PCR-RFLP和PCR-SSCP技术对常见食源性感染致病菌23S rDNA基因的鉴定

目的 探讨应用PCR-RFLP和PCR-SSCP进行食源性感染常见致病菌鉴定的可行性。方法 选择细菌23 S rDNA基因作为靶基因,设计合适的通用引物进行PCR扩增,对13种食源性感染常见致病菌扩增产物的酶切片段进行RFLP和SSCP分析：结果通用引物可以扩增出13种食源性感染常见致病菌的23 S rDNA基因,Hpn Ⅱ酶切产物的RFLP分析表明,不同种属的致病菌表现出不同的RFLP图谱;SSCP分析表明,13种食源性感染常见致病菌SSCP图谱变异性更大,不利于种属间鉴别,但有利于种内的鉴定。结论 运用PCR-RFLP和PCR-SSCP可以进行食源性感染常见致病菌的鉴定诊断、     

小儿常见感染菌16S—23S rRNA基因区间的分子生物学研究

目的：探讨聚合酶链反应（PCR）加限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）分析在细菌rDNA区间检测中的应用。方法：以16S－23S RNA基因区间为靶序列,设计引物,选择合适的内切酶,采用PCR法加RFLP法检测标准菌株及临床菌株的rDNA区间。结果：26株不同的标准菌株经PCR扩增后,分别出现一条带,两条带,三条带及多条带的不同DNA图谱,敏感性试验可检出2．5CFU的细菌,与人类基因组DNA,真菌及病毒无交叉反应,其中14种菌经一步PCR扩增即可区分,另12种菌除肺炎克雷伯氏菌与坚韧肠球菌经Hinf I或Alu I酶切后仍不能区分外,其余经其中一内切酶酶切后均能区分,32例血培养阳性标本均扩增出与相应标准菌株相一致的图谱。结论：16S－22S rRNA区间基因PCR．扩增加RFLP技术检测细菌rDNA区间,具有特异,敏感,快速,准确的特点,为细菌感染的病原诊断提供新的科学依据。     

16S rRNA通用引物在血小板制品细菌污染检测中的应用

目的评价16S rRNA通用引物在快速检出血小板制品中污染细菌的实用性,寻找新的能够快速、准确地检出血小板中污染细菌的方法。方法用分子生物学方法提取样本中细菌DNA,用设计合成的16S rRNA和16S—23S rRNA基因区间引物进行扩增,产物经HaeⅢ酶切,酶切片段与血小板污染常见菌的酶切图谱对比,确定有无污染及污染菌种类。结果16S rRNA通用引物法可以在4h内完成全部检测,其中在保存24h的血小板标本中未检出污染菌,保存48h的血小板标本中有2份分别检出了金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌,与全自动细菌培养仪的结果一致。结论16S rRNA通用引物是一种快速、准确检出血小板制品中污染细菌的方法,结果可靠,具有较高的临床应用价值。     

改良的ApoE基因多态性检测方法在健康人群的应用

目的应用改良的ApoE基因多态性检测方法快速、准确的筛查体检除外冠心病的健康人群的ApoE基因型，并以已知基因型的质粒作准确对照，证实改良的ApoE基因多态性检测方法的有效性和可靠性。方法采集健康体检者清晨空腹血，用试剂合提取白细胞基因组DNA，设计引物，应用聚合酶链式反应（PCa），扩增包括编码112位和158位氨基酸的ApoE基因片段，用限制性内切酶AflⅢ和HaeⅡ消化PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描电泳结果，在标准分子量对照下鉴定不同个体的ApoE基因型。同时以已知的ApoE2，E3，FA质粒为模板扩增ApoE基因片段，内切酶AflⅢ和HaeⅡ消化PCR产物进行对照。结果ApoE2，ApoE3，ApoFA经AflⅢ酶切分别得到231bp、231bp、231bp＋295bp片段；经HaeⅡ酶切，分别得到267bp、231bp、231bp片段。结论改良的ApoE基因多态性检测方法在保持准确性的同时，与传统的PCR—RFLP方法相比耗时少，成本低，毒性小，是对传统方法有益的改良。     

应用DNA扩增进行血友病乙遗传咨询

对凝血因子Ⅸ基因缺陷所致的血友病乙进行遗传咨询需用DNA分析法检出基因携带者并做出产前诊断.目前已用6种限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)在80%高加索血友病乙家庭中做出基因诊断.其中应用Mnl I RFLP分析中所得DNA片段小,用此RFLP分析有一定技术困难.已证实Mnl I多态性是位于因子Ⅸ基因20422位的单碱基突变(G→A)并造成因子Ⅸ蛋白第148位氨基酸的丙氨酸变为苏氨酸(threonine)作者应用聚合酶链反应(PCR)扩增了基因组DNA多态区,直接检测其DNA片段的RFLP所用的引物为合成的寡核苷酸PCR 5F及PCR 3F2.扩     

细胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB基因酶切图谱分析

目的探讨细胞壁缺陷对淋病奈瑟菌隐蔽性质粒B(cppB)基因的影响以及细胞壁缺陷型淋病奈瑟菌cppB的变异特点。方法用青霉素诱导淋病奈瑟菌成为细胞壁缺陷型并获得其纯培养物,cppB基因特异性引物PCR检测细胞壁缺陷型纯培养物的cppB基因,并对其cppB基因PCR扩增产物进行限制性核酸内切酶图谱分析。结果细菌型和细胞壁缺陷型均具有cppB基因扩增产物,经过限制性内切酶HindⅢ、HinfⅠ、HpaⅡ和MspⅠ消化和电泳,在5%PAGE凝胶电泳中,呈现出相同的电泳条带。结论淋病奈瑟菌细菌型及其细胞壁缺陷型对cppB基因限制性核酸内切酶(HindⅢ、HinfⅠ、MspⅠ、HpaⅡ)的分析没有发现淋病奈瑟菌L型具有与其亲代细菌型不同的图谱,提示细胞壁缺陷没有导致淋病奈瑟菌的cppB基因发生这些核酸酶切位点中核苷酸序列的改变。     

鲍曼不动杆菌整合子与耐药性的相关性研究

目的 调查鲍曼不动杆菌中Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合子的存在情况,分析整合子与鲍曼不动杆菌耐药性的关系.方法 测定93株鲍曼不动杆菌对抗菌药物的敏感性;应用简并引物PCR方法,同时扩增整合子5’保守区的Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶基因,对阳性PCR产物用限制性内切酶HinfⅠ作限制片段长度多态性(RFLP)分析进行整合子分类.结果 ...     

关于N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA扩增的初步研究

目的通过实验方法扩增N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA.方法主要通过PCR技术,用各种N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA的特异性引物进行扩增并结合电泳技术,用不同的限制性内切酶进行酶切鉴定.结果通过电泳图谱和酶切图谱初步证实了这一家族的不同成员均已得到有效的扩增.结论成功扩增了N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因家族cDNA,并为其文库的建立打下良好的基础.     

整合子与大肠埃希菌耐药性的相关性研究

目的调查大肠埃希菌中Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合子的存在情况,分析细菌携带的整合子与大肠埃希菌耐药性的关系。方法测定87株大肠埃希菌对抗菌药物的敏感性;应用简并引物聚合酶链反应（PCR）方法,同时扩增整合子5′保守区的Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶基因,对阳性PCR产物用限制性内切酶HinfⅠ作限制片段长度多态性（RFLP）分析进行整合子分类。结果 30株大肠埃希菌检测出Ⅰ类整合子,未检出Ⅱ类和Ⅲ类整合子。Ⅰ类整合子阳性菌株对抗菌药物的耐药率普遍比整合子阴性菌株高。结论大肠埃希菌临床分离株的耐药性强,细菌的多重耐药与Ⅰ类整合子相关。     

致死性侏儒症p.R248C突变热点的快速检测和三例TD-Ⅰ型高危胎儿的快速产前诊断

目的 针对致死性侏儒症Ⅰ型(thanatophoric dysplasia type Ⅰ,TD-Ⅰ)FGFR3基因的突变热点“p.R248C”,建立快速特异的酶切鉴定法(restriction endonuelease testing,RE)和扩增受阻突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)/RE法,并应用于后续3例疑似TD-Ⅰ高危胎儿的快速产前诊断,以及时防止患胎出生,同时为今后的胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)打下良好基础.方法 首先,针对突变热点p.R248C突变前后的序列特点,选择合适的内切酶“AfeI”,建立酶切鉴定法.其次,没计双错配碱基特异引物结合Apa LI酶切,建立ARMS/RE双重特异鉴定法.对阴性和阳性结果均再用普通引物扩、测的结果进行验证. 结果 用AfeI酶切FGFR3基因exons (6-7)普通引物的PCR产物(535 bp),正常对照及非p.R248C突变的TD病例均能被切成255 bp和280 bp 2个片段,而胎1～胎3均切出255 bp、280 bp和535 bp 3个片段.用特异引物E7(p.R248C)扩增,正常对照和非p.R248C突变的TD病例均扩增阴性,无法进一步做酶切鉴定;而p.R248C突变均扩增阳性,当再用Apa LI酶切PCR产物(365 bp)时,胎1～胎3均切出22 bp和343 bp 2个片段.通过引物扩、测结果显示:胎1～胎3均是p.R248C杂合突变. 结论 该法快速特异、准确可靠,可用于p.R248C突变热点的快速检测及含该突变高危胎儿的快速产前诊断.该法还可用于含p.R248C突变TD-Ⅰ型家系的PGD.胎1～胎3都是TD-Ⅰ患胎,建议尽早终止妊娠.