脂多糖诱导年轻小鼠骨髓及脾脏造血干细胞衰老表型的作用研究

目的：探究脂多糖诱导的炎症反应对年轻小鼠骨髓及脾脏中造血干/祖细胞衰老表型的影响。方法：（1）构建细菌脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）诱导的急性炎症小鼠模型,流式细胞术检测LPS刺激后年轻小鼠骨髓和脾脏中造血干/祖细胞的百分率,以及外周血和脾脏中各类成熟细胞百分率;通过增殖标记物Ki67检测小鼠骨髓和脾脏中造血干/祖细胞增殖的变化;检测炎症刺激后脾脏中造血干/祖细胞CD45蛋白的表达变化;（2）分析野生型年轻小鼠（2月龄）和年老小鼠（24月龄）骨髓和脾脏中造血干/祖细胞,外周血和脾脏中各类成熟细胞的百分率;（3）生物信息分析LPS刺激诱导造血干细胞转录组的变化。结果：（1）与对照组小鼠相比,体内LPS刺激导致小鼠骨髓中造血干/祖细胞百分率显著升高（P<0.05）,外周血和脾脏中髓系细胞百分率显著升高（P<0.05）;(2)与对照组小鼠相比,体内LPS刺激导致小鼠脾脏重量和细胞数目增多（P<0.05）,脾脏中造血干/祖细胞百分率增多（P<0.05）;(3)LPS刺激促进小鼠骨髓和脾脏中的造血干/祖细胞增殖（P<0.05）;(4)LP...     

Pqlc2基因缺失对小鼠稳态、衰老、饥饿、急性髓系白血病条件下造血系统的影响

目的：探讨在稳态、衰老、饥饿及急性髓系白血病条件下Pqlc2(PQ loop repeat containing 2)基因缺失对小鼠造血系统的影响。方法：（1）应用流式细胞术检测稳态下Pqlc2基因缺失小鼠骨髓造血干/祖细胞的比例;利用造血干细胞体内移植模型检测Pqlc2基因缺失对造血干细胞重建造血能力的影响;（2）分析衰老下Pqlc2基因缺失小鼠外周血中各类血细胞的数目,脾脏中B细胞、T细胞及髓系细胞比例,胸腺中四类T细胞比例,以及骨髓中造血干/祖细胞的比例;（3）建立能量限制压力模型,检测在连续3 d的饥饿处理下,Pqlc2基因缺失对小鼠造血干/祖细胞的影响;（4）构建野生型和Pqlc2基因缺失的急性髓系白血病（MLL-AF9 AML）小鼠模型,检测Pqlc2基因缺失对白血病小鼠生存率及造血系统的影响。结果：（1）与野生型小鼠相比,Pqlc2基因缺失导致稳态下小鼠造血干细胞比例显著升高（P<0.01）,造血祖细胞比例无显著差异（P>0.05）,造血干细胞重建造血能力显著下降（P<0.05）;(2)Pqlc2基因缺失对衰老小鼠的造血系统无显著影响（P>0.05...     

脓毒症相关性脑病小鼠模型的建立及其认知功能障碍的初步研究

目的:建立脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy,SAE)小鼠模型并对其认知功能障碍进行初步研究。方法:选取8～10周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠。第1部分实验将小鼠随机分为4组,即正常对照组,盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)1组和CLP2组(分别用7号和12号针头行小鼠腹腔CLP)和假手术组(小鼠仅开腹分离盲肠)。第2部分实验将小鼠随机分为3组,即正常对照组,假手术组和CLP组。采用Kaplan-Meier法分析小鼠术后存活率;神经行为学评分评价小鼠的神经行为变化;Morris水迷宫实验和避暗实验检测小鼠的认知记忆功能变化;爬杆实验和悬挂实验测试小鼠的运动协调性;ELISA法检测小鼠血清前列腺素E_2(prostaglandin E_2, PGE_2)水平变化。结果:第1部分实验中,CLP术后小鼠出现明显嗜睡、竖毛、寒颤和厌食等症状,CLP1组和CLP2组小鼠48 h死亡率分别为20%和30%。两部分实验中行小鼠腹腔盲肠结扎穿孔术组小鼠神经行为学评分均显著低于对照组和假手术组(P0.01);Morris水迷宫中逃避潜伏期时间均显著延长(P0.01),目标象限停留时间和穿越平台次数减少(P0.01);悬挂实验和爬杆实验中评分均出现显著降低(P0.01);在避暗实验开始后大部分小鼠活动量显著减小甚至未曾进入暗室(P0.05)。第2部分实验中,CLP术后小鼠血清中PGE_2释放量显著增加(P0.01)。结论:通过12号针行盲肠结扎穿孔术可成功建立稳定的脓毒症相关性脑病小鼠模型,用此法建立的SAE小鼠模型存在学习记忆认知功能障碍。     

轻度CLP模型大鼠在脓毒症早期即发生心肌收缩与舒张功能障碍

目的:利用轻度盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症大鼠模型,比较脓毒症大鼠心功能与其它器官功能障碍发生的时间。方法:将大鼠随机分为假手术组和盲肠结扎穿孔术组,分别于手术后6 h、9 h和12 h用Langendorff装置检测大鼠心肌收缩与舒张功能,并测定心肌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和血管内皮细胞黏附因子1(VCAM-1)的表达;同时检测血清TNF-α水平以及大鼠肝、肾功能和肺湿/干重比值。结果:轻度CLP术后10 d,大鼠的死亡率为26.7%。CLP术后9 h与12 h左心室内压最大上升与下降速率显著低于假手术组;CLP术后6 h,心肌TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达显著高于假手术组,CLP术后9 h心肌TNF-α和VCAM-1的蛋白表达显著升高。CLP术后9 h血清天冬氨酸氨基转移酶活性和12 h丙氨酸氨基转移酶活性高于假手术组。而术后6 h、9 h和12 h,大鼠血尿素氮水平、肺湿/干重比与相应时点的假手术组比较,差异没有统计学显著性。结论:轻度CLP模型大鼠在脓毒症发生后6 h心肌炎症因子表达增多,9 h后即发生心肌内在收缩与舒张功能障碍,其发生早于肝、肾功能损伤。     

运动促进青春期小鼠造血干细胞造血重建功能

目的：探讨运动对青春期（4周龄）和成年（9周龄）小鼠骨髓造血干细胞造血重建功能的作用。方法：使用跑步机分别对青春期和成年C57BL/6J雄性小鼠进行跑步运动（运动14 d,前2 d运动速度为10 m/min,后12 d运动速度为12 m/min）。实验分为对照（安静）组和运动组（n=6）;使用流式细胞仪分析运动后小鼠骨髓中造血干/祖细胞比例;采用全血分析仪分析运动后小鼠外周血中白细胞、红细胞及血小板的数目;体外集落形成实验检测造血干/祖细胞的集落形成能力;体内竞争性移植实验检测造血干细胞重建造血能力;BrdU实验分析造血干/祖细胞的增殖水平;ELISA检测外周血中瘦素水平;流式细胞仪检测骨髓和骨内膜中间充质干细胞的数目;体外集落形成实验检测间充质干细胞骨髓集落形成能力。结果：（1）运动导致青春期小鼠外周血中血小板数目显著升高（P<0.05）;(2)运动处理后,青春期小鼠骨髓造血干/祖细胞的比例及体外短期集落形成能力无显著差异（P>0.05）,然而运动促进青春期小鼠骨髓造血干细胞体内长期造血重建能力显著增强（P<0.05）;(3)成年小鼠运动后骨髓中造血干细胞比例显著降...     

小檗碱抑制脓毒症诱导的肠上皮细胞凋亡

目的:观察小檗碱对脓毒症小鼠肠上皮细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:8~10周雄性C57BL/6小鼠,随机分为假手术组(sham组)、脓毒症模型组(CLP组)、小檗碱治疗组(CLP+Ber组)、小檗碱对照组(sham+Ber组)。CLP组行盲肠结扎穿孔术复制小鼠脓毒症模型,其余组除不结扎盲肠外,其它操作同CLP组。各组小鼠术后2 h内分别予双蒸水、小檗碱(50 mg/kg)灌胃。术后20 h,小鼠腹腔注射过量的戊巴比妥钠处以安乐死后开腹取回肠组织,HE染色观察各组小鼠肠组织形态学改变;Western blot法观察各组肠组织凋亡相关蛋白caspase-3降解片段、胞浆组织细胞色素C(Cyt C)、线粒体蛋白Bax及细胞总蛋白Bcl-2、Fas、Fas L、Fas相关死亡域结构蛋白(FADD)的含量变化;real-time PCR法检测各组肠组织酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺β-羟化酶(DBH)的mRNA表达水平。结果:小鼠CLP术后20 h,可见脓毒症模型组小鼠肠绒毛坏死并伴有大量炎症细胞浸润;模型组肠组织caspase-3降解片段显著增多,线粒体Bax、胞浆Cyt C及总蛋白Fas、Fas L含量显著增高,而总蛋白Bcl-2含量明显降低,FADD未见明显改变;脓毒症模型组肠组织TH、DBH的mRNA表达明显增高。术后给予小檗碱治疗后可显著减轻肠组织炎症,逆转caspase-3降解片段、Bax、Cyt C、Fas、Fas L、Bcl-2蛋白和TH、DBH mRNA的表达。结论:小檗碱可显著抑制脓毒症小鼠肠上皮细胞凋亡,其机制可能与抑制内、外源性凋亡途径有关。     

小檗碱与育亨宾对脓毒症小鼠脾细胞凋亡的影响及其机制研究

 目的:探讨小檗碱与育亨宾对脓毒症小鼠脾细胞凋亡的影响及其作用机制。方法: 采用盲肠结扎穿孔（CLP）构建小鼠脓毒症模型,分为假手术（sham）组、CLP组、CLP+小檗碱组、CLP+育亨宾组、CLP+小檗碱与育亨宾合剂组。CLP术后2 h灌胃给予相应药物,20 h后取脾脏,用TUNEL和流式细胞术检测小鼠脾细胞凋亡,酶荧光法检测caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性变化,Western blotting检测凋亡相关蛋白Fas、Bim、Bcl-2和Bax的表达。结果: (1) CLP组脾脏TUNEL阳性细胞百分率显著高于sham组（P＜0.05）,CLP+育亨宾与小檗碱合剂组、CLP+育亨宾组凋亡细胞百分率显著低于CLP组（P＜0.05）。(2) 流式细胞仪检测显示CLP组凋亡的脾细胞及T淋巴细胞明显多于sham组(P＜0.05),CLP+育亨宾与小檗碱合剂组、CLP+育亨宾组凋亡的脾细胞及T淋巴细胞明显少于CLP组 (P＜0.05) 。(3) CLP+育亨宾与小檗碱合剂组、CLP+育亨宾组脾细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性均低于CLP组(P＜0.05);而CLP+小檗碱组脾细胞caspase-9活性也低于CLP组 (P＜0.05)。(4) CLP+育亨宾与小檗碱合剂组胞浆Fas、Bim、Bax表达均低于CLP组,CLP+育亨宾组胞浆Fas表达低于CLP组,CLP+小檗碱治疗组胞浆Bim、线粒体Bax表达均低于CLP组。结论: (1) 小檗碱与育亨宾合用可通过阻断内、外源性凋亡途径抑制脓毒症小鼠脾细胞凋亡,特别是T淋巴细胞凋亡。(2) 育亨宾主要通过抑制Fas的表达、进而阻断内、外源性凋亡途径减少脓毒症诱导的脾细胞凋亡。(3) 小檗碱可抑制脓毒症小鼠脾细胞线粒体凋亡途径,但对脓毒症小鼠脾细胞凋亡的抑制作用并不明显。     

两种脓毒症模型小鼠血清白细胞介素-6与其早期生存率的关系

目的探讨盲肠结扎穿孔( CLP)、腹腔持续置管引流( CASP)脓毒症模型小鼠血清白细胞介素-6(IL-6)与其早期生存率的关系。方法将60只雄性BALB/c小鼠编号,采用数字表法随机分为3组,即假手术组( Sham组)、CLP组、CASP组,各20只。 CLP组小鼠麻醉后,于中下腹正中线做纵行切口,充分暴露并结扎盲肠,用18 G注射器针头在结扎部位远端穿孔并来回贯穿2次,将少量肠内容物挤出,回纳盲肠,缝合腹壁切口。 CASP组术前准备、开腹方式同CLP模型,暴露小鼠升结肠系膜,在其对侧处插入静脉导管,退出针芯,荷包缝合并固定、剪断静脉导管,将游离端放置于腹腔内。用棉签挤压肠管,使少量肠内容物从导管口溢出,以确认导管通畅。 Sham组术前准备、开腹、术后处理同CLP组,不行盲肠结扎、穿孔。观察各组小鼠术后12、24、36、48、60、72 h的生存率。术后6 h采集各组小鼠尾静脉血,采用 ELISA 检测血清 IL-6,比较此时间点3组存活小鼠间 IL-6水平以及CLP组、CASP组的存活和死亡小鼠间IL-6水平。结果 Sham组、CLP组和CASP组术后72 h生存率分别是100.0%(20/20)、45.0%(9/20)和10.0%(2/20),3组间总体比较差异有统计学意义(字2=32.970,P<0.01),两两比较3组间差异均有统计学意义(P值均<0.05);3组小鼠生存时间曲线经Log-rank检验,差异有统计学意义(字2=34.030,P<0.05)。术后6 h,Sham组、CLP组、CASP组存活小鼠血清 IL-6水平分别是(36.62依10.30) ng/L、(2443.47依970.50) ng/L、(4057.93依827.41)ng/L,差异均有统计学意义(Hc=29.270,P<0.01);CLP组和CASP组各组内存活小鼠血清IL-6水平平均分别为(1348.80依276.25) ng/L、2100.00 ng/L,明显低于死亡小鼠的(3157.29依330.94)ng/L、(4275.48依512.71)ng/L,CLP组差异有统计学意义(t=13.071,P<0.01)。结论两种脓毒症模型小鼠的转归都有一定的病死率,较好地模拟了脓毒症的病理生理过程,CLP模型侧重于模拟局限性腹腔脓肿,CASP模型则侧重于模拟弥漫性腹膜炎。 CLP组模型术后6 h血清IL-6水平较低的小鼠,术后72 h生存率较高。     

内源性雌激素调控脓毒症小鼠心肌L型钙离子通道α1C亚基的表达

目的　探讨内源性雌激素对脓毒症小鼠心肌钙离子通道α1C亚基（CACNA1C）的影响。 方法　雌性昆明小鼠行双侧卵巢摘除术，术后30 d利用盲肠结扎穿刺术（CLP）建立脓毒症小鼠模型，分为5组：脓毒症组（S组），去卵巢+脓毒症组（QS组），假手术组（C组），去卵巢+假手术组（QC组），去卵巢+苯甲酸雌二醇（QE组）。荧光定量PCR和Western blot检测造模后3 h，6 h，12 h，24 h左心室CACNA1C表达水平，免疫组化检测造模后12 h左心室CACNA1C表达及分布情况。 结果　（1）QC组CACNA1C的表达水平显著高于C组，QE组CACNA1C的表达水平显著低于QC组。（2）CLP后3 h，S组CACNA1C表达显著高于对照组和其它时间点。（3）CLP后3 h、6 h、12 h和24 h，QS组CACNA1C表达均显著低于对照组，且各时间点之间无差异。 结论　（1）双侧卵巢摘除后CACNA1C表达显著升高，双侧卵巢摘除后补给苯甲酸雌二醇可以逆转CACNA1C的升高。（2）正常小鼠CLP后3 h CACNA1C的表达出现短暂的升高，而双侧卵巢摘除的小鼠CLP后各时间点CACNA1C的表达均显著低于对照组。     

内源性雌激素调控脓毒症小鼠心肌L型钙离子通道α1C亚基的表达

目的　探讨内源性雌激素对脓毒症小鼠心肌钙离子通道α1C亚基（CACNA1C）的影响。 方法　雌性昆明小鼠行双侧卵巢摘除术,术后30 d利用盲肠结扎穿刺术（CLP）建立脓毒症小鼠模型,分为5组：脓毒症组（S组）,去卵巢+脓毒症组（QS组）,假手术组（C组）,去卵巢+假手术组（QC组）,去卵巢+苯甲酸雌二醇（QE组）。荧光定量PCR和Western blot检测造模后3 h,6 h,12 h,24 h左心室CACNA1C表达水平,免疫组化检测造模后12 h左心室CACNA1C表达及分布情况。 结果　（1）QC组CACNA1C的表达水平显著高于C组,QE组CACNA1C的表达水平显著低于QC组。（2）CLP后3 h,S组CACNA1C表达显著高于对照组和其它时间点。（3）CLP后3 h、6 h、12 h和24 h,QS组CACNA1C表达均显著低于对照组,且各时间点之间无差异。 结论　（1）双侧卵巢摘除后CACNA1C表达显著升高,双侧卵巢摘除后补给苯甲酸雌二醇可以逆转CACNA1C的升高。（2）正常小鼠CLP后3 h CACNA1C的表达出现短暂的升高,而双侧卵巢摘除的小鼠CLP后各时间点CACNA1C的表达均显著低于对照组。