血小板糖蛋白GPⅠbαvWF结合域在酵母中的表达鉴定

目的：实现重组糖蛋白GPⅠbα vWF结合域在巴氏毕赤酵母中的表达。方法：PCR从重组质粒pcDNA3．1-GPⅠbα中扩增GPⅠbα vWF结合域基因,以pPIC9k为表达载体,构建包含该目的基因的酵母重组质粒,转染毕赤酵母GS115,以G418筛选抗性克隆,甲醇诱导表达,SDS-PAGE与点印迹鉴定表达产物。结果：获得编码正确的重组质粒pPIC9k-GF302,电转化GS115,以G418筛选到阳性克隆,诱导表达培养上清进行点印迹,结果表明表达蛋白能够与抗GPⅠbα单克隆抗体结合。结论：获得了表达重组蛋白质GPⅠbα vWF结合域的巴氏毕赤酵母菌株以及重组蛋白质GP302。     

一种新的血管生成抑制因子-TSF的设计及表达

目的 选择PF4和TSP1的高活性片段设计融合基因－TSF，在大肠肝菌表达，细胞水平上检测表达产物的生物学活性。方法 PF4的C－末端13肽和TSP1的429－459片断31肽通过Gly-Pro-Gly肽桥设计为融合蛋白－TSF。采用pGEX-2T载体在E.coli JM109中表达TSF蛋白。采用MTT方法测定TSF及其相关性GST－TSF，PF4（58－70），TSP1（429－459）等对血管内皮细胞，平滑肌细胞，QGY7721人肝癌细胞，HLF人肺成纤维细胞等生长的抑制效应。结果 合成的TSF融合基因，克隆到pGEX-2T载体，转化E .coli JM109，获得了TSF蛋白的高效表达。建立了TSF蛋白的纯化复性方法，获得了GST－TSF融合蛋白及TSF蛋白。TSF，GST－TSF，PF4（58－70）和TSP1（429－59）均特异抑制血管内皮细胞的生长，其中TSF的活性最强，活性大小次序为TSF＞GST－TSF＞PF4（58－70）＞TSP1（429－459）。结论 融合表达蛋白－TSF在细胞水平上能高效特异抑制血管内皮细胞的生长。     

血管内皮生长因子C正、反义真核表达载体的构建及鉴定

目的克隆血管内皮生长因子C（VEGF-C）基因,构建VEGF-C正、反义真核表达载体,鉴定并分析其基因序列。方法从处于对数生长期的人SGC-7901细胞中提取组织总RNA,用RT-PCR方法扩增出VEGF-C基因的正、反义全长cDNA。利用大肠杆菌转化并制备质粒pCI-neo和pcDNA3。分别用XbaI＋EcoRⅠ及HindⅢ＋EcoRⅠ双酶切两组质粒和VEGF-C cDNA,并将正、反义VEGF-C cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3和pCI-neo中。酶切鉴定、质粒双向测序鉴定重组基因。结果扩增出VEGF-C基因全长cDNA,大小约1.3kb。克隆出正、反义重组质粒为pcDNA3-sense VEGF-C,pCI-neo-antisense VEGF-C,电泳结果显示条带大小约6.8kb。碱基测序证实重组质粒中导入的DNA片段碱基序列与预期的设计路线相符且两片段互补、方向相反。结论正确克隆VEGF-C基因,成功构建了VEGF-C正、反义真核表达载体,为下一步研究反义VEGF-C转染VEGF-C基因高表达的肿瘤细胞后对其体外生长的影响创造了条件,也为进一步研究VEGF-C在胃癌新生淋巴管的形成和转移中的作用奠定了基础。     

人Slitrk1基因对PC12细胞增殖和分化的影响

目的研究人Slitrk1基因过表达对PC12细胞增殖和分化的影响。方法PCR扩增人Slitrk1 CDS,克隆到pcDNA4／myc-His A载体,构建重组质粒pcDNA4／St1,分别以空载体和重组质粒转染PC12细胞,RT-PCR法鉴定出阳性转染细胞,观察空载体转染的PC12细胞（pcDNA4／PC12）和过表达Slitrk1的PC12细胞（ST1／PC12）的表型并用MTT法检测细胞增殖情况。结果与空载体转染的PC12细胞相比,过表达Slitrk1基因的细胞增殖速度明显减慢。pcDNA4／PC12与野生型PC12细胞表型一致,均为悬浮成团生长,细胞少有突起,而ST1／PC12细胞大部分贴壁生长,突起多见,呈分化状态。结论过表达人Slitrk1基因能够抑制PC12细胞增殖,促进细胞的贴壁及突起长出。人Slitrk1基因可能有促进PC12细胞神经分化的作用。     

arresten cDNA在人胃癌细胞SGC-7901中的表达及活性鉴定

目的：构建arresten cDNA的分泌型真核表达载体，将其转染人胃癌SGC-7901细胞，探讨arresten体外抑制血管内皮细胞生长的活性。方法：利用PCR法将小鼠Igκ链信号序列的60个碱基拼接至arresten cDNA的氨基端，并克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )，然后以脂质体法将重组pcDNA3．1( )-arresten转染SGC-7901细胞，Western印迹检测arresten的分泌表达，最后，提取SGC-7901细胞培养上清，采用内皮细胞增殖抑制试验鉴定上清中arresten活性。结果：成功构建了arresten cDNA的分泌型真核表达载体，获得可表达arresten的SGC-7901细胞系，真核表达的arresten具有抑制血管内皮细胞增殖的活性。结论：arresten是一种有效的血管生成抑制剂，其cDNA的真核表达载体的成功构建为针对人类胃癌的arresten抗血管基因治疗研究奠定基础。     

稳定表达人MAGE-1基因的小鼠细胞系的建立与鉴定

目的：克隆人黑素瘤抗原-1（MAGE-1）基因，构建真核表达载体，建立稳定表达人MAGE-1的小鼠细胞株。方法：提取人肝癌细胞的总RNA，RT-PCR法获得人MAGE-1cDNA，将测序正确的MAGE-1基因克隆至真核表达载体pcDNA3中，进行酶切鉴定和序列测定。将重组质粒pcDNA／MAGE和空载体pcDNA3分别转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中，经G418筛选获得稳定表达株，用RT-PCR和Western印迹检测MAGE-1基因的转录及蛋白表达。结果：从肝癌细胞中成功克隆到人MAGE-1基因，经测序证明基因正确，酶切和序列测定表明，人MAGE-1基因的真核表达质粒已成功构建。将此重组质粒转入的SP2／0细胞可稳定表达人MAGE-1基因。结论：成功构建可稳定表达人MAGE-1基因的小鼠转基因细胞，为MAGE-1的免疫治疗研究奠定了基础。     

分泌表达rhOPG-HSA融合蛋白的毕赤酵母菌株的构建

目的：将骨保护素（osteoprotegerin,OPG）与人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）基因融合,以构建高效分泌表达的巴斯德毕赤酵母菌株。方法：通过RT-PCR扩增OPG基因,构建pHILD2-HSA-OPG质粒,并对HSA-OPG分泌表达产物进行了ELISA检测。结果：pHILD2-HSA-OPG表达质粒经鉴定与测序证明正确,并在毕赤酵母GS115中能够实现较高表达。结论：成功构建了高效分泌表达重组骨保护素融合蛋白（rhOPG-HSA）的毕赤酵母菌株,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

酵母系统表达的重组人亲肝素性促轴突生长因子及其活性的测定

目的：研究酵母系统表达人亲肝素性促轴突生长因子（heparin-binding neurite-promoting factor,HNBF)的活性,并观察其对体外培养细胞的促轴突生长作用。方法：从18周流产的人胎脑组织提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）获得HNBF的编码基因,扩增后与表达载体pPIC9K重组,鉴定筛选得到含HBNF cDNA基因的阳性克隆。用此重组表达载体通过电穿孔法转化毕赤酵母菌株GS115,在不含组氨酸的选择性含糖基础培养基（MD）平板上筛选His 表型,利用G418抗药性筛选多拷贝酵母菌重组子,PCR鉴定含有HNBF cDNA基因与酵母染色体基因组整合的菌株。阳性克隆经甲醇诱导后获得重组人HBNF（hrHNBF)在培养液中的分泌表达。将层析纯化的表达产物加入体外培养的大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞株,观察其促轴突生长作用。结果：目的基因序列与基因库资料完全一致,目的基因在该载体中位于α因子分泌信号序列的下游,与α因子开放阅读框相连。SDS－PGAE蛋白电泳证实诱导表达的产物相对分子质量约为18000,它对培养的PC12细胞株具有促轴突生长作用。结论：通过毕赤酵母菌可以稳定地表达hrHNBF,而且表达产物hrHNBF具有促进神经轴突生长的生物学活性。     

抑癌基因p27真核细胞表达质粒的构建

目的：构建抑癌基因P27真核细胞表达质粒，为研究P27在创面修复及瘢痕形成中的分子机制提供物质基础。方法：PCR法从含有P27全长的质粒中合成P27CDNA片段，连接酶连接至PUC19质粒测序，证明PCR产物序列完全正确，限制性酶切PUC19-P27，获得P27cDNA片段，连接酶连接至pcDNA3，克隆出真核表达质粒pcDNA3-P27。结果：PCR合成p27cDNA片段序列正确，凝胶电泳证明己将p27cDNA片段正确克隆到pcDNA3-P27中。结论：成功构建了抑癌基因p27的真核表达载体pcDNA-p27。     

人类维甲酸受体α的克隆表达

目的：构建人类维甲酸受体α基因的高效表达系统。方法：提取人肝组织总RNA，RT-PCR扩增Retinoid X receptor α（RXRα）的cDNA。将其克隆入原核表达载体pETDuet-1，构建重组表达载体pETDuet-1／RXRα。将已构建好的表达载体pETDuet-1／RXRα重组质粒转化大肠杆菌BL21，异丙基硫代-8-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，Western Blot鉴定表达产物。结果：重组载体pETDuet-1／RXRα经限制性核酸内切酶BglⅡ和AatⅡ双酶切鉴定，得到符合预期大小的核酸片段。SDS-PAGE可见与预期大小相符的蛋白条带，Western Blot证实该条带即为RXRα。并对重组质粒pETDuet-1／RXRα在BL21菌株的表达效率进行评价，目的蛋白占菌体总蛋白的百分比为65．8％。结论：成功建立了pETDuet-1／RXRα的高效表达系统。     

Angiostatin基因转染对膀胱癌BIU-87细胞系生物学行为的影响

目的 探讨外源性血管抑素(angiostatin)基因在人膀胱癌BIU-87细胞中的表达及其意义。方法 将人全长angiostatin基因经脂质体包裹转染膀胱癌BIU-87细胞,行G418筛选获得转基因瘤细胞克隆,比较转基因和未转基因的瘤细胞生长特性。采用免疫荧光、免疫组化及Western blot等方法检测瘤细胞angiostatin蛋白的表达,并应用鸡胚尿囊膜血管生成实验及脐静脉内皮细胞增殖实验检测其活性。结果 外源性angiostatin基因的表达对BIU-87瘤细胞的生长并无影响。转染细胞在体外明显抑制脐静脉内皮细胞的增殖并对鸡胚尿囊膜的血管生成具有明显的抑制作用。结论Angiostatin能特异性地抑制血管内皮细胞增殖,进而抑制血管生成。     

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞生长特性的影响

目的 研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45生长特性的影响。方法 将从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,按正向、反向克隆人真核表达载体pcDNA3．1（＋）。测序正确的重组子pcDNA3．1-a（含GCRG213正向克隆）、pcDNA3．1-b（含GCRG213反向克隆）和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,采用半定量RT-PCR及Western blot方法比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞的增殖状态,Annexin VFITC／PI双标记法检测凋亡细胞。结果经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。与对应的空载体比较,转染pcDNA3.1-a的MKN45细胞中mRNA的表达上调35．4%,蛋白的表达上调49．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中mRNA的表达下调32．1％,蛋白的表达下调50．3％。转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞生长增殖速度加快,凋亡率下降,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞生长增殖速度减慢,凋亡率增加。结论 胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞的生长,抑制肿瘤细胞凋亡,可能是恶性肿瘤癌变的促进因素之一。     

ABCG_2食管癌耐药细胞系Eca109/ABCG_2的建立

目的 探讨腺苷三磷酸结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG_2)在介导食管癌多药耐药中的作用.方法 扩增ABCG_2基因,与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNNA3.1-ABCG_2重组质粒,转染Eca109细胞后用G418筛选稳定转染细胞.采用流式细胞术检测细胞内阿霉素的含量,评价细胞对药物的外排作用.MTT法检测阿霉素对Eca109/ABCG_2、Eca109/pcDNA3.1、Eca109细胞生长的抑制作用,并计算半数抑制浓度(IC_(50))和细胞的耐药指数.采用Western blotting和RT-PCR法检测细胞中ABCG_2蛋白及mRNA的表达量.结果 成功建立转染ABCG_2基因的Eca109/ABCG_2细胞.Eca109/ABCG_2细胞中ABCG_2的mRNA和蛋白表达量升高.阿霉素对Eca109/ABCG_2、Eca109/pcDNA3.1、Eca109细胞的IC_(50)值分别为18.61±3.94、4.18±0.14、4.69±0.88μg/ml.Eca109/ABCG_2细胞对阿霉素的耐药指数为3.97,且外排阿霉素的作用增强.结论 Eca109/ABCG_2细胞具有ABCG_2的耐药表型,能够稳定表达ABCG_2蛋白,可作为研究ABCG_2介导的多药耐药相关机制的细胞模型.     

人黑色素浓集激素1型受体真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人黑色素浓集激素1型受体(MCHR1)真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR1的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因.结论 真核表达载体的构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR1功能奠定了良好的实验基础.     

Imaging targeted at tumor with 188Re-labeled VEGF189 exon 6-encoded peptide and effects of the transfecting truncated KDR gene in tumor-bearing nude mice

IntroductionPlanar imaging of ¹⁸⁸Re-labeled vascular endothelial growth factor (VEGF)₁₈₉ exon 6-encoded peptide (QKRKRKKSRYKS) with single photon emission computed tomography (SPECT) in tumor-bearing nude mice and effects of the transfecting truncated KDR gene on its imaging were investigated, so as to provide a basis for further applying the peptide to tumor-targeted radionuclide treatment.MethodsQKRKRKKSRYKS, coupling with mercaptoacetyltriglycine (MAG₃) chelator was labeled with ¹⁸⁸Re; then in vivo distribution, planar imaging with SPECT and blocking experiment in tumor-bearing nude mice were analyzed. Recombinant adenovirus vectors carrying the truncated KDR gene were constructed to transfect tumor tissues to evaluate the effects of truncated KDR on the in vivo distribution and tumor planar imaging of ¹⁸⁸Re-MAG₃–QKRKRKKSRYKS in tumor-bearing nude mice.ResultsThe labeled peptide exhibited a sound receptor binding activity. Planar imaging with SPECT demonstrated significant radioactivity accumulation in tumor 1 h after injection of the labeled peptide and disappearance of radioactivity 3 h later. Significant radioactivity accumulation was also observed in the liver, intestines and kidneys but was not obvious in other tissues. An hour after injection of the labeled peptide, the percentage of the injected radioactive dose per gram (%ID/g) of tumor and tumor/contralateral muscle tissues ratio were 1.98±0.38 and 2.53±0.33, respectively, and increased to 3.08±0.84 and 3.61±0.59 in the group transfected with the truncated KDR gene, respectively, and radioactivity accumulation in tumor with planar imaging also increased significantly in the transfection group.Conclusion¹⁸⁸Re-MAG₃–QKRKRKKSRYKS can accumulate in tumor tissues, which could be increased by the transfection of truncated KDR gene. This study provides a basis for further applying the peptide to tumor targeted radionuclide imaging and treatment.     

Treatment of transplanted tumor of lung adenocarcinoma A549 transfected by human somatostatin receptor subtype 2 (hsstr2) gene with 188Re-RC-160

Background and aimRadionuclide-labeled somatostatin analogues selectively target somatostatin receptor (SSTR)-expressing tumors as a basis for diagnosis and treatment of these tumors. To those tumors without somatostatin receptor expressed, the hSSTR2 gene was transfected. Express of the hSSTR2 receptor was imaging and the radiotherapeutic effect was evaluated with ¹⁸⁸Re-RC-160.MethodsThe stable hSSTR2-expressing A549 cells (pcDNA3-hSSTR2 A549) and non-somatostatin receptor expressing A549 cells (pcDNA3 A549) were selected by western blot. Later, a corresponding animal tumor model was established. Expression of the hSSTR2 reporter was imaged using ¹⁸⁸Re-RC-160 recognition. Tumors were evaluated for somatostatin receptor expression using immunohistochemistry. The distribution of ¹⁸⁸Re-RC-160 in the animal tumor model was measured and the inhibitory effects of ¹⁸⁸Re-RC-160 were evaluated by measurement of tumor growth and hematoxylin and eosin and TdT mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) staining.ResultsIn vivo radioimaging revealed specific targeting of ¹⁸⁸Re-RC-160 to tumors derived from pcDNA3- hSSTR2 A549 cells, compared to those from pcDNA3 A549 cells. pcDNA3- hSSTR2 A549 tumor growth inhibition was significantly higher in the single 7.4 MBq ¹⁸⁸Re-RC-160 treatment group than in the 2×7.4 MBq rhenium-188, RC-160 group, control group, and pcDNA3 A549 tumors (P<.05). Furthermore, treatment fractionation group (2×7.4 MBq ¹⁸⁸Re-RC-160), induced significantly increased tumor-growth inhibition compare with single 7.4 MBq ¹⁸⁸Re-RC-160 treatment (P<.05).ConclusionThese studies showed that ¹⁸⁸Re-RC-160 could be effectively used for targeting therapy the A549-derived tumors exogenously expressing hSSTR2, which will offers a potential therapeutic strategy for the treatment of somatostatin receptor-negative cancers.     

p16基因转染对胰腺癌细胞生长及辐射敏感性的研究

目的 探索p16基因转染对胰腺癌细胞生长辐射敏感性的作用。方法 将外源野生型p16基因连接到pCDNA3.1^＋载体构建pCDNA3.16＋ -p16重组质粒,利用Lipofectamine^TM介导转染胰腺癌JF305细胞,筛选阳性克隆。照射后,RT-PCR检测p16基因表达,Western blot检测蛋白表达;用MTT法测定细胞生长曲线和肿瘤细胞杀伤率。结果 转染p16基因的JF305细胞有外源p16基因的整合及表达,生长速度明显减少,对辐射的敏感性增强。结论 导入外源野生型p16基因可抑制胰腺癌细胞恶性增殖,提高胰腺癌细胞对辐射的敏感性。     

应用RNAi技术沉默survivin基因对肺腺癌A549细胞的影响

目的 探讨RNA干扰(RNAi)沉默survivin基因对肺腺癌A549细胞的影响.方法 应用RNAi技术,以化学合成的survivin小干扰RNA(siRNA)体外转染A549细胞,采用MTT法及流式细胞仪检测转染前后A549细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化,通过RT-PCR及Western blot分析survivin mRNA和蛋白的表达情况.结果 survivin siRNA对A549的生长抑制作用呈浓度依赖性(P＜0.05),并能引起G1期细胞比率的增加和S期细胞相应的减少,诱导一定数量的细胞凋亡,转染后36、60、84、108、132h的IC50值分别为152.4、151.2、136.0、144.0、150.4nmol/L.100～200nmol/L siRNA转染组细胞的survivin表达在蛋白及RNA水平都显著低于对照组(P＜0.01),但空白对照组与空质粒组间无明显差异(P＞0.05).结论 应用siRNA沉默survivin基因可以下调肺腺癌A549细胞survivin的表达,进而抑制细胞生长、增殖并诱导细胞凋亡.RNAi的抑制效果具有特异、高效和持久的特点.