再造组织工程尿路移行上皮组织的实验研究

目的采用组织工程技术，将培养扩增的膀胱移行上皮细胞与可降解的聚乳酸／聚羟基乙酸共聚物（polylactical／glycolic acid copolymer，PLGA）支架材料复合并植入裸鼠体内进行培育，探讨构建尿路移行上皮组织的可行性。方法取幼兔膀胱，机械分离与酶消化法获取膀胱移行上皮细胞，并在体外行原代培养与传代扩增，将第4～5代扩增的上皮细胞接种至8个PLGA聚合材料的表面作为实验组，4个单纯支架材料作为对照组。实验组：细胞材料复合体培育4周和8周各4个，对照组：单纯支架培育4周和8周各2个，分别植入各组裸鼠体内进行培育，按各时间点取出标本后进行大体观察、组织学及免疫组织化学检测。结果实验组标本经HE和马森染色，4周显示在材料表面形成数层上皮细胞；8周移行上皮细胞进一步增殖形成上皮组织，抗角蛋白免疫组织化学染色，胞浆呈棕黄色阳性。对照组4周和8周经HE染色材料表面见少量成纤维细胞沉积，马森染色呈蓝色，经抗角蛋白免疫组织化学染色为阴性。结论采用组织工程技术可再造人尿路移行上皮组织，为尿路组织工程进一步实验研究奠定了基础。     

犬膀胱平滑肌细胞的体外连续培养

目的通过体外培养不同代次的犬膀胱平滑肌细胞,比较其生物学特征,探讨多次传代后的平滑肌细胞作为种子细胞的可行性,为构建组织工程膀胱和尿道筛选种子细胞提供方法和依据。方法取体重10～12kg的12月龄雄性犬膀胱肌层,混合酶消化法获取平滑肌细胞,并于含10%小牛血清的培养基中培养,观察比较不同代次细胞的形态变化及生长、增殖过程,电镜下观察细胞超微结构,并通过免疫组织化学方法检测特征性蛋白的表达。结果体外培养的平滑肌细胞单层生长至亚融合状态后,倒置相差显微镜下细胞呈长梭形,并呈峰-谷样结构,可连续传至12代。生长曲线显示第7代以前的细胞具有相似的增殖特点,约每40小时为1次生长周期,透射电镜下可见平滑肌细胞特有的密体结构,平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色为阳性;第7代后细胞增殖逐渐迟滞,至第10代细胞内肌丝及密体结构消失。结论犬膀胱平滑肌细胞可在体外连续培养,通过适当的纯化方法可获得大量高纯度的平滑肌细胞。第7代以前的平滑肌细胞均可作为种子细胞,用于构建组织工程膀胱和尿道。     

膀胱移行上皮细胞的体外培养研究

目的：探索并建立大鼠膀胱移行上皮细胞的体外培养方法，为膀胱癌相关研究提供实验依据。方法：获取Wistar大鼠膀胱粘膜，采用Dispase酶消化法收集上皮细胞。动态观察细胞形态变化、生长增殖情况；对培养细胞进行细胞周期检测及超微结构观察，并行免疫组织化学鉴定。结果：培养细胞为二倍体移行上皮细胞，无成纤维细胞混杂生长。免疫组织化学证实角蛋白染色阳性。结论：膀胱移行上皮细胞体外培养为体外研究提供了理想的模型。     

显微剥离酶消化法体外培养人胚胎食管鳞状上皮细胞的方法研究

目的 探讨利用显微剥离酶消化法行人胚胎食管鳞状上皮细胞原代培养的可行性，并对所得细胞进行纯化及传代培养。方法选择意外流产20周龄胎儿食管标本，通过显微剥离法获得菲薄食管黏膜上皮，经短时酶消化分离所得细胞，在10％胎牛血清混合培养基中培养，通过倒置显微镜、透射电镜及免疫组织化学方法鉴定所得细胞，并测定其生长曲线。结果倒置显微镜下见细胞呈不规则圆形或多边形，透射电镜可见其具有鳞状上皮细胞特征性的张力微丝，细胞表面微突起，细胞角蛋白免疫组织化学染色胞浆呈棕黄色阳性表现，MTT法测定第2代细胞在传代培养3～4d达生长高峰。3、4d吸光度（A）值与1、2、5及6d比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论通过显微剥离酶消化法可获得足量、较纯食管鳞状上皮细胞，混合培养基中细胞能快速传代、扩增，适宜作为种子细胞构建组织工程食管。     

两种体外培养兔膀胱变移上皮细胞方法的比较

目的 比较组织贴块法和酶消化法体外培养兔膀胱变移上皮细胞的优缺点,探索简单、高效培养膀胱变移上皮细胞的方法,为膀胱组织工程种子细胞的培养提供实验基础。方法 采用组织贴块法和酶消化进行兔膀胱变移上皮细胞体外培养,相差显微镜下观察其生长特点,应用细胞免疫荧光染色对细胞进行鉴定,测定细胞生长曲线了解细胞生长的基本规律。结果 培养的细胞具有上皮细胞的典型形态,生长曲线呈“S”形,角蛋白（CKAE1/AE3）单克隆抗体免疫荧光染色阳性,波形蛋白染色阴性。结论 组织贴块法和酶消化法均能成功培养出兔膀胱变移上皮细胞。组织贴块法原代培养时间长,但是成功率高。酶消化法可以在较短时间内获取大量细胞,但是操作步骤多,细胞容易污染或损伤。     

上皮细胞条件培养液对BMSCs分化的影响

目的 探讨上皮细胞条件培养液(epithelial cell conditioned medium,ECCM)体外诱导犬BMSCs向上皮细胞分化的可行性.方法 成年健康雄性比格犬1只,体重10 kg.于犬髂后上棘采用骨髓穿刺法取骨髓5 mL,分离培养BMSCs.取犬口腔黏膜下组织,剪成约4 mm×4 mm大小,制备ECCM.取第2代BMSCs以2×104个/孔细胞密度接种,实验组于ECCM中培养,对照组于低糖DMEM完全培养基中培养.观察两组细胞形态特征,MTT法绘制生长曲线,诱导培养21 d免疫组织化学染色鉴定上皮细胞特异性标志物--细胞角蛋白19(cytokeratinl9,CK-19)和细胞角蛋白AE1/AE3,透射电镜观察细胞超微结构.结果 倒置相差显微镜下见两组细胞均呈长梭形,均匀分布,折光性较强,增殖迅速.两组细胞生长曲线均呈"S"形,实验组生长曲线较对照组右移,提示ECCM对细胞增殖有抑制作用.实验组CK-19和细胞角蛋白AE1/AE3免疫组织化学染色均呈阳性反应,对照组呈阴性.透射电镜下实验组细胞胞浆内可见紧密连接.结论 ECCM体外有诱导同种BMSCs向上皮细胞分化的作用.     

人正常尿路移行上皮细胞无血清培养

目的建立一种比较简便的人正常尿路上皮细胞无血清培养方法。方法标本组织块用冷消化法分离出尿路上皮细胞,培养于无血清生长培养基。观察传代细胞形态及生长情况,并用ＴＧＦβ１抑制细胞增殖试验检验细胞在有血清或无血清培养基中对ＴＧＦβ１的反应。结果培养的总成功率为７３％,细胞具有典型的移行上皮细胞形态学特征,细胞能在２４小时后增殖进入对数生长期,传代９～１１次后开始衰退。另外,无血清培养体系比含血清培养体系更能反映出ＴＧＦβ１对细胞抑制作用。结论此培养体系具有简单、短期内可扩增出大量纯净上皮细胞、应用范围广和培养成功率高的特点。     

聚羟基乙酸作为支架材料体外构建复层膀胱壁结构的探讨

目的：探讨聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA）作为支架材料并复合成年猪膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞,体外构建复层膀胱壁结构的可行性。方法：采用PGA作为支架材料。并以聚乳酸（polylact acid,PLA）塑形。以酶消化法分别获得猪膀胱尿路上皮细胞和平滑肌细胞,并体外扩增。以MTT法分别检测P3代膀胱平滑肌细胞（SMC）和尿路上皮细胞（UC）的体外增殖能力。将P3代膀胱平滑肌细胞先接种在支架上,再接种尿路上皮细胞。将细胞一材料复合物体外培养1～2周并行组织学鉴定。结果：酶消化法获得的膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞经过体外培养仍具有较强的体外增殖能力。细胞材料复合物体外培养1周后形成分层排列结构,包括黏膜上皮层和膀胱平滑肌层。免疫组织化学显示平滑肌层α-Smooth Muscle Actin表达阳性,黏膜上皮层广谱角蛋白表达阳性。而细胞材料复合物继续体外培养至2周,细胞从支架上大量脱落。结论：PGA适合作为复层膀胱壁结构体外构建的支架材料。采用PGA作为支架材料并复合膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞,可以体外构建出类似复层膀胱壁结构。细胞材料复合物体外培养1周左右较适合进行体内回植修复。     

人体尿道粘膜上皮细胞的连续培养

目的：探讨人尿道粘膜上皮细胞体外培养技术，为构建组织工程化尿道提供种子细胞。方法：取尿道下裂患者尿道粘膜，经中性蛋白酶和胰蛋白酶消化，获取粘膜上皮细胞接种于含8％胎牛血清培养基中连续培养，观察细胞形态变化及生、增殖过程。结果：体外培养细胞长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观，体外可连续传9-10代，生长期50-60d。细胞角质蛋白免疫组织化学染色阳性，透射电镜下可见上皮细胞间特有的桥粒结构。结论：尿道粘膜上皮细胞可在体外连续培养，4代以内的培养细胞可用于组织工程化尿道的构建。     

尿道移行上皮细胞与生物可降解尿道支架体外复合培养的研究

目的：研究体外培养的兔尿道上皮细胞在生物可降解性网状尿道支架上的贴附和生长增殖情况,观察其对尿道上皮细胞形态和功能的影响,利用组织工程技术培养种植细胞的尿道内支架。方法：应用机械分离与酶消化法分离培养兔尿道移行上皮细胞,并在体外行原代培养与扩增后制成细胞悬液接种在网状尿道支架上,形成尿道移行上皮细胞-支架复合物。采用免疫组织化学、荧光染色法鉴定尿道上皮细胞及其活性;采用倒置显微镜、扫描电镜观察尿道上皮细胞在支架表面吸附与生长状态。结果：网状尿道支架具有良好的生物相容性,能使尿道移行上皮细胞增殖,不影响其活性。尿道移行上皮细胞在尿道支架上贴附生长良好,1～2天后完全贴壁,3～7天细胞生长增殖活跃,支架网眼内充满上皮细胞,长期培养仍保持尿道移行上皮细胞特性,扫描电镜可见上皮细胞与网状支架贴附紧密,适度伸展并有基质分泌。结论：网状尿道支架适合尿道移行上皮细胞黏附生长．可作为尿道组织工程的细胞载体,利用组织工程方法可获得适于移植尿道细胞的组织工程化尿道。     

Ultrastructure of cultured normal bladder transitional epithelial cell and BBN induced rat bladder tumor cell lines

A normal rat bladder transitional epithelial cell line and seven tumor cell lines cultured from tumor induced by 0.05% N-Butyl-N-4-hydroxybutyl-Nitrosamine (BBN) were established and a comparative study on the doubling time and Ultrastructure of the cultured cell lines was performed. 1. Seven cultured cell lines (TU-B1 1-7) were obtained from bladder tumors induced by the administration of BBN for 32 weeks. 2. The doubling time of the cultured tumor cell lines were 43, 24, 28, 24, 25, 31, and 45 hours, suspectively. 3. These cultured tumor cell line were inoculated subcutaneously into nude mice and transitional epithelial carcinomas differing in degree of differentiation were observed. 4. Horizontal and tangential sections of these cultured tumor cell lines were examined by transmission electron microscopy. The development of intracellular organella and the presence of microvilli on the surface of the cells were noted. Intracellular adhesion was poor but the morphological characteristics of bladder transitional epithelium with compressed vesicles and other intracellular structures such as desmosome and free ribosomes were observed. 5. By applying the attached collagen gel method to our cell lines, it was possible to obtain cultured rat epithelial cells with the same morphology as in vivo, in addition to the tumor cell lines. 6. These cultured cell lines of normal rat transitional epithelium appear to be useful a experimental models with which one could clarify the function of the transitional epithelium and the mechanisms of bladder carcinogenesis.     

一氧化氮合成酶在膀胱癌中的表达及意义

目的　了解三种类型一氧化氮合成酶 (NOS)在膀胱癌中的表达情况 ,探讨其与肿瘤发生发展的关系。　方法　对 2 5例开放手术切除的膀胱癌组织标本进行三种NOS免疫组织化学染色 ,自动图像分析仪对染色程度分级 ;6例肾移植供体正常膀胱组织标本作为对照。　结果　诱导型NOS(iNOS)在肿瘤上皮细胞呈阳性表达 ,在正常膀胱移行细胞不表达或仅微弱表达 (P <0 .0 5)。内皮细胞型NOS (eNOS)在肿瘤基质毛细血管内皮细胞中的表达阳性率 1 0 0 % ,高于对照组中的 67%。两组标本中神经型NOS(nNOS)表达部位及强度相似。统计学分析显示iNOS和eNOS表达与肿瘤分级、分期无明显相关性 ,P均 >0 .0 5。　结论　iNOS及eNOS在膀胱癌的高表达可能与肿瘤的发生发展有关。     

Primary culture of human bladder carcinomas and establishment of human bladder carcinoma cell line by serum-free culture

It was possible to cultivate cells from bladder carcinoma tissues in 4 cases out of 6 without the overgrowth of fibroblast. A new human transitional cell carcinoma cell line (HAMT-1) was established in longterm tissue culture by using serum-free medium (BEM-841) which had been developed by us. The tissue for culture was taken from a 61-year-old Japanese male with grade 3 transitional cell carcinoma of the bladder. The microscopic features of the cell in cultures and of the tumors developed in nude mice resembled closely that of the original tumor. Electron microscopy of the cultured cells and the tumors developed in nude mice revealed characteristics of the epithelial origin of these cells with microvilli, junctional complex and scarce filament formation. Blood TPA level of the nude mouse with the transplanted tumor was equally high as that of the patient from whom the original tumor had been taken. The cells were anchorage independent in the serum-free medium but anchorage dependent in the medium containing 5% FCS. Anchorage dependency could not be restored by the addition of collagen and fibronectin. The doubling time of the cells were 18-20 hours. The chromosome counts of the cell line ranged from 59-78 with a modal count of 74.     

膀胱平滑肌细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性研究

目的:研究膀胱平滑肌细胞与膀胱脱细胞基质(BAM)的生物相容性。方法:分离培养兔膀胱平滑肌细胞,采用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体进行鉴定。将以1×10 5个/mL的单细胞悬液均匀接种于制备BAM支架上,通过与单独培养的膀胱平滑肌细胞作对照,绘制两组细胞生长曲线图,对比观察两条生长曲线的差异性。 ...     

兔主动脉内皮细胞制备方法的优化

目的为构建骨组织工程血管化提供优质种子细胞。方法采用血管内膜外翻和胶原酶消化法分离培养兔主动脉内皮细胞并传代;采用倒置显微镜、透射电镜观察和免疫荧光法鉴定。结果培养的血管内皮细胞在第3~5天为对数生长期,倒置显微镜下可见内皮细胞呈紧密排列、短梭多角形的"鹅卵石"形态;透射电镜可见内皮细胞特征性Weible-Palade小体;经免疫荧光法鉴定证明该细胞CD31抗原阳性。结论采用血管内膜外翻等方法制备的兔血管内皮细胞的成活率高,且纯度高、数量多、具有良好的生物学活性。该法可为骨组织工程血管化的研究提供种子细胞。     

以L929细胞为滋养层的尿道黏膜上皮细胞体外培养

目的 探索尿道黏膜上皮细胞体外培养的技术和方法，为进一步采用组织工程技术构建尿道黏膜组织奠定基础，并为尿道黏膜的生理、药理、毒理学及微生态研究提供实验模型。方法 取刚离乳的雄性新西兰幼兔尿道黏膜组织，分别以DispaseⅠ消化液和混合消化液消化成单细胞悬液，以差速贴壁法排除成纤维细胞，接种后以L929细胞为滋养层细胞进行培养，定期换液，细胞生长、增殖至80％～90％融合时传代。细胞进行常规HE染色、流式细胞仪检测，以扫描电镜、透射电镜观察其超微结构。再分别设立实验组(n=20)、阳性对照组(正常尿道黏膜组织石蜡切片，n=20)及阴性对照组(成纤维细胞铺片，n=20)行免疫组织化学染色。结果 原代培养10天左右细胞逐渐生长融合成片，如铺路石状，细胞大小均一。上皮细胞为二倍体细胞，生长期内均为单一的上皮细胞，无成纤维细胞混杂生长，细胞可传11～13代，成活50～60天。结论 新西兰幼兔尿道黏膜上皮细胞可在体外进行培养，在一定时间内保持增殖活力，为构建组织工程化尿道奠定了基础，且为尿道黏膜的体外研究提供了实验模型。