小鼠成纤维细胞饲养层的制备及C57BL/6小鼠胚胎干细胞系的建立

目的：制备小鼠成纤维细胞饲养层并建立C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ESC）系,为进一步建立人ESC系提供依据。方法：取妊娠12.5~14.5 d的胎鼠,组织消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）;收集C57BL/6小鼠3.5 d的囊胚培养于小鼠制作的饲养层上;分离内细胞团(ICM),扩增传代40代以上。观察ESC集落的生长情况。采用碱性磷酸酶(AKP)染色、免疫组织化学早期胚胎特异性表面抗原(SSEA-1)、八聚体结合转录因子4(OCT-4)染色和体内分化实验对ESC集落进行鉴定。结果：分离培养后得到的ESC可稳定传代至40代以上,且均呈集落样生长。经AKP、SSEA-1和OCT-4染色后ESC均呈红褐色阳性表达,接种于裸鼠均可形成畸胎瘤;HE染色,有3个胚层组织成分。结论：成功建立了C57BL/6小鼠ESC系。     

昆明种系小鼠胚胎干细胞的分离培养及特性鉴定

目的 提高昆明小鼠胚胎干细胞（ES细胞）建株的成功率。方法 收集小鼠3．5d的囊胚培养,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的ES细胞样集落,经两次亚克隆分离培养ES细胞;进行相差显微镜观察、碱性磷酸酶染色和体内外分化能力鉴定。结果 获得两个稳定ES细胞集落,传至第11代。ES细胞呈集落样生长,碱性磷酸酶染色强阳性,体外分化的细胞沿拟胚体外向性生长,形态多样,在体分化可形成来源于3个胚层的组织。结论 两次亚克地获得的细胞具有ES细胞主要的生物学性状,有助于提高昆明小鼠ES细胞建株的能力。     

昆明小鼠胚胎干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外分离培养、诱导胚胎干细胞(ESC)分化为神经干细胞(NSC)的方法.方法 自孕3.5d的昆明小鼠获得附植前的早期胚胎,在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养获得ESC克隆. 进行Oct-4免疫细胞化学鉴定、碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定及体外分化能力的鉴定.在无人重组白血病抑制因子(hLIF)存在的条件下将ESC悬浮培养4d,形成拟胚体(EB),再经全反式维甲酸(RA)诱导4d,在神经干细胞筛选培养基中扩增,采用免疫细胞化学方法检测NSC特异性标志物Nestin的表达.结果 所分离得到的ESC的AKP染色阳性,Oct-4表达阳性,符合ESC的一般特性.ESC经RA初步诱导,NSC选择性培养基筛选培养7d后,形成大量神经球样结构,所形成的神经球样结构呈Nestin抗原阳性.结论 体外分离得到的昆明小鼠ESC经RA诱导后,再经选择性培养基筛选培养可获得大量NSC,有望为神经系统损伤及神经变性疾病提供新的治疗途径.     

体外分离培养Balb/c小鼠胚胎干细胞向神经细胞定向诱导分化

目的: 探讨体外分离培养、诱导胚胎干细胞(ESCs)分化为神经细胞的高效方法. 方法: 自孕3.5 d的Balb/c小鼠获得附植前的早期胚胎,机械剥离法去除胚胎的滋养层细胞获取内细胞团(ICM)分别在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上和明胶包被的培养板中培养获得类ESCs克隆. 进行碱性磷酸酶染色,SSEA-1细胞免疫化学鉴定及体内分化实验鉴定. 模拟体内神经系统发育过程采用序贯诱导方法定向诱导ESCs分化为神经细胞,进行分化后细胞的免疫细胞化学鉴定. 结果: 所分离得到的细胞碱性磷酸酶染色阳性,SSEA-1表达阳性,体内分化实验证实具有多向分化潜能. 符合ESCs的一般特性. 经过序贯诱导方法可以高效诱导ESCs分化为神经细胞. 结论: 体外分离得到的Balb/c小鼠的ESCs经过模拟体内神经系统发育过程经过序贯诱导方法可以高效的诱导为神经细胞,且所获得的神经元比例高.     

两种来源小鼠胚胎干细胞的分离与培养

从小鼠早期胚胎和原始生殖细胞中分离和培养胚胎干细胞(ES细胞).方法:取小鼠3.5天胚龄的囊胚,培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,3 ～4天后分离出内细胞团再培养;取13.5天胚龄胚胎的生殖嵴组织,分离出原始生殖细胞,在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养;观察两种来源的细胞集落生长行为,并用AK P染色鉴定细胞集落.结果:两种来源的细胞集落均具有ES细胞鸟巢状典型特征,AKP染色阳性.结论:两种来源的小鼠胚胎干细胞均可分离和培养.     

大鼠胚胎上胚层干细胞的分离培养研究

目的 获取SD大鼠胚胎中附植后的胚胎上胚层干细胞(EpiSCs),并就影响SD大鼠EpiSCs(SDEpiSCs)分离与培养的组织来源、胎龄、细胞因子等条件进行探讨,从而探索适宜SD大鼠EpiSCs分离培养的实验体系,为下一步SD大鼠EpiSCs的建系提供实验研究基础.方法 以昆明小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层,分别取5.5日胎龄的囊胚和7.5日胎龄囊胚上胚层(Epiblast),用添加白血病抑制因子(LIF)或活化素(activin)的基础培养基进行原代培养,分别采用机械法和胰酶消化法对克隆集落进行传代培养.最后通过碱性磷酸酶染色对克隆集落进行鉴定分析,并检测其体外分化能力.结果 培养于LIF培养基和activin培养基中的囊胚均发生严重分化.培养于LIF培养基中的Epiblast也发生了严重的自发分化,而在activin培养基中,Epiblast形成SDEpiSCs原代集落.经机械法传代获得AKP染色阴性、能形成拟胚体的SDEpiSCs.结论 利用细胞因子activin,结合机械传代法可从7.5日胎龄SD大鼠胚胎中获得SDEpiSCs.     

以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较

目的:比较以STO细胞和人胚胎肺成纤维细胞(hELF)作为饲养层对人胚胎生殖嵴细胞(EG)生长的影响以及经丝裂酶素C处理后的两种饲养层的变化.方法:分离、培养3～4 mo hELF,观察经丝裂酶素C处理STO细胞和hELF后形态学变化,以STO细胞和hELF作为饲养层培养人EG细胞,计数EG细胞集落的形成率以及免疫组化检测EG细胞表面标志物抗阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)和抗阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4).结果:经丝裂霉素C处理后hELF较STO细胞生存时间明显长,形态维持更好;以hELF和STO细胞作为饲养层培养人EG细胞,集落形成率没有明显差异;两种饲养层上形成的集落免疫学特征无明显差异.结论:在培养人EG细胞时,hELF饲养层较STO细胞饲养层更有优势.     

人原始生殖细胞的分离和培养

目的 探讨体外分离培养人原始生殖细胞的条件和方法.方法 分离、培养2～3个月人胚胎的成纤维细胞,经60Co照射后作为饲养层;从5～9周人胚胎的生殖嵴和肠背系膜组织中分离原始生殖细胞,培养在含有bFGF、LIF和Forskolin的人胚胎成纤维细胞饲养层上;同时采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测人原始牛殖细胞阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、SSEA-4以及特异性基因Oct-4、Ifitm-3、stella、Mvh、DAZL的表达,并进行类胚体培养.结果 分离的人原始生殖细胞在饲养层上可以增殖形成典型的鸟巢状集落;细胞染色体均为正常的二倍体核型;阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、SSEA-4表达阳性,同时检测到生殖干细胞特异性基因Oct-4、Ifitm-3、stella、Mvh、DAZI.表达.人原始生殖细胞在悬滴培养时能够形成类胚体,表明其具有多项分化潜能.结论 用人胚胎成纤维细胞作为饲养层进行体外培养人胚胎生殖嵴和肠背系膜组织,分离的原始牛殖细胞形成EG细胞集落,初步鉴定为人胚胎生殖细胞.     

无血清无饲养层条件下培养小鼠胚胎干细胞

目的 研究在无血清无饲养层条件下小鼠胚胎干细胞的培养方法,为最终建立无血清无饲养层培养系统打下基础.方法 比较小鼠胚胎于细胞ES-S8株在无血清培养体系和有血清培养体系中的生长情况,分析ES-S8细胞克隆形成效率,测定其生长速度;然后在撤去血清和饲养层的条件下培养ES-S8细胞,进行AKP染色和表面标记物SSEA-1免疫荧光检测.结果 ES-S8细胞在无血清培养条件下细胞生长速度减缓,克隆形成率降低,但AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性;在无血清无饲养层条件下ES-S8细胞培养仍能形成克隆,且AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性.结论 研究表明ES-S8细胞能够在无血清无饲养层的培养条件下生长,保持其良好的未分化特性.     

SD大鼠胚胎上胚层干细胞的分离与培养

目的从SD大鼠胚胎中获取附植后胚胎上胚层干细胞(post-implantation epiblast stem cells,Episc),并探讨组织来源、胎龄、细胞因子、传代方法等条件对SD大鼠Episc(SD Episc)分离与培养的影响。方法分别取5.5d和7.75d胎龄囊胚上胚层(epiblast),以昆明小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层,于添加白血病抑制因子(leucocyte inbibitory factor,LIF)或活化素(activin)的基础培养基中,进行原代培养。分别采用机械法和胰酶消化法对克隆集落进行传代。最后通过碱性磷酸酶染色对克隆集落进行鉴定分析,并对其体外分化能力进行检测。结果培养于LIF培养基和activin培养基中的囊胚均发生严重分化。培养于LIF的培养基中的epiblast也发生了严重的自发分化。而在activin培养基中,epiblast形成SD Episc原代集落。经机械法传代获得AKP染色阴性、能形成拟胚体的SD Episc。结论利用细胞因子activin,结合机械传代法可从7.75d胎龄SD大鼠胚胎中获得SD Episc。     

无bFGF条件下简便有效建立C57BL/6J小鼠胚胎干细胞系

目的:在不含bFGF的Knockout血清替代品(knockout serum replacement,KSR)的培养条件下,简便、有效地建立小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)系.方法:以C57BL/6J小鼠3.5天囊胚为材料,改良巴氏德管机械法分离内细胞团,于加或不加碱性成纤维细胞生长因...     

建立植入前遗传学检测人胚胎来源的无动物源性干细胞系

【目的】在无动物源性的干细胞培养体系中建立植入前遗传学检测（PGT）胚胎来源的人胚胎干细胞系,为医学研究提供疾病模型。【方法】在我们的研究中,对无动物源性的人类包皮成纤维细胞饲养层（XF-HFF）与成分确定的培养基（CDM）构建的无动物源性培养体系进行了评估。在该培养体系中,利用染色体平衡易位患者PGT来源的废弃胚胎建立一个新的人胚干细胞（hESC）细胞系。【结果】新建立的人胚胎干细胞系在无动物源性培养系统中可长期培养传代（>45个代次）。核型分析显示,在传代45代次后,新建立的人胚胎干细胞仍保持一致的核型。XF-HFF/CDM中的hESC仍保持多能性。通过荧光免疫染色检测到SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81等多能标志物的表达;RT-PCR分析显示,在XF-HFF/CDM培养体系上生长的hESC中存在干细胞标记。小鼠体内实验也证实了hESC在体内维持其多能性。【结论】本研究建立了PGT来源的人胚胎干细胞系,为进一步建立携带遗传疾病基因的hESC系并为临床研究和治疗提供疾病模型打下了基础。     

阶段性胚胎抗原-1，OCT-4，颗粒酶B在脂肪成体干细胞中的表达

目的：探索脂肪成体干细胞中是否表达胚胎时期标志蛋白SSEA-1,OCT-4,GRB．方法：先将C57小鼠脂肪用I型胶原酶消化,然后采用直接贴壁法,培养获得的细胞．取第3代生长状态稳定、形态均一的细胞进行成脂、成骨诱导分化,同时观察所培养的第3代细胞表达胚胎时期标志蛋白SSEA-1,OCT-4,GRB的情况．结果：通过该培养方法,可以获得稳定的细胞群体,并能成功进行成骨、成脂诱导分化;免疫荧光化学检测显示三种胚胎时期出现的特殊蛋白均有不同程度的表达．结论：脂肪来源的成体干细胞中表达胚胎时期的产物,这种特性可能与干细胞的多向分化特性有关系．     

Nestin-GFP小鼠胚胎干细胞的建系及体外神经分化

【目的】 建立Nestin-GFP转基因小鼠的胚胎干细胞(mESC)系,并观察其示踪ES细胞系的神经分化过程。【方法】将E3.5的Nestin-GFP小鼠囊胚接种于小鼠胚胎成纤维细胞上(MEF经γ射线照射失去增殖活性)。4 ~ 6 d后将自囊胚长出的内细胞团(ICM)继续培养并传代扩增 ,检测所得细胞Oct-4、SSEA-1和AKP等胚胎干细胞特异性标志物的表达及在体内外向三胚层分化的能力;之后,诱导细胞向神经元样细胞及神经胶质样细胞分化,利用免疫荧光检测其标志性抗原。【结果】 免疫组化可见Nestin-GFP小鼠胚胎干细胞表达未分化细胞特异性标志Oct-4、SSEA-1、AKP染色呈强阳性,并具有向体内外三胚层分化潜能;在体外诱导其向神经分化,第6 d可见到明显的绿色荧光,并与免疫组化Nestin表达部位基本吻合。第12 d及第16 d分别可见神经元及神经胶质细胞特异性标志物表达,而此时Nestin的表达较前明显下降。【结论】 成功建立了Nestin-GFP小鼠胚胎干细胞系,该细胞具有自我更新的特性及多向分化潜能,并可用于在体外更直观的监测神经分化的阶段性变化并由此进行调控。     

ICR小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作

目的：建立ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系，用于胚胎干细胞建系及研究。方法：选取不同胎龄的鼠胚原代细胞分离成纤维细胞，制作饲养层，使用不同浓度丝裂霉素C处理，以细胞形态、生长曲线、囊胚种植情况为饲养层评价指标。结果：ICR小鼠胚胎成纤维细胞可在胎龄12．5～14．5d进行原代细胞分离；12．5d为最佳分离时间；13．5和14．5d分离的细胞需在3代以后使用；6代以前细胞可用于饲养层制作；20mg/L丝裂霉素C作用2．5h可达到较好的处理效果。结论：ICR小鼠可用来分离、培养胚胎成纤维细胞，用于胚胎干细胞饲养层的制作。     

人胚胎干细胞系的初步建立

目的：探讨人受精卵建立人胚胎干细胞系。方法：将体外受精获得的人受精卵发育至胚胎泡期,用机械法去除胚泡透明带后,取出内细胞团,分散后接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,进行传代培养。通过碱性磷酸酶染色、胚胎干细胞特异性表面标志物检测、染色体核型分析和严重联合免疫缺陷（SCD）小鼠体内畸胎瘤形成实验,对连续传代的细胞进行鉴定。结果：9枚受精卵在体外培养5-7d后,5个存活并发育为胚泡,取出的内细胞团经接种培养,3个内细胞团存活,呈克隆性生长,发育为胚胎干细胞,并连续体外传代7个月保持未分化状态,建系成功。3个细胞系分别命名为CHE1、CHE3和CHE3。取3个细胞系第5、15和30代的细胞进行碱性磷酸酶染色,均为阳性。对CHE3第25、30、40代、CHE1和CHE2第21、22、30代的细胞检测人胚胎干细胞表面标志SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60和GCTM-2,结果均为阳性;检测小鼠胚胎干细胞表面标志SSEA-1,结果为阴性。染色体核型分析为二倍体核型。将连续传代5个月后（30代左右）的3个细胞系接种到SCID小鼠体内,6周后均形成畸胎瘤,组织病理学检查显示含有3个胚层的组织结构。结论：使用5个人受精卵来源的胚泡,成功地在体外建立了3个胚胎干细胞系,长期传代后仍保持胚胎干性和多向分化的能力。