改良二氧化硅吸附法检测丙型肝炎病毒核酸

建立了改良二氧化硅吸附法检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ的方法。将待检血清５０μｌ、二氧化硅悬液２０μｌ、裂解液３００μｌ（含硫氰酸胍、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｓ．Ｃｌ）混匀置室温６０分钟，病毒颗粒裂解释放的核酸吸附在二氧化硅颗粒上，经离心和双蒸水洗脱，所得ＨＣＶ ＲＮＡ模板以５′ＮＣ区引物作套式聚合酶链反应扩增。使用该方法可检出１０μｌ血清中的ＨＣＶ ＲＮＡ。１１０份抗－ＨＣＶ     

改良二氧化硅吸附法检测丙型肝炎病毒核酸

建立了改良二氧化硅吸附法检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ的方法。将待检血清５０μｌ、二氧化硅悬液２０μｌ、裂解液３００μｌ（含硫氰酸胍、ＥＤＴＡ、ＴｒｉｔｏｎＸ—１００、Ｔｒｉｓ·Ｃｌ）混匀置室温６０分钟，病毒颗粒裂解释放的核酸吸附在二氧化硅颗粒上，经离心和双蒸水洗脱，所得ＨＣＶＲＮＡ模板以５＇ＮＣ区引物作套式聚合酶链反应扩增。使用该方法可检出１０μｌ血清中的ＨＣＶＲＮＡ。１１０份抗－ＨＣＶ阳性血清中ＨＣＶＲＮＡ的检出率为８２．７％。实验全过程约７小时，为丙型肝炎检测提供了快速、简便、灵敏的新方法。     

改良固相吸附法在 HCV RNA实时荧光定量检测中的应用

目的：通过对固相吸附法的改良,探讨采用固相吸附法提取血清中丙型肝炎病毒RN A在实时荧光定量检测中的应用。方法首先对HCV RNA的提取方法进行改良,对固相载体纳米二氧化硅颗粒表面进行硅醇基化以提高其核酸吸附能力;同时对病毒裂解液进行优化,获得异硫氰酸胍（GuSCN ）的最佳浓度用于 HCV RNA 的提取;最后使用改良方法提取的 HCV RNA进行实时荧光定量PCR实验,并绘制其标准曲线,计算出线性方程,同时检测该提取方法下实时荧光定量PCR对血清样本中HCV RNA的最低检测限并对其检测重复性进行验证。结果纳米二氧化硅颗粒硅醇基化后其吸附核酸的能力显著提高;病毒裂解液中GuSCN的最佳浓度为4．23 mol/L。使用改良方法提取血清样本中的HCV RNA用于实时荧光定量PCR ,获得标准曲线和线性方程,其线性相关系数（R2）达到0．999,检测的线性范围为2．52～5．52 IU/mL ,或者102．52～105．52病原体数/毫升。该方法的检测限达到（2．52＆#177;0．50）IU/mL ,且其检测重复性良好。结论改良后的固相吸附法可以大大降低实时荧光定量PCR的最低检测限,提高了HCV的阳性检测率。该方法操作简单,成本低,可以广泛应用于临床中HCV的检测和其他病毒的核酸检测。     

两种核酸提取方法对血清HBV-DNA定量检测的影响

目的比较二氧化硅吸附法与简易常用的煮沸裂解法提取样本核酸的差异,选择可靠的检测HBV-DNA提取方法。方法运用推荐的二氧化硅吸附法与简易常用的煮沸裂解法分别提取血清样本核酸模板,应用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测HBV-DNA。结果共80例HB sA g阳性患者血清,二氧化硅吸附法检测其中有55例HBV-DNA阳性(>1000拷贝/m l定性为阳性),煮沸裂解法检测出41例阳性(均在上述55例中);两法都没有检测到25例(<1000拷贝/m l)。比较41例两法都检测出的HBV-DNA定量(拷贝数/m l)对数换算值,二氧化硅吸附法(x-±s)为7.124±1.282,煮沸裂解法为5.198±1.311。统计分析表明,两种方法定性检出率差异明显:阳性符合率100%,阴性符合率64.1%,χ2=12.07、P<0.005;定量检测值也具显著性差异,相关分析Y=0.947 7X 2.200 6,r=0.969 1,P<0.005;另外,对比10次重复提取核酸后HBV-DNA检测,二氧化硅吸附法的重复性(以CV计)4.24%明显优于煮沸裂解法11.4%。结论煮沸裂解法提取核酸模板虽然操作简单,但重复性、阳性检出率与检测值均较二氧化硅吸附法低,直接影响临床对HBV感染的诊断、治疗以及疗效判断。建议弃用煮沸裂解法用以检测HBV-DNA。     

利用包膜RNA技术构建的假病毒颗粒在病原体灭活有效性验证中的应用

目的表达含Sindbis病毒特异性序列的包膜RNA颗粒,评价其在Sindbis病毒灭活中作为有效评价物的可行性。方法构建含Sindbis病毒特异性序列的重组质粒,表达出Sindbis假病毒颗粒。将Sindbis病毒和假病毒颗粒做亚甲蓝光化学灭活处理,然后检测Sindbis病毒感染性,同时荧光定量PCR检测Sindbis病毒和假病毒颗粒核酸损伤,3者数据做相关性分析。结果 Sindbis病毒和假病毒颗粒的核酸损伤程度随着Sindbis病毒感染性降低而增强,10000lux光照20min后感染性不再降低且核酸定量log值也不再有明显下降,与空白对照相比,Sindbis核酸降低值分别与Sindbis病毒感染性降低值和假病毒颗粒核酸降低值呈线性相关性(R2=0.9937和R2=0.9975)。结论提示结合荧光定量PCR检测,假病毒颗粒作为Sindbis病毒光化学灭活的有效评价物具有可行性。     

核酸提取方法在聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸中的评价

目的 对不同核酸提取方法在荧光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）检测血清乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）含量中应用进行评价，为临床方法学选择和实验结果的评价提供理论依据。方法 选用直接煮沸裂解法、NP－40煮沸裂解法、沉淀煮沸裂解法、磁珠核酸提取法等4种核酸提取方法提取乙型肝炎血清标本和含不同含量肝素的血清标本中HBV DNA模板，用荧光实时定量PCR法对其进行准确定量，从提取效率、抗干扰能力方面进行评价。结果 4种核酸提取方法中磁珠核酸提取法提取效率为最高，对数换算后，以此相对提取效率为100％，则直接煮沸裂解法为最低81％（P＜0．05）、NP－40煮沸裂解法为95％（P＞0．05）、沉淀煮沸裂解法为88．7％（P＜0．05）；从抗干扰能力方面，当肝素含量为500U／ml时，磁珠核酸提取法抗干扰能力最强，沉淀煮沸裂解法次之、直接煮沸裂解法和NP－40煮沸裂解法为最差，其HBV DNA含量抑制率分别为9．4％、13．5％、35．4％、52．7％。结论 本实验结果认为磁珠核酸提取法为实验室首选的核酸提取方法。     

病毒保存液相关性能研究

目的 研究病毒保存液用于病毒保存和病毒灭活效果的相关性能。方法 采用病毒滴度测定和PCR测定方法，对新研制的病毒保存液用于病毒保存和病毒灭活效果相关性能进行测定。结果 灭活型病毒保存液保存的病毒在2 h后完全失活。非灭活型病毒保存液保存的病毒活性能保存6 h以上。两种保存液的核酸保存能力在37℃静置达4 h，在室温（28℃）静置达8 h，在4℃静置达24 h。结论 该病毒保存液的病毒保存效果、核酸保存力和灭活效果良好，能满足病毒试验操作需求。     

甲型H1N1流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的优化及应用

目的优化甲型流感病毒核酸提取步骤和RT-PCR反应液组成,提高RT-PCR荧光检测敏感性、缩短报告时间。方法优化QIAampViralRNAminiKit核酸提取操作步骤,对核酸裂解液处理后的样本进行两次层析柱过滤,核酸洗脱由试剂盒的室温环境改为72℃温育5min后离心洗脱,荧光RT-PCR反应液采用SuperScriptⅢPlatinumqRT-PCR系统优化,RT-PCR扩增程序修改如下:RT反应为50℃,10min,然后95℃,5min破坏逆转录酶,继后为45个循环的95℃,15s变性和60℃,30s复性和延伸。结果优化的甲型流感病毒核酸提取方法与QIAampViralRNA试剂盒方法获得的核酸Ct值基本一致,但低病毒含量样本的核酸提取效率明显高于未优化方法[优化方法Ct值(27.3,32.2,39.4),未优化方法Ct值(27.6,32.7,40.6)]。同一核酸在优化荧光RT-PCR扩增试剂的Ct值(25.0,30.5,35.6),扩增时间1h10min;明显优于配发试剂(27.3,32.5,40.1),扩增时间2h25min。结论优化后的甲型H1N1流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法,无论是核酸提取还是荧光PCR扩增,其敏感性均明显得到提升,报告时间明显缩短。     

核黄素光化学法灭活Sindbis病毒的研究

目的探究核黄素光化学反应对Sindbis病毒的灭活效果。方法将10 mmol/L的核黄素0.050 mL加入到4.95 mL的Sindbis病毒(XJ-160株)悬液中,经440 nm波段的可见光(40 J/cm2)双侧照射后,接种至幼仓鼠肾细胞(BHK-21)中培养,观察细胞病变情况(CPE),检测病毒滴度,用PCR检测病毒核酸的变化,并在透射电镜下观察病毒形态。结果经终浓度为100μmol/L核黄素结合440 nm可见光作用,可将滴度为6.5 log TCID50Sindbis病毒灭活至≤0.5 logTCID50;PCR法未能扩增出病毒核酸片段;透射电镜显示病毒颗粒塌陷。结论核黄素光化学法能有效灭活Sindbis病毒,其主要作用靶点为核酸。     

气管滴注纳米二氧化硅颗粒致大鼠肺炎症反应及脏器中硅浓度变化的研究

目的对纳米二氧化硅颗粒导致大鼠肺脏的炎症反应进行研究。方法将128只雄性Wistar大鼠随机分为4组，分别为空白对照组（生理盐水）、0．5、1和2mg／Kg·bw剂量组，采用非暴露式气管滴注染毒一次，分别于染毒后的1d、7d、14d以及28d后处死大鼠，每实验组各处死8只动物，分别检测分析脏器中的硅浓度的变化；检测肺泡灌洗液中白细胞总数、蛋白含量、乳酸脱氢酶。结果纳米二氧化硅颗粒主要分布在肝脏和肾脏；可引起大鼠肺部明显的炎症反应；可引起肺泡灌洗液中的白细胞总数、蛋白含量、乳酸脱氢酶升高。结论纳米二氧化硅颗粒可引起肺组织损伤，对大鼠具有一定的肺毒性作用。     

多重定量PCR法同步检测HBV、HCV和HIV-1在血液筛查中的优化及应用

目的 初步探讨多重定量聚合酶链反应（PCR）同步检测乙型肝炎病毒（HBV） DNA,丙型肝炎病毒（HCV） RNA及人类免疫缺陷病毒（HIV）-1 RNA在血液筛查中的应用前景.方法 选择2012年8月至12月,于孝感市中心血站志愿献血的合格献血者血样中,经2次酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBV表面抗原（HBsAg）、抗HCV及抗HIV-1,检测结果均呈阴性的4 800份血样为研究对象.采用全自动核酸混合提取仪对该4 800份血样进行核酸提取,然后利用多重定量PCR方法对血样中HBV、HCV及HIV-1进行同步扩增检测.采用中国药品和生物制品检定所提供的HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA标准参考品,检测多重定量PCR的灵敏度,并与单重定量PCR的灵敏度进行比较.在HBV、HCV及HIV-1 3者中任意1种病毒基因组浓度较高的条件下,对多重定量PCR检测另2种低浓度病毒基因组的能力进行评估.结果 增加多重定量PCR中c-MMLV逆转录酶和Hot Taq酶的用量,并适量加入单链结合蛋白（SSB）,可使其扩增效率提升至单重定量PCR扩增水平.本组4 800份血样中,经多重定量PCR检测出3份HBV DNA阳性样品,ELISA漏检率为0.062 5％,未发现HCV RNA和HIV-1 RNA阳性样品;多重定量PCR检测HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA在95％置信区间的灵敏度浓度分别为115 IU/mL、376 IU /mL和232 IU /mL;单重定量PCR检测HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA在95％置信区间的灵敏度浓度分别为51 IU /mL、94 IU /mL和78 IU/mL.结论 本研究初步建立了对献血者血液同时进行HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA检测的多重定量PCR检测方法;该检测体系经过进一步优化后,有望应用于临床大规模血液病毒筛查.     

两种核酸提取方法检测血清丙型肝炎病毒核糖核酸的比较

目的比较两种不同核酸提取方法检测血清丙型肝炎病毒核糖核酸（HcuRNA）对临床诊断的应用价值。方法对128份HcV抗体阳性的患者血清,同时用两种实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法检测HCV—RNA并检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平,这两种方法分别是用二氧化硅微粒法提取RNA和纯化柱法提取RNA。结果128份HCV抗体阳性的血清中二氧化硅微粒法HCV—RNA阳性率41．41％,纯化柱法HcV—RNA阳性率59．38％,纯化枉法优于二氧化硅微粒法,差异有统计学意义（x2=8．27,P〈0．05）。49份HCV抗体阳性的血清中ALT异常,且ALT浓度变化与纯化柱法HCV—RNA水平呈正相关性（r=0．95,P〈0．05）。结论血清HCV—RNA检测对丙型肝炎诊断和病情监测均有重要的临床意义,采用纯化柱法提取RNA具有更优的临床价值。     

Automation of nucleic acid extraction for NAT screening of individual blood units

BACKGROUND: Automation of NAT for single units of blood is currently hampered by the labor-intensive steps involved in the extraction of nucleic acids from samples before the amplification procedures. A new method has been developed for the automation of these steps using hydrophilic polyvinylidene fluoride (PVDF) filter plates. STUDY DESIGN AND METHODS: Quantitative nucleic acid recoveries from sera containing HCV, HIV, HBV, HAV, and human parvovirus B19 and from 3H-labeled HCV RNA were determined in parallel by the semi-automated PVDF method and a single-column method (Qiagen). Quantitative PCR was performed. RESULTS: Similar recoveries of HCV, HIV, and HBV (with silica beads) were observed with the PVDF method and with the Qiagen single-column method. The sensitivity of the PVDF-based PCR assay for HCV, HIV, and HBV in serially diluted serum samples was always within two serial dilutions of that obtained when the Qiagen single-column method was used in the same assays. With the use of 3H-labeled HCV RNA, recoveries of approximately 70 percent were found by both methods. CONCLUSION: The PVDF method will permit full automation of the simultaneous extraction of nucleic acid from sera containing HCV, HIV, and HBV. This procedure will permit NAT screening of individual units of blood, will replace the current screening of pools, and will achieve improved blood safety with reduced labor and costs.     

探讨某地区临床用红细胞悬液输血感染HBV、HCV残存风险

目的探讨某地患者输注血液制品后存在输血感染HBV、HCV的可能性,为血源检测是否应增加病毒核酸扩增方法提供数据。方法对本地区临床用10459份红细胞悬液进行HBV、HCV实时荧光PCR检测。结果 HBV阳性率为0.105%,HCV阳性率为0.028%。结论我国在对血源筛检过程中,应增加病毒核酸检测项目。     

献血者HCV RNA实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立快速检测献血者中丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的方法。方法利用体外转录制备的HCV RNA转录体进行病毒RNA抽提方法及抽提效率的比较;将RNA转录体与正常血清进行不同数目的混合,对最佳混合标本数进行了摸索;建立HCV荧光定量PCR方法(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR),并对献血者进行混合标本HCV核酸检测。结果确定了比较理想的病毒RNA抽提方法;用于HCV核酸检测的混合标本数为24例;建立的荧光定量PCR方法能最低检测出10个copies/ml;采取24例混合血标本方法,FQ-PCR检测HCV RNA,576例ELISA检测HCV阴性的献血者未检测出HCV RNA。结论初步建立了献血者HCV感染的混合标本荧光定量PCR检测方法。     

纳米金比色芯片同步目视化检测HBV和HCV

目的 建立一种简单、快速的比色芯片可同时目视化检测HBVDNA和HCVRNA。方法 利用多重PCR方法扩增HBsAg阳性合并抗HCV阳性的患者血清中提取的HBVDNA和HCVcDNA。制备Au纳米颗粒基因探针，检测探针与固定在尼龙膜上的捕捉探针构成双探针，用斑点杂交法检测HBVDNA、HCVcDNA的多重PCR产物，加入银离子（Ag^＋）-对苯二酚液染色观察结果。结果 多重PCR可同时扩增HBVDNA和HCVcDNA，出现预期的431bp和323bp特异性条带。纳米金比色芯片可以同步目视化检出乙型、丙型肝炎合并感染患者血清中HBVDNA和HCVRNA的PCR产物。结论 目视化HBV、HCV纳米金比色芯片诊断方法操作简单、特异性好、成本低廉、结果 判定指标客观，此类基因芯片在病毒基因检测领域将会有广泛用途。     

血液透析患者单个核细胞中TTV-DNA的研究

目的 :探讨血液透析患者血清和外周血单个核细胞 (PBMC)中输血传播病毒 (TTV)检测状况及意义。方法 :采用聚合酶链反应 (PCR)对 6 6例血液透析患者血清及PBMC进行TTV DNA检测 ,同时采用酶免疫分析 (EIA)检测血清中HBsAg和抗 HCV。结果 :血液透析患者TTV、HCV、HBV检出率分别为 18.2 %、2 4 .2 %、7.6 %。血清TTV DNA阳性与阴性患者 ,抗 HCV阳性率分别为 9.1%与 2 7.3% ,HBsAg阳性率分别为 0 %与 9.1% ,经统计学分析均无显著差异。PBMC中TTV DNA检出率 2 2 .7% ,PBMC中TTV DNA检出率在血清TTV DNA阳性者显著高于血清TTV DNA阴性者 (5 8.3%vs 14 .8% ,P<0 .0 5 )。结论 :血液透析患者TTV感染不依赖于HCV或HBV而存在。PBMC中TTV DNA主要在血清TTV DNA阳性患者中检出 ,PBMC可能是TTV的一个贮存场所。     

PCR-微流芯片检测HBV DNA在血液筛查中的初步应用

目的　探讨在血液筛查中检测HBVDNA的必要性及应用PCR 微流芯片检测献血者HBVDNA可运 行模式。方法用PCR 微流芯片检测已经过常规ELISA初、复检全项测定合格献血者的微量血清汇集池(5人 份×50μl)HBVDNA,再对阳性血清汇集池中的标本进行单份检测。用HBVDNA(-)的献血者血清系列稀释 HBVDNA标准质控血清,分别测定其含量,以确定该方法的灵敏度;分别检测37例HBeAg(+)、16例HCV RNA(+)、3例抗 HAVIgM(+)患者标本的HBVDNA,观察其特异性;再重复检测不同稀释度的HBVDNA标 准质控血清,以了解其批内、批间变异。结果　545份(分109个血清汇集池)无偿献血标本中有7份HBVDNA阳 性(1.28%)。PCR 微流芯片法检测HBVDNA敏感度为4.81×102拷贝/ml;HBeAg(+)患者的HBVDNA阳性 检出率为100%(37/37),而HCVRNA(+)、抗 HAVIgM(+)患者的HBVDNA全为阴性;批间、批内变异范围 分别为15.6%～40.2%、11.9%～30.6%。结论无偿献血者开展HBVDNA检测是必要的。PCR 微流芯片法 具有操作简便、快速、敏感度高、特异性强、重复性好等特点,把它应用于血液筛查中并利用混合标本检测HBV DNA是可行的,这将有助于进一步提高输血的安全性。     

基于磁珠核酸提取方法对现有国产HBV DNA试剂盒分析灵敏度的改进

建立一种基于纳米磁珠为介质的核酸提取和富集方法,提高国产HBV核酸检测试剂的分析灵敏度,用于痕量HBV DNA的测定.方法选择经抗病毒治疗HBV DNA浓度≤1×104 IU/ml的乙型肝炎患者血清标本50份.标准品采用WHO HBV DNA标准品.通过纳米磁珠实现对HBV核酸的吸附浓缩,提高提取的HBV核酸模板的浓度.以瑞士罗氏公司HBV DNA检测试剂和4种国产试剂原有的核酸提取检测方法为对照,评价该方法对国产核酸检测试剂的改进效果.结果纳米磁珠核酸提取方法与国产试剂结合后,国产试剂的分析灵敏度分别达到10和50 IU/ml,与罗氏试剂的分析灵敏度12 IU/ml基本相当.4种国产试剂盒内自带提取试剂检测临床乙型肝炎患者血清中痕量HBV DNA阳性检出率分别为64%(32份)、56%(28份)、62%(31份)和58%(29份),与罗氏试剂阳性检出率88%比较,差异具有统计学意义(x2值分别为7.895、12.698、9.013、11.416,P均＜0.05).纳米磁珠核酸提取方法与国产试剂结合后,阳性检出率分别为88%(44份)、88%(44份)、88%(44份)和86%(43份),与罗氏试剂(88%)比较,阳性检出率差异无统计学意义(x2值分别为0.000、0.000、0.000、0.088,P均＞0.05).HBV核酸浓度为101～103 IU/ml时,病毒核酸浓度对数值与循环阈值呈负相关,但是比103～106 IU/ml浓度范围的相关性下降.结论以纳米磁珠为介质建立的核酸提取方法可显著提高国产HBV DNA检测的分析灵敏度,对监测乙型肝炎患者血液中痕量HBV DNA含量具有重要意义.     

HCV-RNA与HCV-cAg检测的相关性分析

目的探讨丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)与HCV-RNA检测的相关性及其在丙型肝炎病毒感染诊断中的价值。方法采用双抗体夹心酶联免疫分析法(ELISA)检测HCV-cAg;采用实时荧光定量PCR法检测HCV-RNA,以了解两者检测方法的相关性。结果在160例HCV-RNA阳性血清中,HCV-cAg阳性148例,阳性符合率92.5%;在60例HCV-cAg阳性血清中,HCV-RNA阳性59例,阳性符合率98.3%。结论通过对HCV-RNA与HCV-cAg检测,说明HCV核心抗原与HCV-RNA检测可作为反映HCV复制的间接指标,预防窗口期感染。由于HCV-cAg在方法学上与HCV-RNA相比,具有方法简便、快速、价廉,所需设备简单,易于普及应用等优点,特别是在不具备HCV-RNA检测条件的基层医疗单位作为HCV感染检测的直接证据具有重要的意义。