豆豉纤溶酶的分离纯化及部分酶学性质研究

 目的 从豆豉中分离出具有强纤溶活性的菌株,从该菌株的发酵液中纯化出纤溶酶并对此纤溶酶的部分酶学性质进行研究。方法 利用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱和Sephadex G-75凝胶过滤色谱等方法进行纯化;利用N-末端氨基酸序列测定及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对此酶进行鉴定。结果 从发酵液中获得了纤溶酶单一组分,表观相对分子质量为30×10³。该纤溶酶在50 ℃以下和pH 7.0~9.0之间保持稳定,最适温度为35 ℃;最适pH为8.6。N-末端氨基酸序列及飞行时间质谱测定结果都表明该酶与纳豆激酶氨基酸序列有着极高的相似性。结论 获得了纤溶酶单一组分,为纤溶酶发酵产品的大规模纯化和进一步研制开发新的溶栓药物提供重要理论依据。     

淡豆豉炮制中黄曲霉毒素产毒株的筛选鉴定和产毒能力测定

目的 对淡豆豉炮制过程中产黄曲霉毒素(aflatoxins,AFTs)的微生物(简称产毒菌)进行筛选鉴定、定量分析和产毒能力测定.方法 运用紫外荧光法初筛淡豆豉炮制中各样本的产毒菌并菌落计数;对初筛菌株的18S rDNA序列进行PCR扩增、测序,测序结果经NCBI同源性比对、MEGA7.0软件构建系统发育树进行分子生物...     

淡豆豉炮制过程中产γ-氨基丁酸微生物的筛选和鉴定

课题组前期发现淡豆豉中存在较高含量的γ-氨基丁酸(GABA),该研究对淡豆豉炮制过程中不同时间点的样本进行产GABA微生物的筛选和鉴定,为研究淡豆豉炮制机制奠定基础。按2010年版《中国药典》制备淡豆豉,获取淡豆豉炮制过程中不同时间点的样本;用选择性培养基分别对不同时间点样本中的细菌、真菌进行培养、分离纯化,挑选优势菌种;将各优势菌分别接种在指定的液体培养基中进行培养,制备各优势菌发酵液;采用薄层色谱法对各菌株发酵液GABA进行定性初筛,对初筛中有GABA斑点的发酵液采用该实验室已建立的柱前在线衍生-高效液相色谱法进行定量检测,从优势菌中筛选产GABA的微生物;应用16S rDNA,18S rDNA序列分别对产GABA的细菌和真菌进行PCR扩增、对扩增产物进行测序,测序结果通过NCBI同源性比对、MEGA 7.0软件构建系统发育树进行分子生物学鉴定。该实验筛选并鉴定出9种产GABA微生物,分别是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,屎肠球菌Enterococcus faecium,鸟肠球菌Enterococcus avium,溜曲霉Aspergillus tamarii,黄曲霉Aspergillus flavus,黑曲霉Aspergillus niger,极细支孢霉Cladosporium tenuissimum,桔青霉Penicillium citrinum,白腐菌Phanerochaete sordida。该研究首次从淡豆豉中筛选出9种产GABA微生物,多种产GABA的优势微生物在淡豆豉GABA的形成中可能起重要作用。     

基于16S rDNA序列分析研究根腐病三七根内可培养细菌的多样性

目的 分析根腐病三七根内可培养细菌的多样性。方法 用牛肉膏蛋白胨培养基分离根腐病三七根内的细菌,经细菌通用引物27F/1492R扩增16S rDNA后,分别用Rsa I和Hin6 I限制性内切酶对扩增产物进行酶切,结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析方法和DNA测序技术,对分离自根腐病三七根内的细菌进行初步鉴定。结果 根腐病三七根内的细菌分属于8个类群,依占总菌数的比例分别是芽孢杆菌属Bacillus 22.47%、无色杆菌属Achromobacter 5.62%、寡养单胞菌属Stenotrophomonas 5.62%、类芽孢杆菌属Paenibacillus 4.49%、鞘氨醇杆菌属Sphingobacterium 1.12%、苍白杆菌属Ochrobactrum 1.12%、不动杆菌属Acinetobacter 1.12%及肠杆菌科的一些属58.43%。结论 泛菌属和芽孢杆菌属是根腐病三七根中的两大优势细菌类群。     

淡豆豉中产γ-氨基丁酸微生物对产毒黄曲霉菌的拮抗作用和毒素合成关键基因mRNA表达的影响

目的 考察从淡豆豉Sojae Semen Praeparatum（SSP）炮制过程中分离的15株产γ-氨基丁酸微生物对产毒黄曲霉菌的拮抗能力并筛选出具有抑制产毒黄曲霉菌生长和降解黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁,AFB₁）的高效拮抗菌,探究高效拮抗菌发酵产物对黄曲霉毒素（aflatoxins）合成关键基因mRNA表达量的影响。方法 运用平板对峙法与十字交叉法检测15株产γ-氨基丁酸微生物及其发酵产物对产毒黄曲霉标准株（简称：产毒标准株）生长的影响,超高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography mass spectrometry,UPLC-MS/MS）检测15株菌对AFB₁的降解效果,考察其对产毒黄曲霉菌的拮抗能力并筛选出高效拮抗菌;针对高效拮抗菌发酵产物分别运用菌丝干重法检测其对产毒标准株菌丝生长的影响,实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测其对黄曲霉毒素合成关键基因（aflR、aflD、aflM、aflP）mRNA表达的影响。结果 15株菌及其发酵产物对产毒标准株的生长抑制率分别在15.88%～56.05%和25.74%～52.12%,对AFB₁降解率在2.74%～57.87%,表明它们对产毒黄曲霉菌均有一定的拮抗作用,并筛选出具有高效拮抗作用的黑曲霉菌Aspergillus niger（JC2）和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（Xd1）。当高效拮抗菌发酵产物加入量为2 000 µL时,JC2和Xd1对产毒标准株菌丝生长的抑制率分别为73.82%和63.34%,且能明显抑制黄曲霉毒素合成关键基因aflR、aflD、aflM、aflP的mRNA表达。结论 淡豆豉炮制中存在既能产γ-氨基丁酸又能明显抑制产毒标准株生长和产毒的拮抗菌,其拮抗作用可能通过抑制产毒标准株菌丝生长和毒素合成关键基因的mRNA表达。     

芽孢杆菌发酵炮制中药红花增强溶血栓药效研究

目的利用具有高纤溶酶活性的地衣芽孢杆菌C213发酵炮制中药红花以增强整体溶血栓药效的研究。方法应用系统数值化及数值系统调控技术对发酵炮制条件进行优化,用角叉菜胶法进行了小鼠尾部血栓实验及测定了大鼠纤溶及凝血指标。结果在同等剂量下(1000U·mL^-1)A红发组(红花与C213共发酵组)比其余各组均有缩短血栓长度(P<0.01);明显延长凝血酶原时间(PT)(P<0.05)、凝血酶时间(TT)(P<0.05)和活化的部分凝血活酶时间(APTT)(P<0.01);显著缩短优球蛋白溶解时间(ELT)(P<0.01)的作用。结论红花通过C213菌种发酵炮制后可提高纤溶活性、抗凝作用,增强溶血栓药效。     

气相色谱测定保健食品中3种植物甾醇的含量

目的：建立同时测定淡豆豉中6种异黄酮类成分的分析方法,并研究炮制工艺对淡豆豉药材中异黄酮类成分的影响。方法：自行发酵淡豆豉并采用高效液相色谱法测定其异黄酮含量,使用岛津SB-C₁₈ HPLC 色谱柱（4.6 mm×150 mm,5 μm）;以0.2%甲酸乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱;采用全波长紫外检测器扫描;流速1 mL·min^-1,柱温35 ℃。结果：淡豆豉中各异黄酮色谱峰的分离度良好,在一定范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系（r>0.999）,平均加样回收率在93.16%~109.98%,RSD均<3.76%,并发现炮制过程中苷含量逐渐降低,苷元含量逐渐升高。结论：该方法操作简便、稳定、可靠,可用于淡豆豉多指标成分的含量测定,同时证明6~8 d的发酵条件最利于苷类成分的水解,较适合淡豆豉的发酵。     

基于磁珠配体垂钓和液相色谱-质谱联用技术的威廉环毛蚓抗血栓大分子活性成分研究

目的 通过构建靶蛋白固定化磁珠,从威廉环毛蚓Pheretima guillemi中垂钓出与靶蛋白（纤维蛋白原、纤溶酶原）直接作用的抗血栓活性大分子成分,并经液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术鉴定。方法 优化并合成纤维蛋白原、纤溶酶原固定化羧基磁珠,分别通过固定化量、透射电镜、傅里叶红外光谱仪、激光纳米粒度分析仪表征功能化磁珠的靶蛋白固定量、微观形态、官能团及表面带电性;利用功能化磁珠从威廉环毛蚓抗血栓部位DPf3中垂钓与靶蛋白直接作用的抗血栓大分子活性成分,洗脱后经LC-MS/MS技术分析,并结合威廉环毛蚓物种蛋白质数据库比对鉴定。结果 靶蛋白固定化磁珠的最佳制备方案为将纤维蛋白原（0.4 mg/mL）或纤溶酶原（1 mg/mL）与磁珠于4 ℃混旋孵育8 h,纤维蛋白原和纤溶酶原的最大偶联量分别为（9.84±2.17）μg/mg和（7.24±0.91）μg/mg;经表征,靶蛋白均已成功固定于磁珠表面。DPf3经纤维蛋白原、纤溶酶原固定化磁珠垂钓所得洗脱液经扫描比对,分别鉴定到20种和27种蛋白质,多属于丝氨酸蛋白酶类成分。结论 通过磁珠配体垂钓策略和LC-MS/MS技术可从威廉环毛蚓中快速筛选和鉴定目标生物活性大分子,可为动物类中药大分子的分离鉴定提供参考。     

药用植物内生菌对乌苏酸的微生物转化筛选

 目的 从药用植物蛇足石杉分离纯化内生菌,并筛选可以转化乌苏酸的菌株,以期探究利用药用植物内生菌对乌苏酸进行结构修饰和改造的可行性。方法 通过组织块法分离内生菌;用薄层色谱检测转化反应的发生;用CTAB法提取转化菌株的基因组DNA,PCR技术对其ITS rDNA进行扩增,再经Blast比对鉴定菌株。结果 从药用植物蛇足石杉的茎和叶中分离得到内生菌52株,用30株对乌苏酸进行转化筛选。有4株内生菌具有转化乌苏酸的能力,经表观形态及分子生物学的方法鉴定转化菌株,分别是Pestalotiopsis microspora,Colletotrichum gloeosporioides,Fusarium chlamydosporum,Arthrinium. sp。结论 从转化产物的结构可以得出结论,利用药用植物内生菌对天然活性成分乌苏酸进行微生物转化,可以丰富乌苏酸的结构类型,为获得活性更好的衍生物提供技术和方法基础。     

潜阳活血通络方对急性脑梗死患者纤溶系统的影响

目的： 探讨潜阳活血通络方治疗急性脑梗死的临床疗效及对纤溶系统的影响。 方法： 将76例患者采用随机按入院前后分为对照组和观察组各38例。两组均参照“中国急性缺血性脑卒中诊治指南 2010”给予西医常规治疗,包括控制血压、血糖、体温,抗凝、抑制血小板等措施。观察组在对照组治疗的基础上加用潜阳活血通络方,1剂/d,两组疗程均为14 d。采用临床神经功能缺损评分（CSS评分）评价神经损害程度,采用Fugl-Meyer运动功能评价量表（FMI）评估肢体运动功能,采用改良Ashworth痉挛评定量表评价肢体痉挛程度,采用发色底物法检血浆组织纤溶酶原激活物（t-PA）和组织纤溶酶原抑制物（PAI）含量,采用免疫比浊法检测纤维蛋白原（FIB）,采用酶联免疫吸附法免疫测定D-二聚体（D-D）和血管假性血友病因子（vWF）,以上指标治疗前后各进行1次评价。 结果： 治疗后两组CSS评分和改良Ashworth评分均较治疗前下降,观察组低于对照组（P<0.01）;两组治疗后FMI评分较治疗前上升,观察组高于对照组（P<0.01）;治疗后两组t-PA均治疗前上升,观察组高于对照组（P<0.01）;观察组PAI水平降低,并低于对照组（P<0.01）;两组治疗后血浆FIB,D-D和vWF水平均较治疗前下降（P<0.01）,观察组FIB,D-D和vWF水平均低于对照组（P<0.01）;观察组总有效率92.11%,对照组73.68%,观察组优于对照组（P<0.05）。 结论： 潜阳活血通络方能通过调节纤溶系统功能,有效溶解血栓,抑制血栓形成,从而改善病变部位的供血,促进了神经功能的恢复。     

PCR-DGGE技术研究淡豆豉炮制过程中微生物菌群的动态变化

目的采用PCR-变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术研究淡豆豉Sojae Semen Praeparatum炮制过程中微生物菌群的动态变化,为揭示其炮制机制奠定基础。方法运用PCR-DGGE技术研究淡豆豉炮制不同时间的样本中细菌、真菌菌群种类和数量的动态变化,通过非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚类分析各炮制时间点的菌系差异。结果发酵至"黄衣上遍"过程中细菌种类丰富,真菌以曲霉菌为主;再闷过程中细菌以乳杆菌为主,真菌以隐球菌为主。发酵第1天恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌占优势;发酵第3天嗜麦芽寡养单胞菌、鞘氨醇杆菌属和米曲霉为优势菌种;发酵第6天解淀粉芽孢杆菌、曲霉菌和丝孢酵母为优势菌种;再闷第3天以枯草芽孢杆菌、丝孢酵母和黑曲霉占优势;再闷第9天以枯草芽孢杆菌、那须乳杆菌、弧形乳杆菌和隐球菌为优势菌株;再闷第15天以枯草芽孢杆菌、弧形乳杆菌、隐球菌、丝孢酵母属和2株不可培养真菌为优势菌。整个炮制过程中,产酸克雷伯氏菌、枯草芽孢杆菌、弧形乳杆菌作为优势菌种始终参与。"黄衣上遍"阶段与再闷阶段的微生物群落结构差异大。发酵第3天与第6天的细菌、真菌群落结构相似度最高,分别达76.4%和66.1%;而发酵第3、6天与再闷第9天的细菌群落结构相似度均最低,仅为24.5%,发酵第3天与再闷第15天真菌群落结构相似度最低,仅11.2%。结论炮制过程中微生物群落结构的动态变化和独特的微生物种类可能决定了淡豆豉特有的性味、功能,同时也从微生物学角度印证了再闷的重要性。     

西瓜霜发酵菌种的分离及鉴定

目的 对西瓜霜中的发酵菌种进行分离、鉴定,探讨西瓜霜发酵炮制的内涵,为西瓜霜的规范化生产和质量控制方法的建立提供依据。方法 模拟传统工艺生产西瓜霜的温度、湿度等条件,以西瓜为培养基,发酵制备西瓜霜,分别用PDA、CZA及Sabourand等培养基,采用平板划线法,分离、纯化西瓜霜发酵液中的微生物。采用形态学鉴定及DNA的ITS序列对比法鉴定分离出的菌种。结果 西瓜霜炮制发酵中共分离鉴定出6种真菌,分别为镰孢霉属Fusarium的WF-1,青霉属Penicillium的WF-2,毛霉属Mucor的WF-3,交链孢霉属Alternaria的WF-4、WF-5、WF-6。结论 西瓜霜的制备是以西瓜为培养基,在特定的环境条件,尤其是高盐条件下,通过耐高盐自然真菌发酵炮制而成,而不是传统上认为的渗析制成的芒硝的细小结晶。     

基于微生物快速鉴定系统对金黄色葡萄球菌耐药性鉴定新评估方法的建立

目的:探讨微生物快速鉴定系统(MALDI-Biotyper System)用于快速鉴定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.a),临床分离金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.a)耐药性情况的可行性。方法:通过采用微生物快速鉴定系统及肉汤稀释法进行鉴定质控、临床分离金黄色葡萄球菌的耐药性情况,并将微生物快速鉴定系统检测结果与肉汤稀释法最低抑菌浓度(MIC)值进行比较分析,最后通过同步鉴定铜绿假单胞菌耐药性情况确定微生物快速鉴定系统的准确性及适用性。结果:微生物快速鉴定系统评分鉴定结果显示敏感质控菌株金黄色葡萄球菌评分值大于2.000,耐药质控菌株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.a,MRSA)评分值在1.700~2.000。临床分离金葡菌评分鉴定结果均在1.700~2.000,显示耐药,与肉汤稀释法MIC值结果一致。同时,无关质控敏感菌株铜绿假单胞菌的系统评分鉴定值大于2.000,显示敏感,其本身为敏感菌株,结果一致。结论:微生物快速鉴定系统评分方法可以用于金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌耐药性情况的快速鉴定。     

豆豉AprE9912D血栓溶解酶的制备与活性评价

目的 通过基因工程技术生产的豆豉血栓溶解酶,研究其安全性及溶栓功效.方法 采用酪蛋白平板从豆豉中分离获得具有纤溶活性的候选菌株,利用基因工程技术将其AprE9912D基因在大肠杆菌BL21(DE3)-pDEl中过表达AprE9912D重组蛋白.经过Ni-NTA纯化柱和透析纯化AprE9912D重组蛋白,体外采用纤维蛋白...     

桃儿七茎部产鬼臼毒素类成分的内生真菌筛选及鉴定

目的:筛选和鉴定濒危藏族药桃儿七茎部产鬼臼毒素类成分的内生真菌,为保护桃儿七植物资源和发现新的天然活性菌株提供参考。方法:采用组织块法对桃儿七茎部的内生真菌进行分离,利用TLC和HPLC检测其代谢产物中的鬼臼毒素类成分,检测波长254 nm,流动相乙腈-水(40∶60)。采用形态学和分子生物学相结合的方法对产鬼臼毒素类成分的内生真菌进行鉴定。结果:共分离得到9株内生真菌,其中菌株J-1,J-2,J-3的发酵液中含有鬼臼毒素类成分,分别鉴定为Chaetomium globosum strain MF564,C.sp.4RF3和Pseudallescheria sp.T55。结论:从桃儿七茎中分离到3株产鬼臼毒素类成分的内生真菌,分别来源于2个新属的不同种菌株,为开发新绿色生物能源和实现内生真菌工业发酵生产鬼臼毒素类成分奠定了理论基础。     

铁皮石斛内生真菌的分离及其体外抑菌和抗肿瘤活性初步研究

目的分离铁皮石斛Dendrobium officinale内生真菌,研究内生真菌的分布并初步探讨和筛选具有抑菌和抗肿瘤活性的特异菌株。方法利用组织分离法和分子生物学方法分离、鉴定内生真菌;以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌作为受试对象,采用对峙法和管碟法分别对内生真菌及其发酵代谢产物的醋酸乙酯萃取相进行抑菌实验;采用MTT法对内生真菌代谢产物醋酸乙酯萃取相进行体外抗肿瘤活性检测。结果从铁皮石斛中分离得到28株内生真菌,分子鉴定结果显示,分离的内生真菌归属于10个属,其中镰刀菌属为优势属。抑菌实验结果显示28株内生真菌中,有7株至少能对1种指示菌有抑菌作用,其代谢产物的醋酸乙酯萃取相对3种指示菌和Hep G2细胞具有不同程度的抑制作用。结论铁皮石斛内生真菌种群丰富,从中分离得到的内生真菌具有潜在的抑菌和抗肿瘤活性,为进一步开发抑菌、抗肿瘤候选药物奠定基础。     

宁夏枸杞内生菌的抗菌和抗肿瘤活性研究

为筛选具有抗菌抗肿瘤活性的枸杞内生菌资源,对分离自宁夏枸杞的10株内生菌发酵液的抑菌活性和体外细胞毒活性进行检测,通过ITS和16S rDNA序列分析对菌株进行了分子鉴定。结果表明,5株内生真菌对供试病原菌都未表现出抑制活性,放线菌AL6对3种病原真菌都有一定的抑制作用,而AL5仅对金黄色葡萄球菌有较强抑制活性。但内生真菌的抗肿瘤活性明显强于放线菌。当发酵液浓度为0.2 g·L~(-1)时,有4株内生真菌至少对1种肿瘤细胞的抑制率高于50%。序列分析表明,5株内生真菌隶属于曲霉属、青霉属和翘孢霉属。5株内生放线菌隶属于链霉菌属、微球菌属和拟诺卡氏菌属。曲霉属菌株FL1对A549和HeLa细胞的抑制活性都较强,其IC_(50)分别为0.022,0.028 g·L~(-1),值得进一步研究。     

红树共附生棘孢曲霉CGD12的次级代谢产物及其抑菌活性

目的: 分离一株红树来源的棘孢曲霉CGD12的次级代谢产物并检测它们的抑菌活性。方法: 采用正反相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、半制备高效液相色谱等方法对菌株发酵产物的乙酸乙酯萃取部分进行分离和纯化,利用NMR,MS等波谱分析方法确定化合物的结构;利用微量肉汤稀释法进行抑菌活性评价。结果: 从菌株发酵液乙酸乙酯提取物中分离鉴定了7个化合物,分别为:versiol (1)、JBIR74(2)、JBIR75(3)、环(L-脯氨酸-L-酪氨酸)(4)、环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)(5)、环(L-脯氨酸-L-异亮氨酸)(6)、环(L-脯氨酸-L-亮氨酸)(7),其中化合物4,7对金黄色葡萄球菌 (S. aureus)和表面葡萄球菌(Staphyloccocus epidermidis)的生长显示出一定的抑制活性,而化合物3对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellar pneumonia)和大肠埃希菌 (Escherichia coli)具有较弱的抑菌活性。结论: 从棘孢曲霉菌株CGD12中分离到7个已知的化合物,其中化合物3,4和7分别具有一定的抑菌活性。     

乌头霜霉病病原菌rDNA-ITS和28S rDNA D1/D2区序列分析

目的明确四川江油地区栽培乌头霜霉病病原菌乌头霜霉Peronospora aconiti rDNA-ITS和28 S rDNA D1/D2区序列,为病害诊断和防治提供理论基础。方法从病株收集病原菌分生孢子及菌丝,提取DNA,扩增rDNA-ITS和28 S rDNA D1/D2片段序列,进行测序分析,并构建邻接(neighbor-joining,NJ)发育树分析病原菌种类。结果检测出的病原菌rDNA-ITS序列与NCBI数据库中霜霉属P.pulveracea、P.aparines相似度为94%,28 S rDNA D1/D2区序列与霜霉属P.pulveracea、P.ficariae、P.bulbocapni相似度达97%。结论分子rDNA-ITS和28 S rDNA D1/D2区序列鉴定的结论和形态学鉴定的结论一致,乌头霜霉病病原菌为霜霉科霜霉属乌头霜霉Peronospora aconiti Yu,其rDNA-ITS和28 S rDNA D1/D2区序列可用于该病原物的鉴定。