氟化钠对原代培养大鼠肝细胞的毒性作用及机理研究

目的探讨氟化钠(NaF)对原代培养大鼠肝细胞的毒性作用及其机制.方法采用不同剂量的氟化钠处理原代培养的大鼠肝细胞,观察由此所致的细胞酶学和形态学变化来评价其毒性作用及方式.结果肝细胞存活率呈明显的剂量-效应关系,IC50为3.58 mmol/L;当氟化钠浓度为2 mmol/L时,肝细胞培养液中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性明显增加(P＜0.05);丙二醛(MDA)含量随染氟剂量增加而增加.细胞形态改变包括收缩、变圆、变小.发生这种改变的的细胞占总细胞数的比例随剂量的增加而增加.结论氟化钠对原代培养大鼠肝细胞有明显的毒作用,其主要作用方式之一是引起细胞发生脂质过氧化.     

氟对猪甲状腺原代培养细胞甲状腺过氧化物酶活性及mRNA表达的影响

目的 探讨氟对猪甲状腺原代培养细胞甲状腺过氧化物酶(TPO)活性及mRNA表达的影响.方法 用原代培养的猪甲状腺细胞,按氟化钠(NaF)剂量不同分为:0(对照)、40、80、160 mg/L组.甲状腺细胞培养48 h后,采用吖啶橙染色观察甲状腺细胞形态学改变,改良愈创木酚法检测TPO活性,RT-PCR法测定TPOmRNA的表达水平.结果 培养48 h后,80、160 mg/L组吖啶橙染色可见凋亡小体及大量漂浮细胞、碎片.0、40、80、160 mg/L组TPO活性[(3.103±0.090)、(1.944±0.025)、(1.361±0.008)、(0.668±0.026)U/L]随着染氟剂量的升高而明显降低,组间比较差异有统计学意义(F=1563.864,P＜0.05),TPO活性与染氟剂量呈负相关r=-0.955,P＜0.05).4组TPO mRNA表达水平(0.947±0.013、0.634±0.018、0.448±0.028、0.210±0.009)也随着染氟剂量的升高而明显降低,组间比较差异有统计学意义(F=2713.855,P＜0.05).结论 氟可能是通过抑制TPO活性及TPO mRNA的表达来影响甲状腺功能.     

小鼠甲状腺细胞原代培养及鉴定

目的分离培养小鼠甲状腺细胞，为探讨甲状腺功能调节和疾病发生提供一种体外模型。方法取6～8周龄Balb／c小鼠甲状腺，用胶原酶-中性蛋白酶双酶法分离甲状腺滤泡上皮细胞。用含10％胎牛血清（FCS）的F-12培养基培养，细胞贴壁后FCS降至5％，另外添加促甲状腺激素（TSH）、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素和L．谷氨酰胺。光镜下对不同培养时间的细胞进行形态学观察，并结合免疫细胞化学染色法、RT—PCR法和电化学发光免疫法对培养小鼠甲状腺细胞从形态、甲状腺球蛋白（取）、取特异抗原蛋白表达、甲状腺过氧化物酶（TPO）、钠碘转运子（NIS）、促甲状腺激素受体（TSH—R）等特异基因mRNA表达和甲状腺激素T3、T4分泌功能等方面进行鉴定。结果小鼠甲状腺细胞在体外呈贴壁式生长，具有上皮样细胞特点；取染色呈胞浆阳性，并具有特异TPO、Tg、NIS、TSH—RmRNA表达和分泌T3、T4的功能，但其表达与分泌量有随培养时间的延长呈递减趋势。结论成功建立小鼠甲状腺细胞原代培养模型，可用于甲状腺功能与疾病研究。     

人甲状腺原代细胞的长期培养

目的　探索人甲状腺细胞长期原代培养的方法及细胞在不同时期的功能变化。方法　常规分离甲状腺细胞,并用含有10%胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺、牛胰岛素、10mU/LTSH和氢化可的松的MEM培养,细胞铺成单层后换用4% FBC的培养基培养,分别在不同时间观察甲状腺细胞吸碘率、细胞生长情况,免疫组化观察甲状腺特异抗原甲状腺球蛋白(Tg)表达水平,RT PCR测定钠碘转运子(NIS)基因表达水平。结果　甲状腺细胞在培养40d左右仍生长良好,培养14d细胞具有80%的吸碘率,培养7dTg表达可达95%,培养14dTg表达仍达60%,NISmRNA表达在培养7d达98%,而培养14d表达率只有40%。结论　应用该研究所建立的培养条件可以使甲状腺细胞生存40d以上,该实验条件下培养3, 7, 14,28d的原代甲状腺滤泡上皮细胞以培养7d的细胞NISmRNA,Tg表达、摄碘功能最接近基线水平。     

实验性甲低大鼠甲状腺内肥大细胞的形态学研究

肥大细胞可产生多种生物活性物质,其功能的多态性受到广泛关注。在地方性甲状腺肿的研究中,已有大量关于甲状腺形态学变化的报道,而有关甲状腺内肥大细胞的研究资料甚少,作者采用给予硫脲的方法,造成大鼠实验性甲低,对甲状腺内的肥大细胞进行形态学研究,为探讨甲低时甲状腺内肥大细胞的功能变化及地甲肿的发病学机制提供实验资料。     

过量碘对原代培养的猪甲状腺细胞凋亡的诱导作用

目的观察过量碘对原代培养的猪甲状腺细胞凋亡的诱导作用,并对其机制作初步探讨。方法取健康的猪甲状腺细胞培养24 h后,加入不同浓度的碘化钾,观察细胞的形态改变;琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术分析DNA的降解;采用MDA法测定细胞膜的脂质过氧化程度。结果加入碘化钾后6 h左右,可见细胞凋亡,48 h左右达到高峰;琼脂糖凝胶电泳出现典型的梯状带;流式细胞术可见亚二倍体高峰,细胞凋亡率随碘化钾浓度的升高而升高(P<0.05);脂质过氧化产物丙二醛含量随碘化钾浓度的升高而升高(P<0.05)。结论过量碘化钾诱导原代培养的猪甲状腺细胞凋亡,呈剂量依赖关系,可能通过活性氧机制启动凋亡。     

慢性碘过量对大鼠甲状腺细胞凋亡的影响

目的 探讨慢性轻中度碘过量对甲状腺细胞凋亡的影响,观察限碘后的恢复情况.方法 将Wistar大鼠分入4组:对照组、1.5倍、3倍和6倍高碘组,每日给碘量分别为4、6、12和24 μg,于实验1至8个月分批处死动物.部分高碘8个月大鼠限碘3个月(4μg/d).采用砷铈催化分光光度法测定尿碘浓度,应用Annexin V染色流式细胞术和电镜对甲状腺细胞凋亡定量定性,碘化丙碇染色流式细胞术测定细胞周期,分子探针(DCFH-DA)荧光定量细胞内活性氧簇(ROS)水平.应用流式细胞术和免疫组织化学方法检测凋亡相关蛋白的表达.结果 3倍和6倍高碘组4个月和8个月时,甲状腺细胞凋亡率和ROS水平显著高于对照(均P<0.05),限碘后恢复正常.6倍碘组4个月和8个月时,甲状腺增殖期细胞比例著升高(5%和6% vs 3%,均P<0.05),静止期细胞比例显著下降(64%和67% vs 80%,均P<0.05).3倍和6倍碘组8个月时,Fas、FasL、TRAIL蛋白表达水平比对照组高2-4倍,限碘后未恢复.Bcl-2和Bax蛋白的表达不变.6倍碘组8个月时,细胞凋亡率、ROS水平及给碘量三者之间显著正相关(r=0.637～0.790,P<0.01).结论 慢性碘过最能增加甲状腺细胞凋亡,ROS过多产生可能涉及其机制.     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

目的探讨以简便、高效的方法获取血管平滑肌细胞,为相关研究提供实验材料。方法采用组织贴块法进行原代培养,胰酶消化法传代,并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果90%的组织块接种存活,培养5代的平滑肌细胞纯度达98%以上。镜下可见培养细胞呈典型的“峰-谷状”样生长,免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论本法简便、可靠,短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞,可作为研究心血管疾病良好的体外模型。     

乳鼠窦房结细胞的原代培养和形态学特征

目的比较差速贴壁技术和常规培养方法在体外获取窦房结自律细胞的密度,并观察其形态学特征。旨在建立可靠的窦房结自律细胞体外取材分离、纯化培养及形态学鉴定。方法取24 h内新生Wistar乳鼠1 20只,随机分为实验组(差速贴壁技术培养方法)和对照组(常规培养方法),每组60只。每次随机各取5只乳鼠行窦房结取材,分别用2种方法进行原代细胞纯化培养。通过光、电镜观察比较2种方法体外窦房结自律细胞的密度比及形态学特征。结果体外培养窦房结细胞有3种不同形态,梭形细胞、三角形细胞和不规则形细胞,其中梭形细胞最多,搏动频率最快;三角形细胞与心房肌三角形细胞特征相似;实验组窦房结梭形细胞比例明显高于对照组[(65±4)%vs(45±3)%,P<0.01]。结论采用差速贴壁技术纯化培养方法较常规培养可更明显提高窦房结梭形细胞的比例,是一种可靠的窦房结自律细胞培养、纯化技术。在培养的乳鼠窦房结细胞中,细胞体积小、搏动频率快的梭形细胞即是窦房结的起搏细胞。     

大鼠冠状动脉平滑肌细胞的原代培养及鉴定

目的探讨大鼠冠状动脉平滑肌细胞的原代培养方法,为冠状动脉疾病的研究提供理想的细胞模型。方法无菌条件下分离大鼠冠状动脉,采用酶消化法分离培养平滑肌细胞,进行形态学观察及台盼蓝染色测定细胞活力,采用免疫荧光染色技术对平滑肌α肌动蛋白进行鉴定。结果形态学、免疫荧光染色鉴定表明培养的细胞为血管平滑肌细胞,细胞存活率达97%。原代培养14d左右即可进行传代,可以传6代以上,且细胞形态及生长状态良好。结论酶消化法分离大鼠冠状动脉平滑肌细胞,方法简单、高效,细胞纯度高、且活性好、生长迅速。     

氟对原代培养猪甲状腺细胞功能的影响

目的 探讨氟对原代培养甲状腺细胞功能的影响.方法 用猪甲状腺细胞,采用原代培养方法,按染氟(NaF)剂量不同分为:0(对照组)、40、80、160 mg/L组.染氟48 h后,采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率,改良愈创木酚法测定甲状腺过氧化物酶(TPO)活性,放射免疫法测定甲状腺素(T4)水平.结果 甲状腺细胞培养48 h后,细胞贴壁,多呈六边形,呈聚集性趋势生长,并可见典型的滤泡结构.甲状腺细胞染氟培养48 h后,细胞存活率组间比较差异有统计学意义(F=149.092,P＜0.05);40mg/L组细胞存活率为(96,04±2.08)%,与对照组(100%)比较,差异无统计学意义(t=2.157,P＞0.05);80、160 mg/L组细胞存活率分别为(86.59±1.79)%、(70.12±1.49)%,与对照组比较,差异有统计学意义(t值分别为7.621、17.697,P＜0.05).甲状腺细胞T4水平随着染氟剂量的升高而明显降低[(44.940±8.212)、(31.442±4.384)、(22.742±4.504)、(15.193±1.633)nmol/L],组间比较差异有统计学意义(F=978.255,P＜0.05).甲状腺细胞TPO活性也随着染氟剂量的升高而明显降低[(3.103±0.090)、(1.944±0.025)、(1.361±0.008)、(0.668±0.026)U/L],组间比较差异有统计学意义(F=1563.864,P＜0.05).TPO活性与染氟剂量呈负相关(r=-0.955,P＜0.05).结论 氟可通过降低T4水平而影响甲状腺功能,其发生机制可能是通过诱导细胞凋亡,降低细胞存活率和抑制TPO活性有关.     

氟化钠对去卵巢大鼠胫骨作用的骨形态计量学研究

目的 了解卵巢切作大鼠胫骨对氟化钠的治疗反应。方法 将２４只雌性大鼠随机分成３组,单纯切卵巢组、对照组和氟化钠治疗组。对单纯切卵巢组和氟化钠治疗组大鼠行卵巢切除手术,建立骨质疏松动物模型,氟化钠治疗组于卵巢切除术后１个月予氟化钠,给药３个月后处死。用骨形态计量学方法检测卵巢切除大鼠无后肢胫骨对氟化钠的治疗反应。结果 单纯卵巢切除组大鼠骨小梁体积,平均骨小梁密度较对照组显著较减少（Ｐ〈０．０５）,四     

氟对大鼠甲状腺过氧化物酶mRNA表达的影响

目的 观察长期氟过量对大鼠甲状腺过氧化物酶(TPO)活性、TPO mRNA表达的影响,并探讨其可能的机制.方法 选用雄性SD大鼠40只,按体质量分为对照组、低氟组、中氟组、高氟组,每组10只,分别饮用含氟化钠0.40(普通自来水)、15.00、30.00和60.00 mg/L的自来水,均食用普通粮食配制的饲料.喂养180 d后处死.测定血清FT3和FT4;采用改良愈创木酚法测定甲状腺TPO活性;半定量RT-PCR方法检测甲状腺TPO mRNA表达水平.结果 低、中、高氟组血清FL3水平[(3.62±0.47)、(3.57±0.55)和(3.30±0.68)pmol/L]与对照组[(3.64±0.45)pmol/L]相比虽呈下降趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05);高氟组血清FT4水平[(8.64±1.72)pmol/L]低于对照组、低、中氟组[(13.08±1.69)、(12.68±1.32)、(12.05±1.43)pmol/L,P均＜0.05].对照组、低氟组、中氟组、高氟组甲状腺细胞TPO活性[(1.572±0.064)、(1.414±0.086)、(1.322±0.049)、0.960±0.083)U/L]随着氟浓度的升高而明显降低,任意两组组间比较差异均有统计学意义(P均＜ 0.05),TPO活性与氟浓度呈显著负相关(r=-0.955,P＜0.05).半定量RT-PCR结果显示:对照组、低氟组、中氟组、高氟组甲状腺TPO mRNA表达水平(0.936±0.160、0.368±0.095、0.115±0.018、0.016±0.008)随着氟浓度升高而明显降低,任意两组组间比较差异均有统计学意义(P均＜0.05).结论 长期摄入过量氟抑制甲状腺TPO活性和TPO的表达,影响甲状腺激素合成.     

氟对大鼠甲状腺形态和甲状腺过氧化物酶活性及蛋白表达的影响

目的 观察长期氟过量对大鼠甲状腺形态结构、甲状腺过氧化物酶(TPO)活性及TPO蛋白表达的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 选用雄性SD大鼠40只,按体质量随机分为对照组、低氟组、中氟组、高氟组,每组10只.4组大鼠分别饮用含氟0.40(普通自来水)、15.00、30.00、60.00 mg/L的自来水,均食用普通粮食配制的饲料.喂养180 d后,将大鼠麻醉,取甲状腺组织.在400倍光镜下观察甲状腺组织形态学改变;改良愈创木酚法测定TPO活性;免疫印迹(Western blot)法检测TPO蛋白质表达水平.结果 光镜下,对照组甲状腺滤泡上皮细胞多为单层柱状或立方状,滤泡腔内充满粉红色胶质;低氟组甲状腺滤泡上皮细胞增生活跃;中氟组滤泡增大,滤泡腔内充满深染、黏稠的胶质滤泡;高氟组滤泡上皮细胞明显扁平,滤泡胶质过度浓集,少量滤泡腔甚至有融合,形成巨形滤泡或囊腔.对照组、低氟组、中氟组和高氟组甲状腺细胞TPO活性[(1.572±0.046)、(1.414±0.086)、(1.322±0.049)、(0.960±0.083)U/L]依次降低,组间两两比较差异有统计学意义(P均＜ 0.05);TPO蛋白表达水平(0.335±0.011、0.156±0.027、0.084±0.020、0.045±0.002)依次下降,组间两两比较差异有统计学意义(P均＜ 0.05).结论 长期摄入过量氟可抑制甲状腺TPO活性和TPO蛋白的表达,进而影响甲状腺组织学改变.     

甲状腺激素对体外培养大鼠脑细胞Ⅱ、Ⅲ型脱碘酶mRNA表达的影响

目的观察体外培养的大脑细胞Ⅱ、Ⅲ型脱碘酶(D2、D3)mRNA在甲状腺激素的作用下其表达量的变化。方法取胎龄15～18d Wistar大鼠脑组织,机械分散后接种细胞,培养12d后分成4组,按组分别加入100 nmol／L T3、T4、地塞米松,对照组不做处理。在培养的不同时间收集细胞提取RNA,半定量RT-PCR方法分析D2-mRNA和D3-mRNA的变化。结果 T3作用1、2、4、6 h后,D2-mRNA表达量比对照组降低9％- 11％(t值分别为13．94、5．76、15．01、12-30,p<0．05)。D3-mRNA表达量在作用4、6 h后有明显增加,电泳条带从无到较为清晰。T4作用后,D2-mRNA、D3-mRNA的表达量在各时间点未见明显的变化;地塞米松作用1、2、4、 6 h后,D2-mRNA表达量比对照组上调18％～26％(t值分别为14．29、10．89、15．55、10．38,P<0．05)。结论大鼠脑细胞在体外培养时,T3对D2-mRNA的表达有抑制的作用,对D3-mRNA的表达有促进作用;T4对D2- mRNA、D3-mRNA的表达无明显影响;地塞米松有促进D2-mRNA表达的作用,但不影响D3-mRNA的表达。     

亚硝酸盐对培养心肌细胞的直接作用

应用亚硝酸钠作用于培养的心肌细胞，观察到心肌细胞发生了超微形态结构改变；细胞内α－羟丁酸脱氢酶漏出增加（Ｐ＜０．０５～０．０１），３Ｈ—ＴｄＲ掺入变化呈双向性：小剂量组（０．００１～０．１×１０－６ｍｏｌ／Ｌ）呈现促进作用（Ｐ＜０．０５～０．０１）；大剂量组（１．０×１０－６ｍｏｌ／Ｌ）则表现为抑制效应（Ｐ＜０．０５）。细胞周期分析结果：小剂量组（０．０１×１０－６ｍｏｌ／Ｌ）Ｇ０Ｇ１期细胞减少４．１３％，Ｓ期增长３．９５％，Ｇ２＋Ｍ期增长０．３３％，与对照组比较，无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。大剂量组（１、０×１０－６ｍｏｌ／Ｌ）Ｇ０Ｇ１期细胞增加９．１４％，Ｓ期减少１２．４６％，Ｇ２＋Ｍ期增加４．０６％，其中Ｓ期的改变达到显著差异（Ｐ＜０．０５）；细胞及培养液中脂质过氧化物含量增加（Ｐ＜０．０１）。表明亚硝酸盐能引起培养心肌细胞的直接损伤，其机理与脂质过氧化作用有关。     

碘对大鼠甲状腺钠碘转运体mRNA表达及甲状腺功能的影响

观察不同碘摄入量对大鼠甲状腺钠碘转运体（NIS）mRNA、血清甲状腺激素、尿碘水平以及甲状腺组织碘含量的影响。低碘组NIS mRNA表达明显增强，而血清甲状腺激素、尿碘、甲状腺组织碘含量显著下降。高碘组NIS mRNA表达受到抑制，甲状腺激素有下降趋势。提示NIS是甲状腺自身调节的重要组成部分。高碘、低碘均可导致甲状腺功能低下。     

一氧化氮对人甲状腺细胞钠/碘转运体的影响

目的 研究一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)对体外培养人甲状腺细胞钠／碘转运体(NIS)的作用。方法 采用细胞培养方法，观察不同浓度的SNP对甲状腺细胞摄碘能力和Na^ -K^ -ATP酶的影响，并分析NIS与Na^ -K^ -ATP酶的关系。结果 ①SNP(10^-6-10^-3mol／L)呈剂量依赖性抑制甲状腺细胞碘的摄取，除去SNP继续培养48h，细胞恢复摄碘能力；②SNP(10^-6-10^-mol／L)呈剂量依赖性抑制Na^ -K^ -ATP酶的活力；③NIS与Na^ -K^ -ATP酶呈正相关(r=0．95)。结论 NO能抑制甲状腺细胞NIS的摄碘功能，这可能与NO促进细胞内cGMP水平增加和抑制甲状腺细胞Na^ -K^ -ATP酶有关。     

不同碘营养水平对哺乳期大鼠甲状腺和乳腺钠碘转运体mRNA表达的影响

目的 观察不同碘营养水平对哺乳期大鼠甲状腺和乳腺钠碘转运体(NIS)mRNA表达水平的影响.方法 Wistar大鼠30只,体质量40～60 g.按体质量将大鼠随机分成3组:低碘组(去离子水),适碘组(含碘150 μg/L的去离子水),高碘组(含碘3000μg/L的去离子水),3组均喂合成饲料.喂养3个月后,与雄鼠合笼交配,待母鼠哺乳5 d后处死,取母鼠乳腺、甲状腺及血清.采用温和酸消化法测定血清碘,放射免疫分析法测定血清T_3、T_4水平,实时荧光定量PCR法检测乳腺和甲状腺NIS mRNA表达.结果 哺乳期大鼠血清碘、T_3、T_4、NIS mRNA表达,组间比较差异有统计学意义(F值分别为499.94、16.67、8.49,H=7.58,P均<0.05).血清碘适碘组[(43.42±692)μg/L]高于低碘组[(17.38±3.27)μg/L,P<0.05],高碘组[(350.10±38.46)μg/L]高于适碘组(P<0.05).血清T_3水平,低碘组、高碘组[(1.11±0.25)、(1.61±0.33)μg/L]低于适碘组[(2.18±0.46)μg/L,P均<0.05].血清T_4水平,低碘组[(33.40±11.11)μg/L]低于高碘组[(56.54±10.38)μg/L,P<0.05].甲状腺NIS mRNA表达水平低碘组(0.280±0.030)高于适碘组(0.240±0.030,P<0.05).高碘组(0.069±0.037)低于适碘组(P<0.05).哺乳期乳腺NIS mRNA表达水平高碘组(0.027±0.007)低于适碘组(0.051±0.019,P<0.05).结论 轻度低碘能够提高甲状腺NIS mRNA表达,保护母体免受低碘的危害,但对下一代的保护作用不明显或没有保护作用;高碘抑制甲状腺和乳腺NIS mRNA表达,保护母体及下一代免受高碘的危害.