肝细胞性肝癌患者介入治疗前后血清蛋白质组的变化

目的用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（surface—enhanced laser desorption—ionization timeof—flightmass spectrometry,SELDI—TOF—MS）蛋白质芯片检测肝细胞性肝癌（简称肝癌）患者介入治疗前后血清蛋白质组的变化,初步探讨肝癌介入治疗的药物靶点。方法应用SELDI—TOF—MS蛋白质芯片检测50例未经治疗的肝癌患者、50例介入治疗的肝癌患者,获得弱阳离子交换芯片（weakcationicexchanger）蛋白表达图谱,Bio．MarkerWizard软件分析差异蛋白。结果未经治疗的肝癌患者和介入治疗的肝癌患者血清中检测到不同质荷比处有3个差异蛋白质峰,其蛋白质含量差异有统计学意义（P〈0．05）。数据库搜索这3个蛋白质峰,得到3种与之分子量最为接近的蛋白质。结论应用SELDI—TOF—MS筛选肝癌患者介入治疗的药物靶点快速、有效,检测到的3个差异蛋白质可能是肝癌患者介入治疗的药物靶点。     

不同转移潜能人肝癌细胞系转录因子活性差异分析

目的分析不同转移潜能人肝癌细胞系细胞核内转录因子活性的差异，筛选与肝癌转移相关的转录因子。方法应用转录因子活性芯片技术，在功能水平分析三种不同转移潜能人肝癌细胞系（Hep3B、MHCC97L和MHCC97H）细胞核内转录因子活性的差异，并用电泳迁移率变动分析和蛋白免疫印迹实验验证芯片结果。结果在345个候选的转录因子中，筛选出7个活性差异转录因子。随人肝癌细胞转移潜能的增高（Hep3B〈MHCC97L〈MHCC97H），活性上调的转录因子有5个，包括p53、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、核因子κb、信号传导及转录活化因子3（Stat3）和Sp1；活性下调的转录因子有2个，包括Rb和Smad3。结论转录因子活性异常与肝癌转移密切相关，本实验筛选出的转录因子可能有助于揭示肝癌转移的分子机制，并寻找新的预测指标及干预治疗的靶点。     

正常肝组织与肝癌组织差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的 构建人正常肝组织与肝癌组织差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交技术,以癌旁正常肝组织及肝癌组织作为对比材料,分离肝癌组织中不表达或低表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取100个白色克隆进行酶切鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得4000余个白色阳性克隆,随机挑取的100个白色克隆进行酶切鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得4000余个白色阳性克隆,随机挑取的100个白色克隆经酶切后均有200-600bp的插入片段。结论 用SSH法及T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝癌组织差异表达基因的消减cDNA文库,该文库的建立为进一步筛选、克隆肝癌组织中失活或低表达的新的抑癌基因奠定了基因。     

德氮吡格对人肝癌细胞株QGY-7701蛋白表达的影响

德氮吡格(TNBG)为本室开发研制的具有创新构型的抗肿瘤药物.在荷瘤动物实验中显示:TNBG具有较好的抗肿瘤作用,处理组较对照组的生存时间明显延长.TNBG不良反应较小,与常用抗癌药物相比基本无交叉耐药性.     

ABCG2在肝细胞性肝癌组织和肝癌细胞株中的表达及意义

目的: 探讨干细胞标志物ABCG2在肝细胞性肝癌组织和肝癌细胞株中表达的意义.方法: 应用免疫组化SP方法检测ABCG2在30例肝细胞性肝癌组织和8例癌旁肝硬化组织中的表达、分布, 并采用细胞免疫荧光技术检测ABCG2在两种肝癌细胞株HepG2、PLC/PRF/5中的表达, 采用流式细胞技术测试出两种细胞株中ABCG2阳性细胞的比例.结果: 免疫组化中, ABCG2阳性染色定位于癌细胞胞膜, 部分病例胞质也有分布. 免疫组化显示ABCG2在肝细胞性肝癌组织和癌旁肝硬化组织中的表达阳性率分别为63.33%(19/30)和25%(2/8). ABCG2蛋白在HepG2、PLC/PRF/5这两个肝癌细胞株中均有表达, HepG2中, ABCG2阳性染色定位于细胞胞质中, 而在PLC/PRF/5中, ABCG2阳性染色定位于细胞胞质和细胞膜上. PLC/PRF/5细胞株中, 通过流式细胞仪能检测出表达ABCG2的细胞( P<0.05), 而在HepG2细胞株中, 通过流式细胞仪不能检测出表达ABCG2的细胞.结论: ABCG2在肝细胞性肝癌的发生发展过程中可能起着非常重要的作用, 有可能成为临床治疗肝细胞性肝癌的分子靶标.     

毫米波诱导人肝癌细胞株凋亡的研究

目的　研究 35 .8GHz毫米波照射诱导人肝癌细胞株BEL74 0 4凋亡。方法　选取BEL74 0 4人肝癌细胞体外培养 ,随机分为 4组 ,分别为对照组、毫米波照射 30min组、氟尿嘧啶 (5 FU)组、毫米波联合 5 FU组。用荧光显微镜观察细胞核的变化 ;DNA片段化分析检测染色体断裂情况 ;用流式细胞仪检测凋亡率。结果　BEL74 0 4细胞经毫米波照射后诱发的细胞死亡具有细胞凋亡的形态学特征 ;照射 30min组和 5 FU组诱导细胞凋亡的比例高于对照组 ,分别为 (14 .33± 2 .6 6 ) % ,(18.5 8±2 .5 7) %和 (3.2 1± 1.0 6 ) % ,毫米波与 5 FU联合明显增加细胞凋亡率 ,达 (2 7.91± 3.6 6 ) %。结论　 35 .8GHz毫米波照射可诱导BEL74 0 4肝癌细胞凋亡 ,与 5 FU联合使用可明显增加凋亡比例     

肝癌差异表达基因EEG1的克隆和鉴定

目的:筛选和克隆肝癌和正常肝组织差异表达的基因片段,以探讨肝癌的发病机制.方法:应用mRNA差异显示技术(mRNA-DD),比较肝癌及正常肝组织基因表达的差异,对获得的差异基因片段进行克隆、测序,测序结果提交GenBank数据库中进行同源性分析,并对其中一条有明显差异的基因用半定量RT-PCR分析该基因在正常肝组织及肝癌组织中的表达情况.结果:凝胶扫描显示在500-600 bp处有一条差异片段,差异条带经酶切图谱分析证实重组质粒是目的克隆,将片段测序结果与GenBank数据库进行同源性比较发现该片段与已知基因EEG1高度同源(99%).RT-PCR结果显示在肝癌组织中EEG1 mRNA的表达水平明显低于正常肝癌组织(P=0.001).结论:EEG1基因在肝癌组织中的表达明显低于正常肝组织,提示EEG1基因的表达下调可能与肝癌的发病有关.     

仓鼠胰腺癌细胞株移植性肝癌模型的建立及其生物学特性

目的:建立仓鼠胰腺癌细胞株(pGHAM-1)移植性肝癌模型, 并研究其生物学特性.方法:将pGHAM-1培养后配成4×1010/L, 取0.5 mL接种于仓鼠皮下, 成瘤后, 接种于仓鼠肝脏. 分别于第20、30、40天用B超仪检测肝脏肿瘤大小. 于接种后第40天处死动物, 观察肿瘤的生长、转移及腹水量. 解剖取出肝脏,用游标卡尺测量肿瘤大小, 切开肝脏直接观察肿瘤, 再进行HE染色的组织病理学检查, 免疫组织化学检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)及肿瘤转移相关蛋白(nm23-H1)的表达.结果:pGHAM-1种植性肝癌模型成功率达100%. B超仪检测仓鼠肝脏, 第20、30、40天肿瘤体积分别为84.1±21.9 mm3, 413.7±208.4 mm3, 2187.3±1882.8 mm3, 与10 d前者相比, 有非常显著性差异(P <0.01); 接种后第40天处死动物, 解剖观察肿瘤, 直接测量肿瘤体积为2948.0±2188 mm3, 其大小与第40天B超仪测量结果无显著性差异(P >0.05). 部分仓鼠可见血性腹水; 肝内未见肿瘤卫星结节; HE染色组织病理学检查为低分化胰腺癌; 免疫组织化学检测结果显示VEGF及nm23-H1蛋白低表达.结论:pGHAM-1种植性肝癌模型建立方法简便, 易复制, 是理想的肝癌研究模型.     

黑色素瘤相关抗原A1在肝癌细胞株中的表达与基因甲基化程度的相关性

目的 探讨人肝癌细胞株中黑色素瘤相关抗原A1(MAGE-A1)表达状况与肝癌细胞基因甲基化的关系。方法 提取10种人肝癌细胞株的总RNA,用逆转录聚合酶链反应对细胞株的MAGE-A1基因的表达进行检测;提取10种人肝癌细胞株的基因组DNA,用限制性酶切和Southern印迹杂交对每种细胞的基因组甲基化程度进行定量分析。另外对基因组DNA行HpaⅡ酶切后,用引物CDS21、EDP4和CDS20、EDP4进行聚合酶链反应扩增,然后用特异性探针杂交来检测肝癌细胞株MAGE-A1启动子的甲基化状态。用特异性序列聚合酶链反应方法检测每一种细胞株的人白细胞抗原-A位点型别。结果 QGY-7703、SMMC-7721、HLE、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405肝癌细胞株的MAGE-A1基因表达阳性,且细胞分化程度均为中低分化;HepG2 2．2．15、HepG2、QGY-7701和Huh7肝癌细胞株的MAGE-A1基因表达阴性,且细胞分化程度均为高中分化。通过定量分析表明,MAGE-A1表达的肝癌细胞株与MAGE-A1不表达的肝癌细胞株比较,前者基因组甲基化程度较低(t=2．896,P=0．02)。肝癌细胞株MAGE-A1基因启动子区甲基化分析结果表明HepG2 2．2．15、HepG2、QGY-7701和Huh7为高甲基化,SMMC-7721、HLE、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405为低甲基化。结论 肝癌细胞株MAGE-A1 mRNA表达与其基因甲基化程度有关。     

乙型肝炎病毒X蛋白对人肝L-02细胞中COX-2表达的影响

目的:研究在人肝细胞L-02中乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对环氧化酶2(COX-2)表达的影响.方法:构建HBx基因表达载体pIRES2-AcGFP-HBx,转染入人肝细胞L-02中,RT-PCR和Westernblot检测HBx对COX-2表达的影响;通过细胞生长曲线和细胞周期变化,检测HBx蛋白对细胞分裂增殖的作用.同时将含有COX-2启动子核心片段的荧光素酶报告载体pGL3-COX-2转染入上述转染细胞,检测细胞荧光素酶荧光值以观察HBx蛋白对COX-2启动子活性的影响.结果:RT-PCR结果显示仅在HBx基因转染组细胞中有HBxmRNA的表达,且该组细胞中COX-2mRNA相对表达量显著高于空载体对照组和空白对照组(0.76±0.12vs0.28±0.04,0.25±0.03,均P<0.01);Westernblot结果显示,仅HBx基因转染组可见HBx蛋白有明显印迹条带,且该组细胞中COX-2蛋白免疫印迹较两对照组深;细胞生长曲线测定表明HBx基因转染组细胞在第3、4、5天的生长较两对照组显著加快(P<0.05);细胞周期测定显示与两对照组相比,HBx基因转染组G0-G1期比例显著降低,S期和G2-...     

Specific COX-2 inhibitor NS398 induces apoptosis in human liver cancer cell line HepG2 through BCL-2

AIM: To evaluate the effects of NS-398, a cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor, on the proliferation and apoptosis of HepG2 cells. METHODS: The effects of NS-398 on the proliferation of HepG2 cells were evaluated by MTT. DNA fragmentation gel analysis was used to analyze the apoptotic cells. DNA ploidy and apoptotic cell percentage were calculated by flow cytornetry. The expression of COX-2 and Bcl-2 mRNA was identified by competitive RT-PCR. Furthermore, expression level of Bcl-2 was detected using Western blot in HepG2 after treated with NS-398. RESULTS: NS-398 inhibited cell proliferation and induced apoptosis of HepG2 cells in a concentration-dependent manner. DNA ploidy analysis showed that S phase cells were significantly decreased with increase of NS-398 concentration. The quiescent GO/G1 phase was accumulated with decrease of Bcl-2 mRNA. Whereas NS-398 had no effect on the expression of COX-2 mRNA, and no correlations were found between COX-2 mRNA and HepG2 cell proliferation and apoptosis induced by NS-398 (r=0.056 and r=0.119, respectively). Bcl-2 protein level was inhibited after treated with NS-398. CONCLUSION: NS-398 significantly inhibits the proliferation and induces apoptosis of HepG2 cells. Mechanisms involved may be accumulation of quiescent GO/G1 phase and decrease of Bcl-2 expression.     

NS-398对HGF诱导的肝癌细胞株MMP-7,MMP-9,TIMP-1表达的影响

目的:研究选择性COX-2抑制剂NS-398对肝癌细胞株MMP和TIMP表达的影响,探讨选择性COX-2抑制剂降低肿瘤细胞侵袭力的机制．方法:以不同浓度的NS-398(0,20,40,60, 80μmol/L)作用于HGF诱导的HepG2细胞,免疫组化法观察细胞中MMP-7,MMP-9,TIMP-1的蛋白质表达,ELISA法检测细胞外培养液中MMP-7,MMP-9,TIMP-1的含量,RT-PCR法分析3种蛋白酶的mRNA转录水平．结果:NS-398作用细胞48 h后,发现MMP-7, MMP-9,TIMP-1的蛋白质表达程度均下降, NS-398作用于HepG2细胞后,MMP-7在培养液中的含量和其在细胞内的mRNA相对水平分别为8．2±0．6,5．8±0．8,4．3±0．8,2．7±0．4, 1．7±0．4μg／L和0．58±0．06,0．42±0．03,0.37±0．01,0．36±0．01,0．33±0．01:MMP-9在培养液中未检出,其细胞内mRNA相对水平分别为0．32±0．02,0．23±0．02,0．21±0．01,0．17±0．01,0．13±0．01;TIMP-1在培养液中的含量和其在细胞内的mRNA相对水平分别为39．0±0．9,29．5±2．8,25．0±0．9,16．8±0．4,11．8±0．3μg/L和0．19±0．02,0．17±0．02,0．16±0．01, 0．13±0．01．0．结论:选择性COX-2抑制剂能够抑制MMP和TIMP基因转录,使TIMP/MMP比例失衡,这可能是其降低肿瘤细胞侵袭力的机制之一．     

肝内胆管癌细胞系ICC-9810与肝细胞系L02蛋白质组学的差异分析

目的:分析肝内胆管癌细胞系ICC-9810与正常肝细胞系L02的蛋白质表达差异,筛选肝内胆管癌的潜在分子标志物.方法:应用表面增强激光解吸离子化(surface enhanced laser desorption/ionization,SELDI)蛋白质芯片技术检测肝内胆管癌及正常肝细胞系的蛋白质谱.用PBSII-C型蛋白质芯片阅读机读取数据,采用Proteinchip Software 3.0.2软件分析数据.结果:IMAC3、WCX2两种蛋白芯片共捕获376个蛋白峰,发现27个差异蛋白.与正常肝细胞系L02蛋白谱相比,9个蛋白在肝内胆管癌细胞系ICC-981O中高表达,18个蛋白在肝内胆管癌细胞系ICC-9810中低表达.其中3767、7999、10555、12163、22066和26794 Da6个差异蛋白可被WCX2和IMAC3芯片共同捕获.结论:肝内胆管癌与正常肝细胞存在差异蛋白表达,这些差异蛋白为寻找肝肿瘤标志物,了解肝内胆管癌的发病机制提供了重要线索.     

健择对胰腺癌细胞株蛋白质表达的影响

目的观察健择致胰腺癌细胞株蛋白质变化的影响,寻找一些在化疗过程中出现的蛋白质,为临床治疗提供理论依据.方法利用蛋白质组学技术,分析胰腺癌细胞株SW-1990在加入健择和5-FU后其蛋白质谱的变化,最后鉴定其差异表达的蛋白质.结果培养细胞受抑制约50%时,健择为1～100 ng/ml,5-FU为250～2 500 ng/ml.质谱鉴定了9个差异表达的蛋白质,其中对照组3个,加药组6个.结论健择对细胞株的作用明显优于5-FU.β-肌动蛋白、MGC:19713等某些高表达的蛋白质可能成为观察化疗效果的重要指标.     

NF-κB在肝癌细胞株SMMC-7721中的表达及意义

目的　了解NF -kB和ⅠkB在肝癌细胞中的表达情况及意义。方法　通过RT -PCR和Westernblot方法研究NF -kB和ⅠkB在肝癌细胞和正常肝细胞中的mRNA和蛋白表达的变化情况。结果　在肝癌细胞株SMMC -772 1中P65、P5 0mRNA表达增强而ⅠkBmRNA表达下降 (P <0 0 1) ;Westernblot结果显示肝癌细胞株SMMC -772 1细胞的胞核中P5 0、P65蛋白高水平表达 ,而正常肝细胞仅检测出极低水平的P5 0、P65蛋白 ,但是在SMMC -772 1细胞的胞质中ⅠkB蛋白低水平表达 ,正常肝细胞高水平表达。结论　肝癌细胞株SMMC -772 1中NF -kB的P5 0、P65亚基表达升高、ⅠkB表达下降与肿瘤细胞的生长密切相关。     

生长抑素对人肝癌HepG2细胞增殖及cyclinD1、cyclinE蛋白表达的影响

目的探讨生长抑素治疗肝癌的作用机制。方法取对数生长期HepG2细胞以不含血清的培养液使其周期同步化,以含血清培养液继续培养24h后随机分为观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组及对照组,前三组分别加入质量浓度为100、200、400μg／（kg·d）的生长抑素,对照组加入等体积RPMll640培养液24—72h。MTT比色法观察各组细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期分布,免疫组化法检测周期素D1（cyclinD1）、周期素E（cyclinE）蛋白表达。结果观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组不同时间点细胞增殖抑制率均显著高于对照组,且同一时间点观察Ⅲ组〉观察Ⅱ组〉观察I组,同组中72h〉48h〉24h（P〈0．05、0．01）;观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组G,期细胞比例均显著高于对照组,观察Ⅱ、Ⅲ组S期细胞比例均显著低于对照组（P〈0．05、0．01）;观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组cyclinD1、cyclinE蛋白水平均显著低于对照组,且观察Ⅲ组〈观察Ⅱ组〈观察Ⅰ组（P〈0．05、0．01）。结论生长抑素可通过下调cyclinD1、cyclinE表达抑制HepG2细胞增殖,此可能为其治疗肝癌的作用机制之一。     

IL-6对肝癌细胞HepG2浸润迁移能力的影响

目的观察肝癌细胞系HepG2自身分泌的白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)对其浸润迁移能力的影响。方法 RNA干扰技术沉默IL-6,同时设空白对照组(不加转染试剂)、正常对照组(转染空脂质体)、无义对照组(转染无义对照siRNA)、实验对照组(转染沉默IL-6的siRNA)。进行细胞划痕损伤实验检测细胞的迁移能力。结果 RT-PCR检测各组IL-6 mRNA的表达分别为100±7.87、303±19.95、160±10.95、23±7.02;IL-6在沉默组细胞的浸润迁移能力受到抑制,正常对照组(转染空脂质体)、无义对照组(转染无义对照siRNA)细胞的浸润迁移能力增强。结论 IL-6被沉默能抑制肝癌细胞系HepG2的迁移,肝癌细胞系HepG2IL-6表达增高能促进其自身发生迁移。     

Establishment of an AFP-producing serum-independent culture cell line of human liver cancer and changes in protein synthesis associated with the absence of serum (Second Part)

In this study, we investigated protein (total protein) synthesis and production of such as α-fetoprotein (AFP) and albumin (ALB) in the media for cultured human hepatocellular carcinoma cells. Consequently, it was found that total protein (TP) in the medium was consumed rapidly in the first day, thereafter TP consumption was not quantitatively significant. Since this cell line was also found to produce transferrin (TF) and fibronectin (FN), we investigated the AFP, ALB and TF production of this cell line by adding dexamethasone, a glucocorticoid involved in protein metabolism. As a result of adding dexamethasone, it was found that AFP and ALB (or TF) production increased simultaneously.     

Egr-1基因表达及其在射线诱导的肝癌细胞凋亡中的作用

目的:研究Egr-1基因的表达在放射诱导的细胞凋亡中的作用．方法:选择肝癌细胞系HepG2,SMMC-7721和正常肝细胞系HL-7702培养;培养细胞接受4Gy X射线照射;收获受照前和受照后1,2,4, 6,12和24 h的细胞,采用荧光定量PCR(FQ- PCR)检测0,1,2和4 h Egr-1基因的表达,采用流式细胞术(FCM)检测0,6,12和24 h细胞周期和细胞凋亡．结果:随HepG2,SMMC-7721和HL-7702在4GY X射线照射后1 h即诱导了Egr-1基因表达增高,4 h均未达峰值,分别为ΔEgrHepG2(12．9629±1．0649)、ΔEgr7702(0．0096±0．0008)和ΔEgr7721(0．0017±0．0003),HepG2显著高于HL-7702和SMMC-7721(P<0．01)．照射后6 h射线诱导的3株细胞凋亡均不明显,但在12 h均诱导了明显的细胞凋亡,而且HepG2(41．16％)和HL-7702(27．45％)已达峰值; SMMC-7721诱导的细胞凋亡水平较低,24 h仅为24．94％,且未达峰值．在射线诱导的细胞周期变化中,HepG2和SMMC-7721 S期的变化与细胞凋亡变化在6-12 h走势相反．结论:在HepG2,SMMC-7721和HL-7702细胞中,射线通过诱导Egr-1基因表达而诱导了细胞周期和细胞凋亡的变化;射线诱导的Egr-1基因表达水平可能与射线诱导的细胞凋亡成正相关;S期肿瘤细胞可能易发生射线诱导的细胞凋亡．