应用双链DNA循环测序技术检测Dystrophin基因内点突变

应用双链ＤＮＡ循环测序技术检测Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因内点突变吴志英，王柠，邓余，余龙，慕容慎行关键词：ＰＣＲ，ＤＮＡ测序，点突变本研究采用ＰＣＲ扩增产物直接测序方法──双链ＤＮＡ循环测序技术［１］。检测基因内点突变，操作简单，费时短，只需１～２天即...     

毛细管电泳基因扫描和凝胶电泳异源双链分析在免疫球蛋白/T细胞受体基因重排检测中的应用研究

目的 探讨免疫球蛋白轻链IgK及T细胞抗原受体(TCRγ)基因重排更有效的检测方法。方法 收集四川大学华西医院病理科2013~2014年淋巴组织增生性病变石蜡样本共139例,采用BIOMED-2系统扩增,分别使用毛细管电泳基因扫描和凝胶电泳异源双链分析两种方法进行IgK和TCRγ基因重排检测,比较不同方法之间的检出率。结果 81例行IgK基因重排检测,其中59例病理诊断为B细胞淋巴瘤,毛细管电泳基因扫描检出阳性47例(79.66%),凝胶电泳异源双链分析检出阳性34例(57.63%),二者差异有统计学意义(P=0.01)。58例行TCRγ基因重排检测,其中26例病理诊断为T细胞淋巴瘤,毛细管电泳基因扫描检出阳性21例(80.77%),凝胶电泳异源双链检出阳性17例(65.38%),差异无统计学意义(P=0.211)。结论 毛细管电泳基因扫描在抗原受体基因重排检测中比凝胶电泳异源双链分析有更好的检测灵敏度。     

科学家完成脑膜炎球菌的基因测序

脑膜炎奈瑟菌可以安静地贮留在许多人的鼻腔内或咽喉内而对人体无害。但在另外一些人中,脑膜炎奈瑟菌则可能侵袭大脑和脊髓周围的组织并导致这些组织发炎,从而引起脑膜炎,对大约10％的病例来说,这种病是致死性的。     

基因测序技术在中药质量研究中的应用（Ⅱ）—山药基原的DNA测序鉴别

目的 分析正品山药Dioscorea polystachya Turcz.与地方习用品广山药D.persimilis Prain et Burkill、土山药D.japaonica Thunb.和方山药D.alataL.的核基因组18SrRNA基因序列，为山药基原鉴别及品质评价提供分子依据。方法 采用PCR直接测序技术测定山药及其地方习用品的18SrRNA基因序列。为山药基原鉴别及品质评价提供分子依据。方法 采用PCR直接测序技术测定山药及其地方习用品的18SrRNA基因序列，为山药基原鉴别及品质评价提供分子依据。方法 采用PCR直接测序技术测定山药及其地方习用品的18SrRNA基因核苷酸序列产荼序列同源性分析。结果 山药、广山药和土山药的18SrRNA序列长度均为1810bp，而方山药为1807bp。根据排序比较，广山药与正品山药的18SrRNA序列完全相同，而与土山药和方山药的序列同源性分别为99.89%和97.51%。结论 DNA测序技术可成为山药基原鉴定准确而有效的分子方法。     

荧光标记线粒体DNA SNPs检测体系建立及单倍型频率调查

 【目的】 利用荧光标记-单碱基延伸技术建立线粒体DNA SNPs高通量检测体系并应用于法医学检案【方法】 从线粒体DNA上选择18个SNPs(16个位于编码区和2个控制区)位点,自行设计PCR引物和单碱基延伸引物并结合毛细管电泳,实现对线粒体多个SNPs位点的高通量检测【结果】 建立了18个线粒体DNA SNPs复合检测体系,并调查这18个SNPs位点在广东地区汉族人群的单倍型频率【结论】 所建立的线粒体SNPs复合检测体系,在法医学应用中具有良好的应用前景     

DNA直接测序技术检测EGFR基因及突变分析

目的：探讨非小细胞肺癌（NSCI,C）患者表皮生长因子受体（EGFR）基因突变的情况及EGFR-TKI的治疗效果。方法：从94例晚期NSCLC患者的肿瘤组织中提取DNA,采用DNA直接测序技术检测EGFR基因18、19、20、21外显子的突变情况。对EGFR基因突变可评估患者采用TKI口服治疗（吉非替尼250mg／d、厄洛替尼150mg／d）,评价客观有效率（RR）、疾病控制率（DCR）及无疾病进展时间。结果：94例患者中39例（41．5％）存在EGFR基因突变,其中27例外显子19突变．2例外显子20突变,9例外显子21突变、1例外显子18突变。女性患者突变率显著高于男性（56．1％vs30．2％．P〈0．05）;腺癌患者突变率高于非腺癌患者（48％／）815．8％,P〈0．05）;不吸烟者突变率显著高于吸烟者（50．8％vs20．7％,P〈0．05）。16例患者口服TKI后部分缓解5例、疾病稳定7例、疾病进展PD4例,客观有效率为31．2％,疾病控制率为75．0％,截至随访结束,仍有14例患者生存,无疾病进展时间为（11．3l±4．44）个月,1年生存率为43．8％,、结论：DNA直接测序检测晚期NSCLC患者EGFR基因突变具有高度敏感性,以EGFR基因突变结果为依据,应用TKI治疗晚期NSCL C疗效明显。     

三种荧光标记的短双链RNA体外转染特性的比较

目的:比较三种不同荧光标记的短双链RNA(siRNA)体外转染特性. 方法:利用脂质体LipofectamieTM2000转染三种荧光标记siRNA入小鼠胚胎成纤维细胞系NIH 3T3,流式细胞仪观察转染效率,普通倒置荧光显微镜观察其淬灭情况,激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的分布情况. 结果:相同转染条件下三种荧光siRNA进入细胞的速度,细胞内的定位不同,转染效率不同,三种荧光标记的抗淬灭能力也不同. 结论:荧光标记siRNA可以起到良好的示踪作用. 用荧光标记siRNA作为无荧光siRNA的分布和转染效率参照时,要考虑到所选用荧光标记siRNA与无荧光标记siRNA的差异.     

绿色荧光蛋白在肿瘤研究中的应用

自20世纪60年代被发现以来,绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）因其化学性质稳定、无光漂白现象、用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质等引起科学家的广泛关注。目前．GFP基因作为报告基因广泛应用于细胞生物学、分子生物学以及临床医学等研究中。     

P53基因测序在恶性肿瘤诊断中的应用价值研究

①目的研究P53基因测序在临床肿瘤诊断中的应用价值。②方法采用聚合酶链式反应一直接测序方法对肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、甲状腺癌、宫颈癌及支气管和胃粘膜非典型增生的活检标本,急、慢性白血病的外周血标本,肺癌胸水、肝癌腹水标本等临床肿瘤样本进行P53基因外显子5、6、7、8序列分析。⑧结果正常对照组未发现突变、所测的几种常见肿瘤样本的活检标本的突变率一般为30％～50％,胸、腹水标本突变率与相应肿瘤的活检标本相近,突变大多位于外显子7、8。存在突变的病例2年病死率明显升高。④结论P53基因测序在常见恶性肿瘤诊断和判断预后等有一定的参考价值。     

同种异体犬单肺移植的实验研究

目的：通过同种异体犬单肺移植，掌握供肺的灌注、切取、保存和修剪方法以及爱体单肺移植的手术技巧。方法：杂种犬8只（供体4只，受体4只），供体犬经肺动脉顺行及逆行灌注改良Euro-Coilins（iEC）液后，整块切取心肺，进行保存和修剪。受体犬取后外侧切口第4肋间入胸，切除一侧全肺后，按支气管-肺动脉-左房袖的顺序吻合。结果：全组实验无手术死亡，移植后肺动脉通畅良好，受体犬存活26h～14d。结论：通过实验，掌握了同种异体肺移植供肺获取及植入全过程，为进一步开展同种异体肺移植研究打下了基础．并为临床开展人体肺移植积累了经验。     

螺旋CT仿真膀胱镜成像的影响因素研究

目的:研究螺旋CT仿真膀胱镜(CTVC)成像过程中应注意的技术性问题.方法:取5只离体猪膀胱,在其黏膜面制造直径5mm左右的结节,充盈气体后进行CT扫描,采用层厚1mm、3mm及5mm,螺距1.0、1.3及1.5,以重建重叠率分别为0及50%进行重建,并分别匹配分为11组.计算各组的检出率.利用SPSS13.0统计学软件,对层厚、螺距及重建重叠率进行三因素分析.结果:(1)第1组(层厚1.0mm,螺距1.0)检出的准确率最高,但与第2、3、4、5、6组之间的差异无统计学意义(P＞0.05);与第7、8、9、10组之间的差异有统计学意义(P＜0.05).(2)三因素析因分析结果显示,层厚因素对检出率有显著影响(P＜0.01),螺距因素对检出率有显著影响(P＜0.05),重建重叠率对检出率无显著影响(P＞0.05).结论:(1)层厚和螺距是影响CTVC成像的主要因素.(2)在CTVC成像过程中源图像的质量、不同的透视图算法、阈值和视角的选择、膀胱内存在的少量液体及一些内在和外在的假象均是影响图像质量的主要因素.     

代价依赖于加工位置的单机排序情形

对于客户代价依赖于加工位置而非整个工序的单机排序情形,每个客户在不同位置上的代价可以由一个代价矩阵来描述。给定一个排序情形,一个可行解包括最终采用的工序和相应的客户代价支付方案。本文研究最优工序下的客户代价支付方案,给出了有初始工序时的一个分配规则,以及无初始工序时通过指派博弈得到的支付方案。     

直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性检测中的比较

目的:了解PCR产物直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性(SNP)检测上的差别.方法:对2型糖尿病患者的载脂蛋白J外显子2基因及旁侧进行聚合酶链反应(PCR)扩增,分别对其产物进行直接测序和克隆测序.结果:在样本的检测中, PCR产物直接测序法所测序列与43～60 bp以后克隆测序相同;检出一个突变位点并与GenBank( DQ012938)发表序列一致.结论:PCR 产物直接测序法和克隆测序法都是检测SNP的有效方法,但前者不仅特异性强,敏感度高,而且比克隆测序方法更为快速简便,节省材料.     

毒素清颗粒解热作用的实验研究

目的 :探讨毒素清颗粒对 10 %鲜啤酒酵母混悬液及 10 %蛋白胨溶液致家兔体温升高的作用。方法 :分别用 0 .5ml(0 .0 5g) /kg/d、1ml(0 .1g) /kg/d、2ml(0 .2g) /kg/d毒素清溶液给家兔灌胃给药 ,观察其对发热家兔体温的影响。结果 :毒素清各剂量组 (低、中、高 )对 10 %鲜啤酒酵母混悬液及 10 %蛋白胨溶液致家兔体温升高均有明显的降温作用 ,与生理盐水对照组比较有显著性差异 (P <0 .5和P0 .0 1)。结论 :毒素清有明显的解热作用。     

髌骨骨折支持带的修复与髌骨轨迹变化之间关联性的实验研究

目的:探讨髌骨骨折并内外侧支持带损伤,在内固定髌骨骨折同时修复支持带的必要性。方法:通过人体尸体新鲜膝关节标本上制备髌骨骨折及支持带损伤模型,根据内固定术中是否还修复支持带,分为A组(骨折无并支持带损伤组)10例、B组(支持带不修复组)20例、C组(支持带修复组)20例;分别通过30°、60°、90°髌骨轴位片对比各组髌骨轨迹的变化,并测量髌股合适角判断有无髌骨不稳定。结果:髌骨骨折并支持带损伤不修复支持带组,出现不同程度的髌骨不稳定,髌股合适角>0°或<-12°;修复支持带后髌股合适角恢复正常。结论:对于髌骨骨折并内外侧支持带损伤,治疗骨折的同时应该修复支持带,有利于髌骨稳定性的恢复。     

脂质体携载SOD的实验研究

本文采用去垢剂透析法成功制备出携载ＳＯＤ的脂质体（Ｌ－ＳＯＤ），其直径为１０２ｎｍ，对ＳＯＤ的包裹率为２１％，９０％以上酶活性存在于脂质体内部。将Ｌ－ＳＯＤ注射到大鼠静脉血中，其半衰期超过４ｈ，明显长于天然ＳＯＤ（８ｍｉｎ）。表明Ｌ－ＳＯＤ优于天然ＳＯＤ，具有临床应用前景。     

经外路途径行异种视网膜片移植的实验研究

目的：探讨经外路途径行视网膜下腔的全层异种视网膜移植的方法，并对移植结果进行初步观察。方法：用明胶包埋小鼠视网膜制成视网膜移植片，九只兔按外路手术方法将植片植入视网膜下腔。移植术后1-23天摘除动物眼球，石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜观察。结果：明胶包埋的视网膜移植片可以被植入宿主视网膜下腔中，视网膜移植片平铺于宿主视网膜下腔中，植片外层与宿主视网膜色素上皮层相贴、存活，未见明显免疫排异反应。结论：视网膜下腔是较为理想的视网膜移植的受位；明胶包埋的异种视网膜植片可作为供体进行移植；移到视网膜下腔的异种视网膜能够存活，这一结果为今后异种视网膜移植研究奠定了基础。     

犬蒸气吸入性损伤的实验研究—CT表现与病理对照

目的：应用犬进行蒸气吸入性损伤的实验研究,探讨其肺部CT表现与病理对照。方法：分别对16条健康杂种犬蒸气吸入性损伤前,后进行肺部CT扫描,取其离体肺组织制成病理切片,将CT和病理结果进行分析,比较。结果：CT可敏感地显示吸入性损伤犬的早期肺部改变。结论：本实验为临床用无创伤性的检查手段来实现诊断早期吸入性损伤提供了可靠的实验依据。     

金黄色葡萄球菌DNA抗肿瘤免疫的实验研究

目的探讨金黄色葡萄球菌DNA（S．aureusDNA）抗肿瘤免疫的效果及其免疫机制。方法纯化提取S．aureus DNA，建立荷瘤裸鼠模型，将24只荷瘤裸鼠随机分为TES组、BCG组、DNA组，每组8只。于接种A549细胞株后第15天，TES组、BCG组、DNA组分别腹腔注射TES液、BCG液、DNA液各0．3mL，隔2d1次，共8次。采用双抗体夹心酶联免疫检测法检测3组荷瘤裸鼠血清IFN-γ、TNF-α水平，并进行NK、Mφ细胞杀伤活性、S．aureus DNA体内抑制率、不同肿瘤细胞抑制率的测定。结果DNA、BCG、TES 3组间NK、Mφ细胞杀伤活性比较差异均无统计学意义（P均〉0．05）。DNA、BCG 2组瘤重均明显低于TES组（P均〈0．05）。SPC—A-1、MGC803 100mg／L S．aureusDNA抑制率均明显高于A549（P均〈0．05），A549、MGC803 50mg／L S．aureusDNA抑制率均明显低于SPC—A-1（P均〈0．05）。TES、BCG2组血清IFN-γ、TNF—α水平均低于DNA组（P均〈0．01）。结论S．aureus DNA具有抗肿瘤免疫特性。