比较不同来源人成骨细胞的体外培养模式及其生物学特性

目的:建立不同来源人成骨细胞的体外培养模式,比较颅骨、骨膜、骨髓来源的成骨细胞的生物学特性。方法:实验于2002-9/2004-3在东南大学修复重建外科研究所完成。①从人4个月龄胚胎骨膜、颅骨及骨髓组织中分离培养出骨膜来源的成骨细胞,颅骨来源的成骨细胞和骨髓基质干细胞并对骨髓基质干细胞进行成骨诱导培养。②体外动态观察细胞的生长情况和形态学变化,用第2～4代细胞进行细胞鉴定和生物学特性的比较。③通过相差显微镜,Giemsa染色及透射电镜观察比较细胞的形态和超微结构,通过生长曲线,比较细胞的增殖能力。经碱性磷酸酶染色和钙结节染色比较细胞的成骨活性,并经X射线能量散射分析鉴定钙结节的元素成分。结果:培养的颅骨、骨膜来源的成骨细胞和在诱导培养下的骨髓基质干细胞具有成骨细胞的形态、生长及功能特点。骨膜、颅骨来源的成骨细胞以功能态为主,骨髓基质干细胞以增殖态为主。①体外增殖结果:3种细胞的增殖能力依次为:骨髓基质干细胞、颅骨来源成骨细胞、骨膜来源的成骨细胞。②形态学观察:第3代后3种细胞在形态上无明显的差别,在超微结构上骨膜来源的成骨细胞和颅骨来源的成骨细胞为高分化细胞,骨髓基质干细胞为低分化细胞。③成骨功能表达:骨膜来源成骨细胞第15天,颅骨来源成骨细胞第17天光镜下可见褐色的钙化结节形成,骨髓基质干细胞在诱导液条件下培养24d时可见褐色结节;矿化结节X射线能量散射分析,其Ga/P元素含量比值,骨膜来源成骨细胞为2.16±0.17,颅骨来源成骨细胞为2.39±0.21,骨髓基质干细胞为2.57±0.15;骨膜来源成骨细胞的碱性磷酸酶染色阳性率为95.2%,颅骨来源成骨细胞为89.6%,骨髓基质干细胞(诱导后)为69.0%。骨髓基质干细胞(未诱导)碱性磷酸酶染色阴性。3种不同来源的人成骨细胞成骨能力依次为:骨膜来源的成骨细胞、颅骨来源成骨细胞、骨髓基质干细胞。结论:采用改良的酶消化法,培养骨、骨膜来源的成骨细胞,通过加以改进的密度梯度离心法,培养骨髓基质干细胞,可得到均一性好,活性强的3种不同来源的人成骨细胞。     

成人骨髓源成骨细胞体外培养条件下的生物学特性

背景：骨髓基质干细胞作为种子细胞构建组织工程化骨组织，具有广泛的应用前景，可作为首选的骨组织工程种子细胞来源。尽管目前对于动物骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化的研究已不断深入，但对于成人骨髓基质干细胞大量诱导分化为成骨细胞的研究尚处于探索阶段。目的：研究成人骨髓基质干细胞在体外培养条件下的生物学特性及成骨能力，探讨简便易行的成人成骨细胞体外培养方法，为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。设计：采用完全随机实验对照单盲设计进行横断面研究。地点和对象：实验在解放军第一军医大学南方医院全军创伤骨科中心完成，对象为健康成年志愿者骨髓组织。干预：抽取骨髓组织，在100mL／L胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃，50mL／L CO2湿化空气孵箱中培养，传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养，用倒置相差显微镜、光镜(HE染色)、扫描与透射电镜观察细胞的形态特征和增殖分化情况，并测定培养细胞的生长曲线(MTT法)、碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力。主要观察指标：形态学观察和生物学特性检测。结果：原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力，诱导培养2周后，细胞呈多角形或梭形，具有多个突起可互相联结，透射电镜下观察细胞核较为幼稚，细胞器丰富。诱导分化后的细胞可分泌碱性磷酸酶，改良钙钴法染色阳性率可达74．2％，并可形成钙结节，具有与典型的成骨细胞相似的形态特征及生物学功能。结论：成人骨髓基质干细胞取材安全方便，易于诱导分化为成骨细胞；本实验方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。     

人胚胎骨骨膜来源成骨细胞的分离培养与生物学特性

背景:胚胎骨来源成骨细胞因其低免疫原性和高增殖与成骨活性有可能成为适用于骨组织工程方法异体骨组织缺损修复的种子细胞.冻存复苏后的牛物学特点是台能进行进一步临床应用研究有待证实.目的:建立人胚胎骨骨膜来源成骨细胞的分离培养、保存方法,观察骨膜来源成骨细胞生物学特点.设计、时间及地点:细胞形态学与生物学特性实验研究,于2005-04/2006-05在天津市口腔医院细胞与组织工程实验室完成.材料:细胞来源为5月龄自然流产胎儿,产妇及家属知情同意,无菌条件下取长骨骨膜组织.方法:采用组织块法对成骨细胞进行原代培养,传代培养细胞液氮冻存3～6个月后,选择不同代次细胞复苏培养.主要观察指标:通过形态学、超微结构,细胞增殖曲线,钙结节Von kossa法染色以及细胞内碱性磷酸酶定量检测与钙钴法染色确定其增殖与成骨活性.结果:组织块法培养骨膜来源成骨细胞第6天即可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性.苏木精-伊红染色密集融合的成骨细胞与细胞外基质显示转化为脊样骨组织结构排列.经统计学分析定量榆测成骨细胞碱性磷酸酶活性与细胞密度有线性正相关关系.液氮冷冻保存后复苏培养复层成骨细胞钙钴法碱性磷酸酶染色阳性率在45%以上,超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞.结论:胚胎骨骨膜来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性.深低温液氮冻存成骨细胞复苏后仍能连续传代增殖并具有良好的成骨代谢活性,能够体外借助细胞外基质形成骨样结构.     

体外培养骨髓基质细胞向成骨细胞的分化

背景:目前如何有效地诱导骨髓基质细胞向成骨细胞转化,建立稳定的体外培养诱导模式,研究诱导条件的作用机制是骨组织工程研究的重点.目的:建立一种兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的体外培养体系,观察其成骨过程.设计:对比观察.材料:4～8周龄新西兰大白兔,雌雄不拘,用于骨髓基质细胞的原代与传代培养.方法:将兔股骨骨髓基质细胞进行原代培养,待细胞铺满瓶底近80%后,加入2.5 g/L胰蛋白酶消化传代培养.取生长良好的对数期第2代细胞,以1×108 L-1的细胞浓度接种于预置盖玻片的6孔培养板内.细胞分为2组,实验组使用条件诱导培养基(RPMI1640标准培养基加入地塞米松10-8 mol/L,β甘汕磷酸钠10 mmol/L,维生素C 50 μg/L),对照组继续使用标准培养基.两组细胞持续培养(常规两三天换液1次)进行细胞成骨分化观察.主要观察指标:倒置相差显微镜观察细胞生长及形态变化:苏木精-伊红染色、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色、钙结节染色及扫描电镜观察骨髓基质细胞形态变化.结果:经诱导培养的细胞,在体外逐渐转化,增殖、分泌细胞外基质、最终形成了矿化基质.苏木精-伊红染色显示实验组传代细胞在接近融合为单层时形态多为梭形,多角形等.胞浆内可见颗粒:碱性磷酸酶染色可见实验组传代细胞染色呈强阳性,阳性率达83.2%,并能大量分泌Ⅰ型胶原:对照组仅有个别细胞染色呈阳性.四环素染色观察实验组骨髓基质细胞形成金黄色钙结节,甚至是骨样组织,与典型成骨细胞的牛物学特性相似.扫描电镜观察实验组培养的传代细胞已接近融合为单层,细胞呈梭形或多角形表现,细胞表面及细胞间可见钙盐结晶沉积.结论:实验所建立的兔骨髓基质细胞体外诱导成骨转化体系,能够培养出生长活跃,增殖迅速,稳定、多量向成骨细胞转化的骨髓基质细胞培养模式,所培养的细胞可作为成骨细胞的一种来源,为构建组织工程化骨提供种子细胞.     

成人骨髓源成骨细胞体外培养条件下的生物学特性

背景骨髓基质干细胞作为种子细胞构建组织工程化骨组织,具有广泛的应用前景,可作为首选的骨组织工程种子细胞来源.尽管目前对于动物骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化的研究已不断深入,但对于成人骨髓基质干细胞大量诱导分化为成骨细胞的研究尚处于探索阶段.目的研究成人骨髓基质干细胞在体外培养条件下的生物学特性及成骨能力,探讨简便易行的成人成骨细胞体外培养方法,为骨组织工程选择理想的种子细胞来源.设计采用完全随机实验对照单盲设计进行横断面研究.地点和对象实验在解放军第一军医大学南方医院全军创伤骨科中心完成,对象为健康成年志愿者骨髓组织.干预抽取骨髓组织,在100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基中,置于37℃,50 mL/L CO2湿化空气孵箱中培养,传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养,用倒置相差显微镜、光镜(HE染色)、扫描与透射电镜观察细胞的形态特征和增殖分化情况,并测定培养细胞的生长曲线(MTT法)、碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力.主要观察指标形态学观察和生物学特性检测.结果原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养2周后,细胞呈多角形或梭形,具有多个突起可互相联结,透射电镜下观察细胞核较为幼稚,细胞器丰富.诱导分化后的细胞可分泌碱性磷酸酶,改良钙钴法染色阳性率可达74.2%,并可形成钙结节,具有与典型的成骨细胞相似的形态特征及生物学功能.结论成人骨髓基质干细胞取材安全方便,易于诱导分化为成骨细胞;本实验方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法.     

中国实验用小型猪成骨细胞的培养与鉴定

目的：分离、诱导培养中国实验用小型猪成骨细胞作为骨组织工程种子细胞，并进行形态学与生物学性能鉴定，为骨组织工程研究提供新型种子细胞。方法：实验于2002—08／2004—08在天津市口腔医院暨天津市整形外科医院中心实验室组织工程实验室完成。采用胶原酶消化法和诱导条件培养法自新生中国实验用小型猪四肢骨松质分离成骨细胞，经细胞生活形态观察、细胞倍增时间测定、透射电镜超微结构分析、裂解上清碱性磷酸酶检测、矿化结节形成测定等方法进行成骨细胞的生物学性能鉴定，以获取中国实验用小型猪成骨细胞作为骨组织工程种子细胞的必备的增殖活性与成骨活性数据。结果：①原代培养中国实验用小型猪成骨样细胞具有很强的贴壁率，细胞分裂旺盛，2～3d即可达到完全融合。细胞形态呈多角形和星形、胞体大、胞核圆，核仁丰富，通常为两三个核仁；胞浆中核周见散在黑色颗粒。②条件培养液诱导后的猪成骨样细胞培养6d左右可见细胞呈旋涡状复层生长，胞突伸展互相连接并集结成细胞簇团，中心区形成褐色结节；细胞核周围胞浆中出现大量黑色颗粒。③细胞增殖曲线显示猪成骨样细胞在播种3d后进入对数生长期，15d左右达到生长峰值；经细胞倍增时间公式计算猪成骨样细胞倍增时间为67．2h。④透射电镜观察显示：中国实验用小型猪成骨样细胞表面突起极丰富；核大，有较多和较深的内陷；核仁大而多窗孔，胞质内细胞器常常分布于核的一侧，扩张的粗面内质网池内有中等电子密度的蛋白质沉淀，其膜表面的核糖体密集分布。Golgi氏复合体发达，并见胞质内微丝及多量的游离核糖体。核仁特征为高转录活动的核仁。细胞外形、核谱型、核位置以及咆质内细胞器的特征性分布符合成骨细胞的超微结构特征。⑤猪成骨样细胞的碱性磷酸酶活性在β-磷酸甘油和地塞米松刺激后3d开始上升，18d达到高峰，21d时开始下降。⑥Von Kossa染色显示从培养6d开始，小型猪成骨样细胞培养细胞层出现散在的小矿化结节，以后数量渐多，体积渐大，21d达高峰，体外成骨活性显著。结论：中国实验用小型猪骨松质成骨细胞具备骨组织工程种子细胞必备的增殖活性与成骨活性，适合作为骨组织工程的种子细胞。     

体外培养口腔黏膜角化细胞生物学的特性

目的 一个稳定的人类正常口腔黏膜角化细胞体外培养体系对于研究组织工程化口腔黏膜构建及口腔黏膜上皮癌变及阻断有重要意义。研究体外培养的人正常口腔黏膜角化细胞的细胞生物学特性。方法 通过测定细胞生长曲线及克隆形成率了解细胞生长基本规律及其增殖能力，并通过流式细胞仪检测细胞染色休体倍性。结果 细胞接种后第1-3天为静止生长期，第5-10天处于对数生长期，第12天后进入平台期。倍增时间为24-48h；接种密度为200/cm^2时，培养细胞克隆形成率为0.979%。经流式细胞仪检测细胞染色体倍性结果表明原代及传代细胞均为二倍体细胞。结论 体外连续培养的口腔黏膜角化细胞为正常上皮细胞，增殖能力良好。     

人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特性

目的:研究软骨组织工程中传代软骨细胞与原代的差异。方法:用5个月人胎关节软骨分离培养细胞,观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学的改变。结果:(1)软骨块在4℃下,3d 内细胞存活率可达 93.4％～97.6％。(2)原代细胞为圆形或三角形;第4代有一半转变成梭形,到第6代全部变为长梭形。(3)传代细胞贴壁时间(2～3h)短于原代(4～7h)。玻璃瓶内贴壁率传代细胞为78.7％～85.5％,原代8.8％。(4)生长曲线表明,从原代到第4代都有高增殖力;到第8代时增殖降低;到第12代几乎丧失细胞增殖。结论:软骨块4℃冷藏,3d内对细胞存活率无明显影响。第4代细胞贴壁快、增殖快,适于作为组织工程用细胞。第8代以后不适合。     

不同来源内皮祖细胞培养及其生物学特性比较

背景:在缺血性疾病中,机体的代偿性反应包括细小动脉形成和血管新生,而内皮祖细胞在其中发挥着重要的作用,参与了机体多种生理、病理性血管重建过程.目前对内皮祖细胞的来源、生物学特性还存在许多争议.目的:分离培养人外周血、脐带血、骨髓以及脐带来源的内皮祖细胞,并对其生物学特性进行比较.方法:采用密度梯度离心法分离人外周血、脐带血以及骨髓单个核细胞进行贴壁培养,脐带来源的内皮祖细胞通过植块贴壁培养或胶原酶消化脐静脉内膜获得的单个核细胞进行贴壁培养.对获得的贴壁细胞进行细胞形态学、增殖活力、细胞周期、免疫表型的检测.结果与结论:①外周血与脐带血来源的贴壁细胞呈长梭形,集落状生长,其上附有成簇圆形细胞,随着培养时间延长,圆形细胞渐脱落,梭形细胞无明显增殖趋势,消化后细胞不能传代;流式显示细胞高表达CD45,部分表达KDR,但不表达CD31.②骨髓和脐带来源的贴壁细胞呈短梭形、多角形;传代后细胞增殖迅速,且细胞形态与增殖活力没有明显下降;多数细胞处于G0/G1期;流式检测显示细胞均不表达CD14、CD45,也不表达CD106、HLA-DR,但高表达CD44、CD90、CD62E、CD73、CD95、CD105;部分表达内皮系标记KDR、vWF;酶消化法获得的脐带内皮祖细胞还表达CD31;共聚焦显微镜扫描显示细胞具有吸收ac-LDL并结合UEA-1的能力.结果说明外周血、脐带血、骨髓与脐带组织中可分离培养出分化程度、增殖活力不同的内皮祖细胞.     

不同来源成骨细胞构建组织工程骨膜的特异性基因表达

背景:不同来源的种子细胞在体外黏附、增殖、分化的能力不同,保持生物学性状的能力不同,因而构建的组织工程产品生物活性也有所差异.目的:尝试在分子水平了解骨膜来源之成骨细胞和盖骨来源之成骨细胞在构建组织工程骨膜中的分化能力.设计、时间及地点:对比观察,于2007-07/2008-07在陕西省人民医院中心实验室完成.材料:取健康、剖腹产的人羊膜(已取得产妇及家属的同意).按照文献方法制备脱细胞生物衍生羊膜.方法:分别选用人胚骨膜成骨细胞和颅骨成骨细胞为种子细胞,接种于脱细胞生物衍生羊膜上.经过4,6.8 d的体外培养,提取总RNA,经过反转录成cDNA,采用实时定量聚合酶链反应对目的基因成骨细胞特异转录因子,成骨细胞特异基因(oslerix)以及骨钙素读取扩增循环数(cycle threshold.Ct).主要观察指标:①成骨细胞特异转录因子的表达.②成骨细胞特异基因Osterix的表达.③成骨细胞骨钙素Osteocalcin 的表达.结果:在组织工程骨膜中.骨膜成骨细胞对转录因子的表达普遍低于颅骨成骨细胞(P< 0.05).随培养时间的延长,骨膜成骨细胞和颅骨成骨细胞对Osterix的表达均出现缓慢增加,但二者之间没有明显差异.各时间段检测结果均显示颅骨成骨细胞对骨钙素的表达高于骨膜成骨细胞,其中在4,6 d差异有显著性意义(P<0.05).结论:骨膜成骨细胞与颅骨成骨细胞在与生物衍生材料接触后,仍可保持终末的分化性状.就分化能力而言,颅骨成骨细胞优于骨膜成骨细胞.生物衍生羊膜有助于骨膜成骨细胞保持分化方向.由此可见,不同来源的成骨细胞分化能力有所不同.     

不同来源的人脂肪干细胞体外成脂诱导分化能力的比较

目的：对同一个体不同部位来源的脂肪干细胞体外成脂诱导分化的能力进行比较，为脂肪干细胞的进一步应用提供实验依据。 方法：实验于2004-11／2005-05在中国协和医科大学整形外科医院研究中心完成。提取5例女性临床吸脂患者（平均年龄32岁）8个部位（大腿前侧、臀上部；臀上部、上腹部；髂腰部；上腹部；背部、上臂）脂肪抽吸组织中的间充质干细胞，体外进行成脂诱导分化。在对照培养基（含体积分数0．1胎牛血清的DMEM培养基）中培养的第l代脂肪干细胞，以3&;#215;10^-4细胞／皿接种到35mm培养皿中，将对照培养基更换为成脂诱导培养基，进行成脂诱导，每周换液2次，以加入对照培养基的培养皿设为阴性对照。继续培养2周，分别取诱导后的细胞和阴性对照细胞各两皿进行油红O染色，以证实细胞中有无脂滴形成。通过油红O染色及阳性细胞记数，分别对来源于3例患者的2个不同部位的脂肪抽吸标本中的脂肪干细胞向成脂细胞分化的能力进行定性和半定量检测，采用卡方检验对不同细胞的成脂诱导分化率进行测定。 结果：①脂肪干细胞成脂诱导分化能力的测定结果：从不同个体的每100mL脂肪抽吸组织中提取的平均脂肪干细胞数目有所不同，从2.45&;#215;10^8-／100mL-1.25&;#215;10^9个／100mL不等；但从同一个体不同部位的脂肪中所获得的干细胞数目却比较近似；根据各例细胞成脂诱导分化率，可得出5例患者8个部位细胞的平均成脂诱导分化率为36．2％。经统计学分析证实同一个体不同部位来源的细胞具有不同的成脂分化能力，获得的平均干细胞数目与年龄无关（r=0．098，P=0．817），而细胞的成脂分化能力与年龄呈明显负相关（r=-0．568，P〈0．01。②成脂诱导后脂肪干细胞形态变化及油红O染色定性结果。脂肪干细胞经诱导后体积增大，分化为成脂细胞，细胞浆中可见许多大小不等的橙红色脂滴，多者可占整个细胞体积的80％-90％，细胞核缩小或偏于细胞的一侧，呈阳性；而在普通培养基中生长的对照细胞未见体积增大和脂滴形成，呈阴性。 结论：患者年龄越大，成脂分化率越低，且同一患者不同部位来源的脂肪抽吸组织中的脂肪干细胞在成脂诱导分化能力上存在差异。提示利用脂肪干细胞进行相关实验时，在患者年龄和取材部位上应有所选择，进一步分析有可能找到获取脂肪干细胞的最佳部位。     

不同来源的人脂肪干细胞体外成脂诱导分化能力的比较

目的:对同一个体不同部位来源的脂肪干细胞体外成脂诱导分化的能力进行比较,为脂肪干细胞的进一步应用提供实验依据。方法:实验于2004-11/2005-05在中国协和医科大学整形外科医院研究中心完成。提取5例女性临床吸脂患者(平均年龄32岁)8个部位(大腿前侧、臀上部;臀上部、上腹部;髂腰部;上腹部;背部、上臂)脂肪抽吸组织中的间充质干细胞,体外进行成脂诱导分化。在对照培养基(含体积分数0.1胎牛血清的DMEM培养基)中培养的第1代脂肪干细胞,以3×104细胞/皿接种到35mm培养皿中,将对照培养基更换为成脂诱导培养基,进行成脂诱导,每周换液2次,以加入对照培养基的培养皿设为阴性对照。继续培养2周,分别取诱导后的细胞和阴性对照细胞各两皿进行油红O染色,以证实细胞中有无脂滴形成。通过油红O染色及阳性细胞记数,分别对来源于3例患者的2个不同部位的脂肪抽吸标本中的脂肪干细胞向成脂细胞分化的能力进行定性和半定量检测,采用卡方检验对不同细胞的成脂诱导分化率进行测定。结果:①脂肪干细胞成脂诱导分化能力的测定结果:从不同个体的每100mL脂肪抽吸组织中提取的平均脂肪干细胞数目有所不同,从2.45×108个/100mL～1.25×109个/100mL不等;但从同一个体不同部位的脂肪中所获得的干细胞数目却比较近似;根据各例细胞成脂诱导分化率,可得出5例患者8个部位细胞的平均成脂诱导分化率为36.2%。经统计学分析证实同一个体不同部位来源的细胞具有不同的成脂分化能力,获得的平均干细胞数目与年龄无关(r=0.098,P=0.817),而细胞的成脂分化能力与年龄呈明显负相关(r=-0.568,P<0.01)。②成脂诱导后脂肪干细胞形态变化及油红O染色定性结果。脂肪干细胞经诱导后体积增大,分化为成脂细胞,细胞浆中可见许多大小不等的橙红色脂滴,多者可占整个细胞体积的80%～90%,细胞核缩小或偏于细胞的一侧,呈阳性;而在普通培养基中生长的对照细胞未见体积增大和脂滴形成,呈阴性。结论:患者年龄越大,成脂分化率越低,且同一患者不同部位来源的脂肪抽吸组织中的脂肪干细胞在成脂诱导分化能力上存在差异。提示利用脂肪干细胞进行相关实验时,在患者年龄和取材部位上应有所选择,进一步分析有可能找到获取脂肪干细胞的最佳部位。     

人脂肪干细胞的分离培养与生物学特性

背景:高效、稳定地获得大量较高纯度的人脂肪干细胞,是其在组织工程学及再生医学中广泛应用的基础和前提。目的:探索体外培养脂肪干细胞的适宜条件,从而提高其增殖能力。方法:采用胶原酶消化的方法,从人腹部皮下块状脂肪中分离出脂肪干细胞,经贴壁筛选法纯化细胞、低糖培养基体外培养扩增。Giesam染色后观察细胞形态;绘制细胞生长曲线并进行细胞周期分析,观察分析传代后染色体核型改变;选取第3代脂肪干细胞做流式细胞鉴定、EdU细胞增殖能力检测以及克隆形成实验。结果与结论:分离培养的原代脂肪干细胞形态不一,经传代后的细胞形态趋于长梭形,排列紧密呈漩涡状生长。细胞生长曲线呈S形,细胞周期分析及EdU掺入法结果显示体外培养的脂肪干细胞具有较强的增殖能力。经染色体核型分析结果提示,体外培养不会引起脂肪干细胞的核型改变。第3代脂肪干细胞经流式细胞仪检测CD29,CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34和CD45呈阴性;克隆形成率为8.8%;在一定的诱导条件下,脂肪干细胞能够向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果说明采用胶原酶消化法可成功分离培养人脂肪干细胞,且具有较强的增殖能力。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性

背景:脂肪来源间充质干细胞取材于吸脂手术所获得的脂肪抽吸物,可反复取材,原料来源充足。目的:建立一种体外分离培养人脂肪来源间充质干细胞的方法,并分析其生物学特性。方法:采用胶原酶消化法分离获取人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态;观察分析传代第3,7,10代细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测传代第5代细胞表面标志表达。取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导,采用碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定。冻存传代细胞,分别于2,6个月后复苏,锥虫蓝染色计数复苏后细胞存活率。结果与结论:原代细胞3d贴壁,6d后开始快速增长并形成集落,11d左右达80%~90%融合,多呈纤维样;传代后细胞维持纤维样形态。传代细胞潜伏期24~48h,对数增殖期三四天,对数增殖期后第五六天进入平台期。间充质干细胞表面CD34、CD14、HLA-DR呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达。具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,冻存复苏后细胞存活率达90%以上,且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性

背景：脂肪来源间充质干细胞取材于吸脂手术所获得的脂肪抽吸物,可反复取材,原料来源充足.目的：建立一种体外分离培养人脂肪来源间充质干细胞的方法,并分析其生物学特性.方法：采用胶原酶消化法分离获取人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态;观察分析传代第3,7,10 代细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测传代第5 代细胞表面标志表达.取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导,采用碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定.冻存传代细胞,分别于 2,6 个月后复苏,锥虫蓝染色计数复苏后细胞存活率.结果与结论：原代细胞3 d 贴壁,6 d 后开始快速增长并形成集落,11 d左右达80%~90%融合,多呈纤维样;传代后细胞维持纤维样形态.传代细胞潜伏期24~48 h,对数增殖期三四天,对数增殖期后第五六天进入平台期.间充质干细胞表面CD34、CD14、HLA-DR 呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达.具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,冻存复苏后细胞存活率达 90% 以上,且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性.     

不同产地壳聚糖纳米粒体外抗肿瘤作用的比较

目的:由于不同产地、来源的壳聚糖产品,其化学结构可能不同,因而生物学效应也会不同。将纳米技术引入壳聚糖研究,通过体外抗肿瘤细胞增殖抑制试验,比较不同来源壳聚糖纳米粒制剂的体外抗肿瘤活性。方法:实验于2006-10/2007-06在浙江省医学科学院生物工程研究所完成。①实验材料:肝癌SMMC-7721、胃癌BGC-823、宫颈癌Hela和乳腺癌MCF-7细胞株从中国科学院上海细胞所引入,由本研究所液氮保存。A壳聚糖由浙江金壳生物化学有限公司提供(批号:YK060329131);B壳聚糖由浙江奥兴生物科技有限公司提供(批号:200603200);C壳聚糖由青岛利中甲壳原公司提供(批号:020622)。②细胞培养:4种肿瘤细胞株均用含10%新生牛血清的DMEM培养基,在体积分数为0.05的CO2的37℃培养箱中培养,2.0～3.0d传代1次。③壳聚糖纳米粒制备:A,B,C壳聚糖应用离子交联法制备相应壳聚糖纳米粒,其纳米粒径分别为228,228和218nm。④MTT法测定壳聚糖纳米粒体外抗肿瘤活性:按3种壳聚糖纳米粒类别和4个质量浓度梯度设壳聚糖纳米粒组(62.5,125,250,500mg/L)、阳性对照组(氟尿嘧啶500mg/L)和阴性对照组(DMEM培养液),按常规方法进行MTT实验。结果:不同产地壳聚糖制备的A,B,C纳米粒分别作用于SMMC-772细胞,其500mg/L剂量组的生长抑制率分别为9.93%,7.91%和25.76%;作用于BGC-823细胞,其生长抑制率分别为8.96%,6.68%和29.94%;作用于Hela细胞,其生长抑制率分别为9.50%,9.23%和27.16%;作用于MCF-7细胞,其生长抑制率分别为7.56%,8.64%和52.86%。而抗肿瘤药物氟尿嘧啶500mg/L对SMMC-7721、BGC-823、Hela和MCF-7细胞生长抑制率分别为79.36%,78.83%、78.70%和82.20%。结果显示,A,B壳聚糖纳米粒对体外培养的SMMC-772、BGC-823、Hela、MCF-7细胞的抑制作用较弱,而C壳聚糖纳米粒对上述4种肿瘤细胞均具有较强的抑制作用,尤其对MCF-7细胞生长抑制作用最强。结论:体外实验条件下,壳聚糖纳米粒均显示一定的抗肿瘤活性。不同产地壳聚糖制备的纳米粒,其抗肿瘤活性存在明显的差异,并且壳聚糖纳米粒抗肿瘤活性具有一定的肿瘤细胞选择性。     

不同来源人羊膜间充质干细胞的混合培养

背景:人羊膜间充质干细胞可诱导分化为神经样细胞,但在培养过程中发现干细胞增殖的数量不足。目的:为了获得足够数量的人羊膜间充质干细胞,观察人羊膜间充质干细胞混合培养的生长情况及经碱性成纤维细胞生长因子诱导人羊膜间充质干细胞向神经样细胞的分化情况。方法:将两个不同胎盘来源的羊膜分离培养、混合,采用细胞分离和培养技术获取人羊膜间充质干细胞,分离人羊膜间充质干细胞后传代培养,加入碱性成纤维细胞生长因子诱导分化。当细胞传至第3代时,随机取培养的6份人羊膜间充质干细胞(半量)为A组,6份人羊膜间充质干细胞(半量)为B组,将A、B组各剩余的半量人羊膜间充质干细胞混合为C组。3组细胞浓度均为1.0×107L-1。以活细胞计数和MTT比色法比较3组细胞扩增数量,以免疫组织化学法检测羊膜间充质干细胞神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达。结果与结论:混合人羊膜间充质干细胞之间有互相促增殖的作用。人羊膜间充质干细胞具有较强的可朔性,经碱性成纤维细胞生长因子诱导的人羊膜间充质干细胞可表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白。     

不同来源人羊膜间充质干细胞的混合培养

背景：人羊膜间充质干细胞可诱导分化为神经样细胞,但在培养过程中发现干细胞增殖的数量不足。目的：为了获得足够数量的人羊膜间充质干细胞,观察人羊膜间充质干细胞混合培养的生长情况及经碱性成纤维细胞生长因子诱导人羊膜间充质干细胞向神经样细胞的分化情况。方法：将两个不同胎盘来源的羊膜分离培养、混合,采用细胞分离和培养技术获取人羊膜间充质干细胞,分离人羊膜间充质干细胞后传代培养,加入碱性成纤维细胞生长因子诱导分化。当细胞传至第3代时,随机取培养的6份人羊膜间充质干细胞（半量）为A组,6份人羊膜间充质干细胞（半量）为B组,将A、B组各剩余的半量人羊膜间充质干细胞混合为C组。3组细胞浓度均为1.0×107L-1。以活细胞计数和MTT比色法比较3组细胞扩增数量,以免疫组织化学法检测羊膜间充质干细胞神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达。结果与结论：混合人羊膜间充质干细胞之间有互相促增殖的作用。人羊膜间充质干细胞具有较强的可朔性,经碱性成纤维细胞生长因子诱导的人羊膜间充质干细胞可表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白。