFGF基因细胞和未转染细胞的培养液上清,继续培养4 h或1 d后分别应用MTT法和流式细胞仪检测IPE细胞的生长状况.结果:MTT法结果显示,加入rAAV-bFGF基因转染组培养液上清的IPE细胞D值为0.338±0.047,对照组为0.277±0.064,2组相比,t=3.745,P<0.05.流式细胞仪检测结果显示:加入rAAV-bFGF基因转染组培养液上清的S期IPE细胞为(21.19±1.93)%,与对照组(16.47±2.37)%相比.t=-3.448,P<0.05.结论:转染rAAV-bFGF的IPE细胞分泌的bFGF具有生物活性,这为rAAV-bFGF转染IPE细胞移植治疗视网膜色素变性提供了理论支持.     

人正常子宫内膜原代腺上皮细胞的优化分离和培养

目的 优化人正常子宫内膜腺上皮细胞分离和原代培养的方法,提供子宫内膜相关疾病研究的体外细胞模型。方法 采用酶消化、筛网过滤、离心的方法体外分离和培养人子宫内膜腺上皮与间质细胞。腺上皮细胞鉴定采用光学显微镜下观察细胞形态;免疫细胞荧光及免疫细胞化学法检测上皮细胞角蛋白(CK)和间质细胞波形蛋白(Vim)的表达。结果 经诊刮获得的18份标本中有17份分离培养成功;细胞形态符合腺上皮细胞特征,CK免疫荧光及免疫化学染色阳性,Vim染色阴性,纯度达90%以上;正常原代人子宫内膜腺上皮细胞不能传代,培养5～6d后细胞逐渐衰老。结论 改良后的原代培养方法取材简单,克服了污染问题,可获得高纯度及足够数量的人正常子宫内膜腺上皮细胞作为体外实验模型。     

人子宫内膜细胞原代体外培养方法

目的改良人子宫内膜细胞原代体外培养方法的建立,并对其进行特征鉴定。方法将选择的子宫内膜组织机械法分离,复合酶消化,传代自然增殖法纯化细胞,进行单层培养。通过倒置显微镜观察其大体形态,HE染色观察其胞核情况,免疫细胞化学染色法对间质细胞(endometrial stromal cell,ESC)及上皮细胞(endometrial glandular epithelial cell,EEC)进行鉴定。结果培养的子宫内膜细胞均有ESC和EEC两种形态细胞。EEC和ESC经角蛋白单抗体和波形蛋白单抗体染色,凡是胞质被染成棕黄色的细胞为阳性细胞。结论成功培养了原代人子宫内膜细胞,方法经济、简单,获得细胞成活率高,生长稳定。成功建立子宫内膜细胞原代体外培养体系,为从细胞和分子水平方面研究子宫内膜的各种功能及干预调节奠定基础。     

免疫吸附法纯化人胚嗅鞘细胞的实验研究

目的:探索分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法。方法:分离人胚嗅球,采用胰酶消化获取单细胞悬液,应用含Forskolin、BPE的DMEM/F12培养基,接种于p75包被的培养皿,培养2周后细胞行免疫组化染色鉴定。结果:培养细胞形态多为2￣4极细胞,成纤维细胞少,嗅鞘细胞纯度非常高,嗅鞘细胞标志物p75阳性。结论:嗅鞘细胞体外分离培养条件要求极高,应用p75免疫吸附纯化培养的嗅鞘细胞效果好。     

胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离及原代培养

目的:探讨胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial cell type Ⅱ,AECⅡ)的分离、纯化及原代培养方法,为有关胎儿肺发育及新生儿肺部疾病的研究奠定基础.方法:采用胰酶结合胶原酶的消化方法,分离肺组织细胞成份,然后经差速离心和差速贴壁的方法纯化AEC Ⅱ,进行原代培养;通过台盼蓝染色检测细胞活力,倒置相差显微镜观察细胞生长特点及形态特征,透射电镜鉴定,改良巴氏染色检测细胞纯度以及免疫荧光技术检测表面蛋白C(Surfactant protein c,SPC)的表达.结果:每3～5只胎鼠可获得AEC Ⅱ(36 ± 5)× 106,活力98%±2%.镜下观察原代AECⅡ呈岛状生长,外观呈多边形或立方形.透射电镜可见特征性的板层小体,改良巴氏染色见胞质内有较多颗粒,纯度为96%±3%,呈现SPC绿色免疫荧光的细胞占96%以上.结论:利用胰酶和胶原酶消化,以及差速离心和差速贴壁的方法可成功分离出高产量、高纯度的胎鼠AEC Ⅱ,能满足体外进一步实验的需要.     

人眼虹膜色素上皮细胞体外培养及超微结构观察

中华眼科杂志，1994；30(5）：376应用体外培养传代对10例人尸眼虹膜色素上皮细胞进行观察分析。结果表明：直接刮取的细胞进行培养较酶消化法更易存活传代，直接培养的6只眼中，5只眼有细胞生长，经胶原酶消化后培养的4只眼中，1只眼有细胞生长。原代细胞在光镜下呈多角形单层生长,胞浆内有丰富的的色素颗粒，核相对透明，有1～2个核仁。传代后的细胞色素颗粒减少；电镜下见胞浆富含色素，细胞膜有明显微绒毛;免疫组化检查细胞胞浆内角蛋白抗原呈阳性反应，符合虹膜色素上皮细胞的特点。虹膜含有某些生物活性物质,因此虹膜色素上皮细胞的体…     

人早期胚胎间充质干细胞的定位和体外初步分离培养

目的:从早期入胚分离培养人早期胚胎间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),并初步鉴定其生物学特性.方法:取4～6周胚龄的人胚,用免疫组织化学法,结合特定抗体SH-2,对MSC在人胚中的分布进行定位,分离组织进行培养.免疫组化和流式细胞术检测MSC的相对特异性抗原SH-2、CD44、OCT-4、S-100、CD34、α-smooth-actin在分离培养细胞中的表达.结果:在胚胎的四肢、躯体部紧邻神经管的下方(不包括原肠等内脏部位)有大量的MSC分布.分离培养可得到成纤维状的MSC,贴壁生长,有生长优势,可多次传代并保持MSC生物学特性不变.结论:通过机械分离和胰酶消化的方法,可从早期人胚得到MSC.利用MSC的贴壁生长特性及生长优势,经4～5次传代后可得到纯度很高的MSC.     

一种新的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离纯化及培养方法的探讨

目的:建立一种简捷的分离纯化培养子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的方法。方法:选择子宫全切育龄妇女的新鲜子宫内膜组织,经单酶消化、二次筛网过滤及贴壁纯化技术分离纯化培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,光镜及免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:腺上皮细胞漩涡状生长,细胞呈蝌蚪形或类圆型,细胞角蛋白19免疫组化染色阳性,纯度可达92%。基质细胞呈平行状生长,细胞呈梭形或多角形。波形蛋白免疫组化染色阳性,纯度达95%以上。每例子宫肌瘤切除标本可获得(10～25)×106原代基质细胞和(4～6)×106原代腺上皮细胞。结论:该培养方法可获得高产量的纯化的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。     

人羊膜上皮细胞的原代及传代培养

目的 建立体外培养人羊膜上皮细胞的方法,观察体外培养的羊膜上皮细胞的生物学特性.方法 取足月剖宫产术后羊膜,经胶原酶和胰蛋白酶消化后,获取的羊膜上皮细胞接种于含10%胎牛血清培养基中进行原代和传代培养,探索其合适的培养条件,用倒置显微镜观察培养的人羊膜上皮细胞体外生长的特征.用苏木精-伊红染色、扫描电镜和细胞角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定.结果 人羊膜上皮细胞可以在体外成功的培养传代,体外可连续传8～10代.体外培养细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观.扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛.细胞角蛋白keratin单克隆抗体染色阳性.结论 人羊膜上皮细胞在体外可成功进行原代和传代培养,体外培养的人羊膜上皮细胞在一定时间内可维持增殖能力.     

昆明小鼠胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养

目的:建立能够在体外长期培养胰腺导管上皮细胞的方法.方法:成年昆明小鼠,颈椎脱臼法处死,取胰腺组织,以Ⅴ型胶原酶消化,400目滤网过滤,分离胰腺导管上皮细胞,用添加有各种生长因子的DMEM/F12培养基培养,待细胞达到90%以上汇合时以胰酶消化传代.在不同时间点取样,于普通光镜和相差显微镜下观察细胞形态学变化;采用免疫细胞化学方法检测细胞角蛋白-19(CK-19)的表达情况;并行双硫腙(DTZ)染色.结果:原代及传代培养的细胞具有上皮样细胞的典型特征,CK-19染色阳性,DTZ染色阴性,可初步鉴定为胰腺导管上皮细胞.结论:所建立的原代和传代培养方法,适宜于小鼠胰腺导管上皮细胞的体外生长.     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。