细菌耐药基因在斑马鱼体内转移规律的初步研究

目的初步研究耐药基因在斑马鱼体内转移和扩增规律。方法构建RP4质粒介导的耐药基因在斑马鱼肠道内转移模型并采用选择性平板筛选和qPCR技术研究斑马鱼粪便中耐药菌和耐药基因的体外排出量随时间的变化规律。结果细菌培养结果显示,粪便中耐药菌的数量大于供体菌数量,接合子最多时可占粪便中全部可培养细菌总数的12%。qPCR检测结果显示,粪便中耐药基因的相对表达量大于供体耐药基因的相对表达量,产生的接合子的相对数量可高达15%。结论本研究条件下,粪便固有细菌可获得耐药基因,耐药基因在斑马鱼肠道内发生了转移和扩增。     

利用流感病毒反向遗传学操作系统表达绿色荧光蛋白(EGFP)

目的 构建基于RNP复合体的流感病毒反向遗传学操作系统,并利用该系统表达绿色荧光蛋白.方法 将人源pol Ⅰ启动子分别插入真核表达载体pcDNA3和原核质粒pUC18,获得pol Ⅰ/pol Ⅱ双启动子表达载体pCHBW和pol Ⅰ单启动子表达载体pPol IR;来源于禽流感病毒H5N1湖北分离株A/Chicken/Hubei/489/2004的基因被克隆到pCHBW上,获得pCHBW-PB2、pCHBW-PB1、pCHBW-PA、pCHBW-NP;将荧光蛋白基因置换NA基因的编码区进而克隆到pPol IR上获得pPol IR-NA (EGFP);这些质粒共转染293T细胞并观察荧光.结果 所构建的载体均经酶切和测序验证正确.pCHBW-PB2、pCHBW-PB1、pCHBW-PA、pCHBW-NP和pPol IR-NA (EGFP)共转染293T细胞后能观察到绿色荧光,Western-blot实验证实被转染的293T细胞表达绿色荧光蛋白(EGFP).结论 基于RNP复合体的反向遗传操作系统构建成功,并表达绿色荧光蛋白.     

重组质粒pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-hERG的构建及其在细胞内的表达和定位

目的分别构建先天性长QT综合征(LQTS)相关HERG基因和E637K突变基因与红色和绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-bERG,观察其在细胞内的表达和定位情况。方法将克隆在pcDNA3上的HERG和E637K片段分别亚克隆到红色荧光蛋白载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1上,转染HEK293T细胞,24 h后利用western blot技术和荧光显微镜观察重组质粒蛋白表达和细胞内定位情况。结果重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误。转染pmCherry-WT-hERG野生型质粒的细胞可以检测到135 kD和155 kD 2条蛋白质条带,而转染pEGFP-E637K-bERG突变型质粒的细胞仅显示1条135 kD蛋白质条带,155 kD处条带缺失。融合蛋白发出的红色和绿色荧光表明,突变型蛋白分布于胞浆中,而野生型蛋白主要位于胞膜上。结论成功构建了pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-hERG不同荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中得到有效表达,为LQTS突变基因的进一步功能研究奠定了基础。     

荧光原位杂交技术鉴定RP4质粒在序批式反应器活性污泥间的水平转移

目的为RP4质粒在序批式反应器活性污泥间的水平转移提供影像学证据。方法构建正常运行的序批式反应器,通过投加带有RP4质粒的供体菌实现质粒的水平转移。实验组分别用特异性标记氨氧化菌,RP4质粒的寡核苷酸探针进行杂交,再用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染。对照组分别对纯培养的氨氧化菌,携带RP4质粒的供体菌和未投加供体菌的活性污泥进行相同的操作。通过荧光定量PCR技术对RP4质粒相对丰度变化情况进行验证。结果在实验组中发现了探针荧光的共定位现象,而对照组中均未发现荧光共定位现象。荧光定量PCR显示实验组污泥投加供体菌后RP4质粒相对丰度有所提高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 RP4质粒可以在正常运行的序批式反应器的活性污泥间发生水平转移。     

含热休克蛋白70和绿色荧光蛋白双顺反子慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定人热休克蛋白70(Hsp70)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子慢病毒表达载体,以探索Hsp70对细胞保护作用的影响。方法通过基因重组技术将人Hsp70连接到含EGFP的慢病毒载体中,包装并收集病毒,感染人胰腺癌细胞系Aspc-1细胞后,通过荧光显微镜观察EGFP的表达,同时利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Westernblot)技术检测Hsp70基因的表达情况。结果酶切和测序鉴定Hsp70-IRES-EGFP双顺反子慢病毒载体构建正确,包装病毒感染细胞后荧光显微镜观察到细胞发绿色荧光,RT-PCR和western blot检测均表明感染病毒后细胞Hsp70的表达量明显增加。结论成功构建了Hsp70-IRES-EGFP双顺反子慢病毒载体,为后续研究Hsp70的功能和作用机制奠定了一定的基础。     

微生物聚集体形态对多重耐药质粒接合转移的影响

目的研究水污染控制系统中微生物聚集体形态对多重耐药质粒接合转移的影响,为控制耐药基因在水环境中的传播提供科学依据。方法向运行稳定的颗粒污泥序批式反应器(granular sequencing batch reactor,GSBR)中投加具有利福平抗性且携带RP4质粒的大肠杆菌K12〔E.coli K12(RP4)Rif〕,将系统中的污泥按照粒径划分为4个区间,分别用定量PCR方法对污泥中总细菌16S r DNA和耐药质粒RP4进行定量,从而得到不同粒径区间的接合转移比例;同时监测GSBR中NH4+-N、CODCr的去除效率和污泥浓度(MLSS),以评价GSBR运行效能。结果投加供体菌后,系统中的供体菌所占比例在2 d内出现急剧下降,此后3~5 d,RP4所占比例一直稳定在10-7~10-6。从投加供体菌的第7天开始,粒径大于0.9 mm的微生物聚集体中无法检测出RP4;粒径范围在0.18~0.45 mm、0.46~0.9 mm的微生物聚集体中的RP4质粒在投加后的第11天消失;而粒径小于0.18 mm的絮状污泥中的RP4在投加供体菌后第19天消失。RP4在不同粒径微生物聚集体中的接合转移率明显不同,随着粒径的增大而降低。系统中投加供体菌后CODCr、NH4+-N的去除率均明显下降;污泥浓度(MLSS)从4855 mg/L降至3168 mg/L。结论实验过程中微生物聚集体的形态对耐药质粒RP4的接合转移有明显影响,粒径越大其接合转移率越低;且在投加供体菌初期,反应器NH4+-N、CODCr的去除能力下降明显,供体菌的投加也使污泥浓度的MLSS下降。     

蛋白A-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建与表达

绿色荧光蛋白 (GFP)是一种生物发光蛋白。GFP作为基因表达标记物或融合蛋白标记在动物、植物、微生物的研究中广泛应用。本实验将gfp基因与蛋白A基因重组 ,在大肠杆菌中融合表达为A GFP蛋白。根据gfp基因与质粒载体pRIT2T的序列 ,设计一对引物 ,以PCR技术扩增gfp基因序列 ,克隆到表达载体pRIT2T的EcoRⅠ与BamHⅠ酶切位点 ,与载体中的A蛋白基因融合。重组质粒转化大肠杆菌Top10 ,菌落在 36 5nm紫外光下呈现明亮的绿色荧光。本研究成功构建并表达了GFP与蛋白A的重组质粒 ,为开展GFP的研究及应用提供了生物工程工具的前体。     

纳米氧化铝促进多重耐药质粒RP4接合转移机制的初步研究

目的 探讨纳米氧化铝(Al<,2>O<,3>)对细菌抗氧化系统和接合基因转录活性的影响,阐明纳米Al<,2>O<,3>促进多重耐药质粒RP4接合转移的机制.方法 接合供体菌为E.coli HB101(RP4),受体菌为沙门菌50312(Salmonella aberdeenKauffmann 50312 str<'R>...     

1株同时携带mcr-1和NDM-5质粒介导耐药基因的泛耐药大肠埃希菌研究

目的对1株临床分离到的多黏菌素和碳青霉烯类均耐药的泛耐药大肠埃希菌的耐药机制进行研究。方法用梅里埃VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行细菌鉴定;微量肉汤稀释法检测常见抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);对细菌全基因组进行测序,分析细菌耐药基因分布情况。结果该株大肠埃希菌除替加环素和阿米卡星敏感外,对β-内酰胺类、碳青霉烯类和喹诺酮类药物耐药且同时对多黏菌素类抗生素耐药。全基因组测序分析显示该菌株同时携带mcr-1和NDM-5耐药基因,其中mcr-1耐药基因位于大小为251.657 kb的质粒上,bla NDM-5基因位于大小为46.19 kb的质粒上。结论同时携带mcr-1和NDM-5质粒介导耐药基因的泛耐药大肠埃希菌已在临床出现,其来源可能与抗生素的选择相关,应引起高度重视,需加强抗生素的使用限制及耐药菌的监测力度。     

产AmpC肺炎克雷伯菌质粒介导的多药耐药性与基因型研究

目的探讨产AmpC肺炎克雷伯菌耐药质粒介导的多药耐药性、耐药基因类型及转移方式。方法应用VITEK-2型全自动细菌鉴定仪鉴定细菌,头孢西丁纸片扩散法筛选出疑产AmpC酶阳性菌株,采用接合转移试验了解肺炎克雷伯菌耐药基因转移方式,通过K-B法检测受体菌的多药耐药性,并通过酶粗提物头孢西丁三维试验和PCR测序等试验分析其耐药基因。结果 820株临床分离的肺炎克雷伯菌筛选出疑产AmpC酶阳性菌株108株,阳性率为13.17%;108株疑产AmpC菌经接合试验、AmpC酶表型确认试验获53株产AmpC接合子;经基因测序单纯AmpC酶基因阳性菌株34株,阳性率64.15%;同时携带ESBLs和AmpC基因菌株检出19株,阳性率35.85%;其均能通过接合转移方式将其质粒携带的耐药性传递至受体菌。结论质粒介导AmpC酶是肺炎克雷伯菌产生多药耐药的重要原因,产酶株对多种抗菌药物耐药,耐药基因质粒的转移可导致耐药性的传播扩散。     

绿色荧光蛋白标记HIV融合蛋白基因表达载体

目的利用基因工程技术，构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的HIV（ENV-6C）基因的表达载体。并在E.coli BL21中高效表达。方法经核酸内切酶酶切、连接，构建重组表达载体pRSETB-HIV（ENV-6C）-GFP，通过十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western印迹杂交技术（Western blot）分析重组结果．转化到E．roli BL21中，荧光分光光度计检测含有重组质粒的大肠埃希菌培养物中重组蛋白的表达情况。结果成功构建重组原核表达载体pRSETB、HIV（ENV-6C）-GFP，并在E．coli BL21中实现高效表达，检则到发绿色荧光的融合蛋白GFP-HIV（ENV-6C）。结论融合蛋白具有人类免疫缺陷病毒（HIV）外壳蛋白的抗原活性，可用绿色荧光蛋白标记抗原，对制备HIV抗体及免疫诊断新技术有一定价值。     

霍乱弧菌含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体转染检测

[目的 ]研究霍乱毒素基因 (ctx)在霍乱弧菌O1 群埃尔托型、古典型菌株和O1 39群菌株之间的传递现象 ,了解含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体 (CTXΦ)在ctx基因转移中的作用。 [方法 ]从人工构建的供体菌中诱导出带有标记的CTXΦ并转染至受体菌 ,用PCR扩增和Southern杂交等方法检测受体菌、转染子及其质粒的目的基因片段。 [结果 ]从受体菌O395、569B(古典型 )和 80 0 71 (埃尔托型 )的转染子中均检出带有供体菌标记的质粒 ,PCR和Southern杂交结果表明这些质粒是CTXΦ的复制形式。 [结论 ]ctx基因能通过CTXΦ在不同霍乱弧菌间进行传递     

弗氏枸橼酸杆菌中发现介导 blaKPC-2传播的新型质粒及比较基因组学分析

目的探讨来自弗氏枸橼酸杆菌的产碳青霉烯酶的新型不相容群组质粒pNY2385-KPC的耐药机制及基因结构特征。方法从宁波市医疗中心李惠利医院急诊病房的发热患者尿液样本中获得1株多药耐药菌。采用16S rRNA基因扩增和平均核苷酸一致性(ANI)进行菌种鉴定;采用全自动细菌鉴定及药敏分析系统检测细菌MIC值;通过"三代"测序方法获得基因组序列, 然后通过BLASTP/BLASTN、RefSeq、ConservedDomains、ResFinder、Isfinder等对基因功能进行详细注释及比较基因组学分析。结果弗氏枸橼酸杆菌NY2385携带的质粒pNY2385-KPC为一种新型不相容群组质粒, 包含blaKPC-2, 具有接合转移(Ⅳ型分泌系统)基因, 可发生接合转移。NCBI中共检索到同型质粒15个, 来源于弗氏枸橼酸杆菌、黏质沙雷菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌和植生拉乌尔菌等细菌, 为泛宿主质粒。通过对来自弗氏枸橼酸杆菌中6个该新型质粒进行序列比较分析, 发现该新型质粒结构具有一定的保守性, 具有携带blaKPC-2的Tn6296变体结构, 而且质粒pCF1807-3同时具有...     

多重耐药菌E.coli K12(RP4)对颗粒污泥生物处理系统氨氧化细菌的影响

目的研究多重耐药菌对颗粒污泥生物处理系统硝化过程中氨氧化细菌的影响,为降低耐药基因对生物处理系统的风险提供理论依据。方法向正常运行的颗粒污泥序批式反应器(GSBR)中投加携带多重耐药质粒RP4的E.coli K12(RP4),监测GSBR氨氮去除效率,利用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和实时荧光定量PCR技术对不同粒径颗粒污泥中氨氧化细菌的菌群结构和丰度进行分析比较,以探讨多重耐药菌对氨氧化细菌的影响。结果接种E.coli K12(RP4)后,GSBR氨氮去除率从94.7%降低至32.8%,恢复12 d后,去除率达95%以上。颗粒污泥中,粒径越大,氨氧化细菌菌群结构越稳定。在各粒径污泥中,亚硝化单孢菌均占据优势地位,是降解氨氮的主要菌群。反应初期,氨氧化细菌的丰度并未因E.coli K12(RP4)的投加而发生较大变化,直至运行后期絮状污泥和小粒径颗粒污泥新生氨氧化细菌丰度呈现明显上升趋势,其与氨氮去除效果恢复呈现相关性。结论耐药菌E.coli K12(RP4)影响了氨氧化细菌的代谢活性,从而导致污水生物处理系统硝化效果下降。     

霍乱弧菌含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体转染检测

[目的]研究霍乱毒素基因（ctx)在霍乱弧菌O1群埃尔托型，古典型菌株和O139群菌株之间的传递现象。了解含编码霍乱毒素基因的溶源性噬力体（CTXφ）和ctx基因转移中的作用。[方法]从人工构建的供体菌中诱导出带有标记的CTXφ并转染至受体菌，用PCR扩增和Southern杂交等方法检测受体菌，转染子及其质粒的目的基因片段。[结果]从受体菌O395、569B（古典型）和80071（埃尔托型）的转染子中均检出带有供体菌标记的质粒，PCR和Southern杂交结果表明这些质粒是CTXφ的形式。[结论]ctx基因能通过CTXφ在不同霍乱弧菌间进行传递。     

K1和K2血清型肺炎克雷伯菌耐药性与可移动遗传元件研究

目的分析K1型肺炎克雷伯菌和K2型肺炎克雷伯菌的耐药基因和可移动遗传元件的分布。方法收集南昌大学第一附属医院2015年1月-2017年12月分离735株非重复肺炎克雷伯菌作为实验菌株,筛选出63株K1型肺炎克雷伯菌和29株K2型肺炎克雷伯菌,进行药物敏感性分析,PCR检测13种耐药基因和13种可移动遗传元件标记。结果 K1、K2血清型肺炎克雷伯菌对头孢唑林和头孢曲松耐药率较高,>20%,对其他抗菌药物都表现较高的敏感性,但出现耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯菌;K1、K2血清型肺炎克雷伯菌acc6-Ib-cr和qnrS携带率较高,对其他耐药基因的携带率较低,但出现2株K1型和2株K2型携带KPC基因;除厄他培南和SHV基因外,K1型和K2型肺炎克雷伯菌对其它抗菌药物的耐药率和耐药基因的携带率差异无统计学意义,但K1型肺炎克雷伯菌对大部分抗菌药物的耐药率和耐药基因的携带率均低于K2型肺炎克雷伯菌;可移动遗传元件检出1种接合性质粒标记基因,1种整合子标记基因,4种插入序列标记基因,以traC基因和intI1基因阳性率最高。结论 K1、K2血清型肺炎克雷伯菌对大部分抗菌药物敏感性较高,耐药基因阳性率低,可移动遗传元件携带率较低;K1型和K2型高毒力肺炎克雷伯菌耐药表型的出现可能与携带可移动遗传元件相关。     

肺炎克雷伯菌质粒编码的AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶的表型和基因型分析

目的研究肺炎克雷伯菌质粒编码的AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的表型和基因型。方法利用3-氨基苯酚硼酸及ESBLs确认试验检测AmpC酶与ESBLs表型,接合转移试验了解质粒在细菌间的传递;通过质粒的提取、纯化,PCR反应及序列分析,研究肺炎克雷伯菌质粒携带的ampC基因和ESBLs基因类型。结果从肺炎克雷伯菌中获得1条约15 kb大小的质粒,此质粒可通过接合转移方式将耐药性传递至大肠埃希菌,以从肺炎克雷伯菌及接合转移后的接合子细菌中,提取的质粒为模板,均可扩增出DHA型ampC基因及SHV型ESBLs基因,序列分析进一步证实ampC及ESBLs基因型分别为DHA-1型及SHV-12型。结论从肺炎克雷伯菌可转移的质粒中,检测到DHA-1型ampC基因及SHV-12型ESBLs基因。     

产NDM-l肺炎克雷伯菌引起的新生儿感染及其同源性检测

目的调查对碳青霉烯酶类抗菌药物耐药肺炎克雷伯菌的分子机制及其同源性,为新生儿感染的预防和监测提供参考依据。方法 5株肺炎克雷伯菌分离自2015年1-2月新生儿病房患儿吸痰标本;用法国生物梅里埃公司VITEK-2Compact系统对细菌进行鉴定和药敏;菌株产碳青霉烯酶的筛选是采用改良Hodge和金属酶试验;PCR和产物测序法检测以及确认菌株携带的超广谱β-内酰胺酶、AmpC酶和碳青霉烯酶耐药基因;脉冲场凝胶电泳分析细菌的同源性;质粒接合试验分析质粒的特性。结果除了氨曲南以外,5株肺炎克雷伯菌对二、三代头孢菌素和碳青霉烯类抗菌药物均耐药,且Hodge试验和金属酶试验均呈现阳性;每一株菌均携带blaNDM-1、blaCMY-6和blaDHA-1基因;脉冲场凝胶电泳显示5株菌的带型完全相同;质粒接合试验显示供体菌将携带blaNDM-1的质粒成功转移到受体菌。结论经检索,携带blaNDM-1、blaCMY-6和blaDHA-1基因的肺炎克雷伯菌在新生儿中的聚集流行为国际上首次报道,应加强医院感染的监测、预防和控制。     

肺炎克雷伯菌中CRISPR调控耐药机制及其分布特征与分离地点的关系

  目的  了解呼吸道标本肺炎克雷伯菌中成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）对耐药的调控机制,并分析其CRISPR分布特征与分离地点的关系。  方法  收集并提取120株肺炎克雷伯菌的基因组DNA,通过扩增CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated）系统相关基因CRISPR 1、CRISPR 2来确定CRISPR阳性菌株。CRISPR阳性菌株的耐药表型用BD Phoenix-100细菌鉴定仪进行检测,利用CRISPR Target寻找间隔序列同源噬菌体或质粒,并在Center for Genomic Epidemiology上查找同源质粒或噬菌体的耐药信息并检测间隔序列所在菌株的耐药基因,分析两者携带耐药基因的关系。采用CRISPR Finder分析CRISPR并运用多序列比对分析间隔序列的一致性。  结果  CRISPR1、CRISPR2阳性率分别为12.50%和13.33%;间隔序列同源质粒与其所在菌株均携带共同的耐药基因,且菌株的耐药表型与其携带的耐药基因高度符合;相同地点菌株的CRISPR分布具有极高相似性。  结论  肺炎克雷伯菌通过将外来质粒的耐药基因片段整合到菌株的基因组中实现对菌株耐药性的调控;CRISPR中间隔序列的分布与菌株分离地点密切相关,为临床治疗和感染控制工作提供理论依据。     

产KPC型碳青霉烯酶细菌的耐药基因研究

目的检测乌鲁木齐市地区两所综合型大型三级甲等医院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的KPC型耐药基因,分析耐碳青霉烯类的耐药机制。方法收集2014年8月-2015年5月45株对碳青霉烯类抗菌药物敏感性降低的肠杆菌科细菌;通过全自动细菌鉴定分析仪VITEK-2和MS筛选出耐亚胺培南或美罗培南或亚胺培南美罗培南同时耐药的肠杆菌科细菌,采用改良Hodge试验和聚合酶链反应(PCR)扩增检测细菌产KPC型碳青霉烯酶,对KPC酶阳性的菌株做质粒转移接合试验,并将质粒转移接合成功的菌株进行测序,分析其基因型别。结果针对碳青霉烯类抗菌药物耐药的45株菌,用改良的Hodge试验23株阳性,有26株经PCR基因扩增后的产物经DNA基因测序后,比对结果为KPC-2型碳青霉烯酶,质粒转移接合试验有9株转移成功;测序结果均为KPC-2型碳青霉烯酶。结论乌鲁木齐两所综合型医院耐碳青霉烯类的抗菌药物肠杆菌科细菌耐药机制主要携带KPC-2型碳青霉烯酶耐药基因,临床与实验室应给予重视。