低剂量他克莫司治疗大鼠急性脊髓损伤的实验研究

目的：探讨低剂量他克莫司（tacrolimus，又名FK506）对大鼠急性脊髓损伤是否具有神经保护作用。方法：雄性Wistar大鼠72只，随机分为假手术组（12只）、损伤组（30只）和FK506治疗组（30只）。采用Allen’s打击法致伤大鼠T10脊髓，假手术组仅做椎板切除术。FK506治疗组在脊髓损伤后5min一次性经尾静脉注射FK5060．3mg／kg，其余两组以相同方法给予等量生理盐水。致伤后30min、6h、24h、48h、72h取伤段脊髓组织行病理观察及原位末端标记法（TUNEL）检测神经细胞凋亡，伤后1、3、7、14、21d行脊髓功能BBB评分和斜板实验。结果：伤后3、7、14、21d，FK506治疗组斜板实验和BBB评分明显优于损伤组，两组间比较差异有显著性（P〈0．05）；伤后各时间点FK506治疗组脊髓损伤区出血坏死较损伤组轻；伤后6、24、48、72h神经细胞凋亡FK506治疗组较损伤组明显减少，两组间比较差异有显著性（P〈0．05）。结论：在大鼠急性脊髓损伤后早期应用低剂量他克莫司（0．3mg/kg）治疗对神经具有保护作用，可减少神经细胞凋亡，减轻脊髓继发性损伤，促进脊髓功能恢复。     

热休克蛋白70在大鼠急性打击损伤脊髓中的表达

目的观察急性打击损伤大鼠脊髓组织中热休克蛋白70（heat shock protein70，HSP 70）的表达。方法65只大鼠随机分为3组：正常对照组5只、手术对照组和脊髓损伤组各30只，采用改良Allen法建立脊髓损伤动物模型。手术对照组和脊髓损伤组分别于处置后的2h、6h、12h、24h、48h、72h这6个时间点各采集5只大鼠的脊髓。应用免疫组织化学染色方法观察不同时点各组脊髓中热休克蛋白的表达变化。结果在大鼠正常胸段脊髓中没有基础性HSP70的表达。打击造成急性脊髓损伤后2h，脊髓组织内出现HSP70的表达，损伤后24～48h脊髓组织中HSP70染色达到高峰，并维持至损伤后72h。结论在遭遇损伤性刺激后，脊髓组织在随后的2～72h内HSP70的表达明显增加；HSP70可能在阻止脊髓的继发性损伤方面发挥一定的作用。     

他克莫司对移植肝脏再灌注损伤的影响

目的 探讨他克莫司对移植肝脏再灌注损伤的影响.方法 建立大鼠肝移植模型,实验组(40只)和对照组(40只)分别注射他克莫司和生理盐水,检测再灌注24、48和96 h后TNF-α、IL-1、ALT、AST、LDH、内皮素(endothelin,ET)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,观察肝脏超微结构和细胞凋亡情况,RT-PCR法检测Fas、Bcl-2的mRNA水平.依据免疫抑制方案,将112例终末期肝硬化患者分为他克莫司组(63例)和环孢素A组(49例),比较临床肝移植使用环孢素A和他克莫司患者肝酶指标及急性排斥反应的发生.结果 实验组TNF-α、IL-1、ALT、AST、LDH、ET和MDA显著低于对照组(P＜0.05),肝脏超微结构受损和细胞凋亡较轻,Fas mRNA合成减少.患者使用他克莫司后急性排斥反应发生率较环孢素A低(x2=39.0,P＜0.05).结论 他克莫司可通过抑制细胞凋亡来减轻大鼠移植肝脏再灌注损伤,临床使用他克莫司能减少急性排斥反应的发生.     

他克莫司对周围神经损伤后脊髓组织中肝细胞生长因子表达的影响

[目的]探讨他克莫司对大鼠周围神经损伤后脊髓组织中肝细胞生长因子 (HGF) 表达的影响.[方法]成年雄性大鼠 50 只,随机分为正常组、损伤组和治疗组,后两组行双侧坐骨神经切断.术后治疗组颈后皮下注射他克莫司 (1 mg/kg),损伤组注射生理盐水.术后不同时间点取 L4～6脊髓,应用 Western blotting 技术及免疫荧光标记对脊髓组织中HGF 的表达变化进行定量和定位检测.[结果]HGF 在脊髓灰质前角、中间带和后角的各类神经元中均有表达;损伤组与正常组大鼠脊髓组织中 HGF 的表达之间无显著性差异 (P>0.05),治疗组大鼠脊髓组织中 HGF 的表达在术后 7、14 d 时明显高于损伤组 (P< 0.05).[结论] (1) 周围神经损伤本身并不能使脊髓组织中 HGF 的表达上调;(2) 他克莫司能诱导周围神经损伤后内源性 HGF 的高表达,从而保护相应神经元,促进轴突生长.     

他克莫司对猪胸腺细胞表面抗原表达的影响

目的 探讨他克莫司（ＦＫ５０６）对猪胸腺细胞表面抗原表达的影响。方法 对５头猪按１ｍｇ／ｋｇ肌肉注射ＦＫ５０６２１ｄ，然后取猪胸腺制成细胞悬液，双色法间接免疫荧光染色后，以流式细胞仪检测。方法 ＦＫ５０６组的胸腺Ｔ淋巴细胞数较对照组显著降低（Ｐ〈０．００１），表面抗原阴性的前Ｔ淋巴细胞较对照组显著增高（Ｐ〈０．０１）；ＦＫ５０６组ＣＤ１＾－ＣＤ５＾－、ＣＤ２＾－ＣＤ５＾－和ＣＤ４＾－ＣＤ８＾－双阴     

缺血预处理对犬脊髓损伤及热休克蛋白70表达影响的研究

目的评价缺血预处理对犬脊髓损伤及热休克蛋白70表达的影响。方法41条杂种犬随机分成假手术组6只、预处理组21只、对照组14只。预处理组主动脉阻断6min后开放6min,反复2次,之后阻断35min;对照组主动脉阻断35min。术后进行神经功能评分,检测脊髓组织中热休克蛋白70表达。结果在再灌注后6h、24h预处理组热休克蛋白70于胞质和胞核均有表达,且强于对照组;而且神经功能评分预处理组高于对照组。在再灌注后7d预处理组神经功能评分无明显改变,且仍见热休克蛋白70表达。结论缺血预处理可以增加脊髓的缺血耐受;热休克蛋白70在胞质和胞核中表达可能在缺血耐受中起到一定的作用。     

他克莫司对犬急性脊髓损伤神经保护作用的实验研究

目的探讨他克莫司（FK506）对犬急性脊髓损伤的神经保护作用。方法采用Allen＇s法制成犬急性脊髓损伤实验模型。动物随机分为：A组（n=8）,经动脉插管注入生理盐水;B组（n=8）,FK5060.18mg／kg;C组（n=8）．FK5060.3mg／kg。B组、C组均在致伤后2h经动脉插管单次给药。致伤后行脊髓MRI影像学检查、脊髓功能评分、脊髓组织病理观察、神经丝蛋白（NF200）及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的免疫组织化学分析。结果脊髓功能评分C组优于A组（P〈0.05）;B组优于A组,但无统计学差异;MRI显示：脊髓损伤后C组病变范围小,恢复快,B组次之．A组最差。C组NF和GFAP表达高于A组（P〈0.05）,B组与A组无统计学差异。结论局部应用FK506（0.3mg／kg）对急性脊髓损伤具有神经保护作用,可减轻继发损伤,加快脊髓功能的恢复;局部应用FK506对急性脊髓损伤治疗有一定的剂量-效应依赖关系。     

他克莫司对肾移植后糖代谢的影响及其控制

目的：制定他克莫司（PK506）治疗窗浓度,并控制肾移植后糖尿病（PTDM）的发生和发展。方法：对肾移植术后用PK506为基础的免疫抑制剂治疗的20例受者,进行回顾性研究,结果：20例患者随访1年,4例发展为糖尿病,发生率为20％,患者发病前4－8周都经受较高FK506浓度（20－28μg/L）作用,经降低泼尼松（Pred)用量、结合胰岛素替代治疗效果不佳,后经调整FK506浓度为：第1个月5－15μg/L,第2个月起5－10μg/L。2例血糖完全恢复正常,另2例因急性并发症转换为环孢素A（CsA)治疗。治疗期间无1例出现急性排斥和血肌酐升高。结论FK506具有强效免疫抑制作用,可防止急性排斥发生,在使用FK506期间,一旦发生PTDM,可通过减少Pred用量降低FK506浓度,同时使用胰岛素控制其发生、发展。如出现急性并发症,可将FK506转换为CsA。     

他克莫司对阿霉素肾病大鼠足细胞损伤的修复作用

目的探讨他克莫司对阿霉素肾病大鼠足细胞损伤的修复作用。方法通过阿霉素尾静脉注射建立大鼠微小病变肾病模型,并以他克莫司进行干预。大鼠随机分为对照组、模型组和他克莫司组。每组分别于第0、7、14、21、28、35天采集尿液,检测尿蛋白排泄量,于造模第35天处死大鼠收集肾脏标本。电镜观察各组大鼠足细胞足突融合情况;TUNEL检测法对肾小球进行染色;免疫组化或免疫荧光对WT-1、caspase-3进行定位和半定量检测,观察大鼠足细胞的数量和凋亡。结果阿霉素尾静脉注射后大鼠尿蛋白显著增加,足细胞数目明显减少,足突广泛融合;与模型组比较,他克莫司组大鼠24 h尿蛋白明显减少,足突融合改善,足细胞数目增多。与对照组比较,模型组大鼠肾小球内caspase-3蛋白表达增加,TUNEL染色加深;与模型组比较,他克莫司组肾小球内caspase-3表达量下降,TUNEL阳性率减少,说明足细胞凋亡减少。结论他克莫司可修复阿霉素肾病大鼠足细胞损伤,其机制与抑制足细胞凋亡有关。     

热休克蛋白70对大鼠离体心脏细胞凋亡的影响

目的 观察热休克蛋白70(HSP70)对离体大鼠供心心肌细胞凋亡相关蛋白bcl-2、bax表达的影响.方法 Wistar大鼠18只,分为2组:对照组(C,n=9),腹腔注射生理盐水0.5 ml,24 h后取离体心脏灌注HTK心脏保护液,4 ℃保存3 h后建立Langendorff离体心脏灌注模型,灌注KH液2 h;实验组(E,n=9)腹腔注射重酒石酸去甲肾上腺素(溶于生理盐水中)3.1 μmol/kg(0.53 mg/kg),腹腔注射24 h后取离体心脏,处理方法旧C组.运用免疫组织化学SP法测定心肌HSP70含量、bcl-2、bax蛋白的含量并做统计学处理比较.结果 HSPT0含量E组(17.78±1.82)较C组(5.22±1.05)明显增高(P＜0.01),bel-2的表达E组(41.88±5.09)较C组(31.36±3.27)明显增多(P＜0.01),bax的表达E组(22.61±3.49)较C组(40.52±4.17)明显减少(P＜0.01),bel-2/bax比值E组(1.86±0.11)较C组(0.77±0.01)明显增高(P＜0.05).结论 心肌HSP70高表达能促进心肌抗凋亡蛋白bcl-2的表达,减少促凋亡蛋白bax表达,增加bel-2/bax比率,抑制心肌细胞凋亡.     

热激活蛋白70识别蛋白在脊髓缺血再灌注损伤后表达变化及其意义

目的:探讨热激活蛋白70识别蛋白(heat shock cognate protein 70,HSC70)在兔脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia-reperfusion injury,SCIRI)后表达变化及其意义。方法:随机将36只新西兰白兔分成6组(每组6只),采用Zivin法建立兔SCIRI模型。A组只显露腹主动脉而不阻断血流,30min后关闭腹腔,取材(L3~L5段脊髓);B组阻断腹主动脉血流30min后关闭腹腔,取材;缺血再灌注组(C、D、E、F组)阻断腹主动脉血流30min后停止夹闭,再灌注6、12、24、48h时采用改良Tarlov评分分别进行运动功能评价后取材。应用差异蛋白质组学技术荧光差异双向凝胶电泳联合质谱分析筛选出应激相关蛋白HSC70,利用免疫印迹对质谱进行印证,结合免疫组化研究其在脊髓内的时空变化特点。结果:成功建立SCIRI兔模型,SCIRI后实验动物后肢功能逐渐好转,C~F组改良Tarlov评分分别为1.167±0.753、1.667±0.516、2.668±0.516和2.167±0.752分,再灌注24h达SCIRI早期最好水平,再灌注48h略有下降。应激相关蛋白HSC70在A组印迹清晰,B组印迹轻微加强,C组和D组印迹再次加强,E组印迹显著减弱至最低,F组印迹灰度回归至再灌注6~12h水平。A组灰质中部体积较小中间神经元胞浆见轻度免疫反应;B组灰质各部位神经元胞浆免疫反应程度与A组相当;C组胶质细胞核免疫反应加重;D组神经元免疫反应减轻,但胶质细胞及雪旺细胞核免疫反应较强烈;E组神经元免疫反应进一步减弱,低于A组水平;F组神经元胞浆免疫反应加重,胶质细胞及雪旺细胞核免疫反应仍强烈。结论:HSC70参与SCIRI发生和发展过程,可作为SCIRI预防、诊断和治疗的靶点。     

二甲胺四环素对大鼠脊髓损伤后Caspase-3表达及细胞凋亡的影响

[目的]探讨大鼠脊髓损伤后应用二甲胺四环素（minocyc line）对Caspase-3表达及细胞凋亡的影响。[方法]成年大鼠脊髓损伤后应用二甲胺四环素的治疗组（A组）和应用生理盐水对照组（B组），于损伤后不同时点取材，用HE染色观察损伤脊髓组织病理变化，用免疫组化染色检测Caspase-3表达阳性细胞，原位末端标记法（TUNEL法）标记凋亡细胞。[结果]HE染色镜检发现脊髓组织病理学改变A组明显轻于B组。A、B两组均发现凋亡细胞及Caspase-3表达，神经细胞凋亡指数及Caspase-3表达均B组〉A组（P〈0．01）。[结论]二甲胺四环素能抑制大鼠脊髓损伤后Caspase-3表达及细胞凋亡。     

甲基强的松龙预处理对缺血再灌注损伤脊髓中热休克蛋白27表达的影响

目的:观察不同时间预防性应用甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)后脊髓缺血再灌注损伤局部热休克蛋白27(HSP27)表达的变化,探讨MP预防脊髓缺血再灌注损伤的最佳用药时间.方法:75只SD大鼠随机分为A、B、C、D、E组.每组15只.A组仅暴露腹主动脉,而不做其他处理;B、C、D、E组均通过夹闭腹主动脉30min造成脊髓缺血再灌注损伤,C、D、E组分别于损伤前30min、1h、3h尾静脉注射30mg/kg MP,B组于损伤前30min尾静脉注射与MP组等容量的生理盐水.A组于术后3h、其他组于损伤后3h取脊髓标本固定、切片,行HE染色观察脊髓神经元胞体、胞核、核仁的形态,神经元的极性和尼氏体的染色情况;行免疫组化染色检测HSP27表达,用染色阳性物质平均吸光度值A代表相对含量.结果:HE染色显示,A组为正常的神经元表现;B组神经元胞体萎缩,胞核、核仁、尼氏体均显示不清,极性消失;C组胞体萎缩较B组明显减轻,可观察到胞核和核仁,极性存在,尼氏体显示欠均匀;D组胞体萎缩较重,个别神经元内无法分辨胞核、核仁,极性不明显,尼氏体染色不均匀:E组与B组比较无明显差别.A、B、C、D、E组的HSP27染色阳性物质平均吸光度值A分别为63.76±3.02、100.32±4.13、132.05±5.03、121.92±4.68、102.16±5.96,C组、D组HSP27表达均较B组增强(P<0.05),且C组与D组比较有显著性差异(P<0.05),E组和B组比较无显著性差异(P>0.05).结论:缺血再灌注损伤前30min使用MP可最大程度上调HSP27的表达,减轻脊髓缺血再灌注损伤.     

苦参素对大鼠急性脊髓损伤后热休克蛋白47表达的影响

目的探讨苦参素治疗大鼠急性脊髓损伤(SCI)的机制。方法用30只Wistar大鼠制作钳夹型SCI模型,随机分成正常组、假手术组、SCI组、对照组和治疗组,在SCI后3d及每周评价BBB评分,并在第8周用免疫组化方法分析脊髓中热休克蛋白47(HSP47)的表达情况。结果正常组和假手术组Wistar大鼠脊髓组织低表达胶质细胞酸性蛋白(GFAP)和HSP47,高表达神经丝蛋白(NF),在SCI后GFAP和HSP47表达明显提高(P<0.05),NF表达明显降低(P<0.05)。苦参素治疗后,GFAP和HSP47表达降低(P<0.05),NF表达升高(P<0.05)。结论苦参素对Wistar大鼠SCI具有治疗作用,很可能通过抑制HSP47的表达发挥治疗作用。     

FTY720对大鼠急性脊髓损伤后RhoA表达的影响

目的观察大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后芬戈莫德(fingolimod,FTY720)对RhoA表达的影响,进一步探讨FTY720治疗SCI的可能机制。方法采用改良Allen’s法建立大鼠急性SCI模型。雌性SD大鼠75只,随机分为假手术组(n=15)、损伤组(n=30)和FTY720组(n=30)。FTY720组伤后30min一次性腹腔注射FTY7200.5mg/kg,假手术组和损伤组以相同方法给予浓度为0.9%的生理盐水。分别于伤后1天、3天、7天、14天及21天,应用RT-PCR和Western印迹法分别检测RhoA mRNA和RhoA蛋白的表达。结果损伤组RhoA mRNA和蛋白的表达于伤后3天开始明显增加,7天达到高峰,21天仍维持高水平表达;在同一时间点,与FTY720组和假手术组比较,差异有统计学意义(P0.05)。FTY720组伤后1天、3天和7天的RhoA表达高于假手术组(P0.05)。假手术组各时间点RhoA表达维持在较恒定水平。结论大鼠急性SCI后RhoA表达增加,FTY720可能通过抑制SCI后RhoA的表达,以达到减轻继发性SCI、促进脊髓神经功能恢复的目的。     

脊髓损伤后热休克蛋白27、表皮脂肪酸结合蛋白和金属蛋白酶组织抑制因子-1的基因表达及甲基强的松龙对其表达的影响

目的研究脊髓损伤后热休克蛋白27(HSP27)、表皮脂肪酸结合蛋白(FABPs)和金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的基因表达及甲基强的松龙(MP)对其表达的影响.方法SD大鼠30只.随机分为假手术组、单纯脊髓损伤组(损伤组)及脊髓损伤+大剂量MP治疗组(MP组),每组10只.应用改良的Allen's打击法致T8脊髓损伤.MP组大鼠伤后即刻从尾静脉内注射大剂量MP(30mg/kg).损伤后24h切取损伤平面上下0.5cm的脊髓组织,进行RT-PCR反应,检测HSP27、FABPs和TIMP-1的基因表达.结果术后24h假手术组HSP27、FABPs和TIMP-1的基因表达相对丰度分别为0.0643±0.0152、0.6413±0.1005和0.7091±0.0577;损伤组上述三个因子的表达升高,分别为1.0013±0.3861、1.2187±0.2851和0.8971±0.1092,与假手术组比较差异有显著性(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05);MP组上述三个因子的表达继续升高,分别为1.2858±0.1384、1.7122±0.1766和1.2081±0.1093,与损伤组比较差异有显著性(P＜0.05、P＜0.01和P＜0.01).结论脊髓损伤后,邻近损伤处的脊髓组织中HSP27、FABPs及TIMP-1的基因表达显著增高,大剂量MP能进一步促进三个因子表达,发挥组织保护作用.     

热休克蛋白70对急性胰腺炎时TNF、IL-8的影响

目的 探讨热休克蛋白70(Hsp70)对急性胰腺炎时TNF、IL-8的影响。方法 温生理盐水(42℃)持续灌洗大鼠腹腔30min,10 h后诱导大鼠急性胰腺炎(AP),术后2、6 h检测血清淀粉酶、TNF、IL-8水平,观察病理改变。结果 与正常AP组相比,42℃生理盐水腹腔持续灌洗预处理能明显降低AP术后2 h时的淀粉酶水平、病理评分和6 h的淀粉酶、病理评分、TNF和IL-8水平(P<0.05)。结论 42℃生理盐水腹腔持续灌洗能诱导大鼠胰腺表达Hsp70,诱导表达的Hsp70能减轻AP时的胰腺局部损伤和全身炎症反应。