ES细胞源表皮样干细胞与胶原海绵体外构建组织工程化皮肤

【目的】 探讨以ES细胞源表皮样干细胞构建组织工程皮肤的方法，为构建新的组织工程皮肤奠定基础。【方法】 先把成纤维细胞放置于胶原海绵真皮支架内，体外培养2d，再放置ES细胞源表皮样干细胞，体外培养3d，观察其形态和进行免疫组化检测。【结果】 成纤维细胞与ES细胞源表皮样干细胞均在真皮支架内黏附，免疫组化表明ES细胞源表皮样干细胞仍呈Bl整合素强阳性和CK15、CK19阳性。【结论】 结果提示ES细胞源表皮样干细胞在体外构建的组织工程化皮肤内仍维持未分化状态。     

含转表皮细胞生长因子基因人表皮细胞复合皮的构建与移植

目的探讨转染表皮细胞生长因子(EGF)基因的人表皮细胞移植后EGF的表达及对细胞增殖的影响。方法将Balb/c小鼠的表皮细胞和转染EGF基因的人表皮细胞按1∶1、1∶3、1∶5的比例混合,种植于脱细胞真皮替代物表面,于体外培养后形成复合皮,将复合皮移植于Balb/c小鼠全层皮肤缺损创面,抗EGF抗体免疫组织化学染色观察移植后EGF的表达,抗增殖性细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色观察表皮细胞的增殖情况。结果小鼠表皮细胞与转EGF基因的人表皮细胞按1∶5混合构建的复合皮移植后1～2周,抗EGF染色阳性,1周时,新生表皮基底层中PCNA阳性细胞比含单纯小鼠表皮细胞的复合皮移植后显著增多(P<0.01)。结论转染EGF基因的人表皮细胞在移植后早期可表达外源基因产物,并促进表皮细胞增殖。     

ES细胞源表皮样干细胞与胶原海绵体外构建组织工程化皮肤

 【目的】 探讨以ES细胞源表皮样干细胞构建组织工程皮肤的方法，为构建新的组织工程皮肤奠定基础。【方法】 先把成纤维细胞放置于胶原海绵真皮支架内，体外培养2d，再放置ES细胞源表皮样干细胞，体外培养3d，观察其形态和进行免疫组化检测。【结果】 成纤维细胞与ES细胞源表皮样干细胞均在真皮支架内黏附，免疫组化表明ES细胞源表皮样干细胞仍呈Bl整合素强阳性和CK15、CK19阳性。【结论】 结果提示ES细胞源表皮样干细胞在体外构建的组织工程化皮肤内仍维持未分化状态。     

混合培养自体与异体表皮细胞的移植方法

将2．7－二氧二氢荧光深外标记L－929小鼠成纤维细胞膜表面．用ACAS570测定细胞内自由基的含量，以对钛涂层317L不锈钢材料的细胞毒性进行实验研究．结果：钛涂层317L不锈钢材料和纯钛材料接触培养的L－929小鼠成纤维细胞内荧光含量较低，显示细胞内自由基含量较低，317L不锈钢材料组的荧光含量较高，与前两组比较均有显著性差异（P＜0.01）．上述结果表明钛涂层317L不锈钢材料的细胞毒性远低于317L不锈钢材料．与纯钛材料相似，作为口腔种植材料是安全的．     

ES细胞源性表皮干细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤

【目的】以胚胎干细胞（ES细胞）源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤，探讨其对皮肤缺损修复的作用。【方法】胎鼠皮肤成纤维细胞与胶原海绵构建类真皮，植入小鼠全层皮肤缺损创面。以生物膜为载体，把羊膜诱导后带有核标记的ES细胞源性表皮干细胞覆盖在类真皮上，术后1～8周连续取材，HE染色，B1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。【结果】植入后3周，创面完全长合。较厚新生皮完全覆盖创面，基底层细胞增生，形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层，新生表皮中可见核标记的细胞呈B1整合素、CK15、CK19阳性，真皮中的管腔样结构呈核荧光和β1整合素、CEA免疫组化双标阳性，4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性，新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。【结论】ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建的组织工程皮肤可以修复缺损皮肤，在其下真皮层有分化为毛囊样、皮脂腺样和汗腺样的结构，但是是否来源于ES细胞源性表皮干细胞仍需进一步证实。     

应用胶原膜作底物培养人表皮细胞和移植的初步报告

本文介绍猪皮真皮胶原的分离和提纯。将胶原涂在F46膜上,培养人的表皮细胞获得成功。把培养5～13d的表皮细胞片自体移值,5例小面积成功。移植区活组织检查有新生的表皮屋。胶原可促进表皮细胞生长和连片,与对照组比较P<0.001。由于表皮片有胶原膜和F_(46)膜作底物,移植时从平皿中取出容易,不需要DispaseⅡ酶分离,反贴在切痂后2～5d或新鲜的肉芽创面。     

组织工程化表皮培养与移植

自体表皮细胞培养与移植技术 ,为大面积深度烧伤、皮肤缺损、慢性皮肤溃疡等患者的临床治疗提供了新思路。然而 ,表皮细胞培养周期长 ,临床应用的可操作性差 ,而且表皮细胞膜片移植因缺乏真皮层 ,创面愈合后外观与功能均不理想。随着组织工程的发展 ,目前逐渐开始应用混合表皮细胞、转基因表皮细胞培养技术 ,并利用真皮支架作为载体 ,种植表皮细胞经培养后移植。1　自体表皮细胞培养与移植早在 2 0世纪 80年代 ,O ,Connor等首次将培养的人自体表皮细胞用于覆盖创面。此技术只需取小片皮肤标本 (4～ 8cm2 )分离表皮细胞 ,培养 3～ 4周后 ,理…     

ES细胞源性表皮干细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤

【目的】以胚胎干细胞(ES细胞)源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建组织工程皮肤,探讨其对皮肤缺损修复的作用。【方法】胎鼠皮肤成纤维细胞与胶原海绵构建类真皮,植入小鼠全层皮肤缺损创面,以生物膜为载体,把羊膜诱导后带有核标记的ES细胞源性表皮干细胞覆盖在类真皮上,术后1～8周连续取材,HE染色,β1整合素、CK15、CK19、CK10和CEA免疫荧光双标和免疫组化观察。【结果】植入后3周,创面完全长合,较厚新生皮完全覆盖创面,基底层细胞增生,形成许多大小不一的细胞柱伸向真皮层,新生表皮中可见核标记的细胞呈β1整合素、CK15、CK19阳性,真皮中的管腔样结构呈核荧光和β1整合素、CEA免疫组化双标阳性,4～8周新生表皮基底层细胞呈CK19、CK10阳性,新生表皮下可见毛囊样、皮脂腺样结构。【结论】ES细胞源性表皮干细胞为种子细胞与胶原海绵构建的组织工程皮肤可以修复缺损皮肤,在其下真皮层有分化为毛囊样、皮脂腺样和汗腺样的结构,但是是否来源于ES细胞源性表皮干细胞仍需进一步证实。     

自体表皮细胞悬液移植治疗白癜风

目的 研究自体表皮细胞悬液移植治疗白癜风的疗效。方法 用负压吸疱的方法,取正常皮肤的表皮,胰酶消化后,涂布于用磨削术去掉表皮的白斑区。结果 30例患者移植后均有不同程度色素恢复,17例取得较为满意疗效,治疗3个月后色素恢复率大于80％。结论 自体表皮细胞悬液移植治疗白癜风有较好的治疗效果,操作简便,适应于较大面积稳定期白癜风患者的治疗。     

人表皮细胞在牛胶原膜粘附、生长及分化的研究

目的在牛胶原膜中植入胎儿表皮细胞和成纤维细胞，构建人工复合皮替代物，以研究细胞的粘附、生长、分化及真表皮间的相互作用。方法(1)酶消化法培养胎儿表皮细胞和成纤维细胞；(2)制备人工复合皮，接种表皮细胞后于不同时间通过HE染色和扫描电镜观察细胞的形态和数量变化；(3)透射电镜观察该复合皮中细胞的结构；(4)裸鼠移植试验验证该复合皮的作用。结果(1)该人工复合皮具有一定的弹性，可出现较明显的细胞增殖，未见人工复合皮收缩现象。(2)HE染色和扫描电镜下可见随培养时间的延长，成纤维细胞和表皮细胞逐渐增多，表皮细胞可发生分化。并逐渐分层。(3)透射电镜下见成纤维细胞和表皮细胞功能活跃。(4)裸鼠移植试验证实该人工皮可起到覆盖创面防止感染的作用。结论该人工复合皮基本具备了正常皮肤的结构和功能，可作为移植物覆盖全层皮肤损伤。     

大鼠胎脑神经细胞与几丁质多孔体、胶原蛋白海绵及明胶海绵生物相容性的实验研究

目的 评价大鼠胎脑神经细胞与几丁质多孔体、胶原蛋白海绵及明胶海绵的细胞相容性，为中枢神经组织工程材料的选择提供实验依据。方法 将大鼠胎脑神经细胞分别与几丁质多孔体、胶原蛋白海绵及明胶海绵联合体外培养，进行光、电镜观察，并测定3种材料与细胞的吸附率。结果 神经细胞均能在3种材料上贴附并生长，细胞吸附率分别为31．54％、30．58％和15．54％，并且几丁质有促进细胞生长的作用。结论 几丁质、胶原蛋白及明胶3种材料，尤其是几丁质，具有良好的神经细胞相容性，有可能作为神经系统组织工程的载体应用于临床。     

I 型胶原支架材料与人脂肪干细胞体外生物相容性研究

目的观察人脂肪干细胞与I型胶原支架材料的生物相容性,为脂肪组织工程选择适宜的种子细胞载体。方法将人脂肪干细胞与I型胶原支架体外培养复合,采用倒置相差显微镜和扫描电镜,观察细胞在支架上黏附、生长及增殖情况并计算细胞黏附率,XTT比色法检测细胞增殖率。结果脂肪干细胞能良好的在支架上黏附、生长和增殖。结论I型胶原支架材料具有良好的细胞相容性,可作为脂肪组织工程的种子细胞载体。     

海绵状胶原膜制备真皮支架及其生物活性研究

目的:制备海绵状胶原膜,探讨其作为真皮支架的可行性.方法:酸溶法提取猪皮胶原,冻干成膜.将胶原膜包埋于SD大鼠皮下,定期活检以检测其组织相容性、血管化能力及降解速度.结果:制备的胶原膜具有密集的相互贯通的微孔结构,且具有一定的强度与韧性,适于手术操作.SD大鼠皮下埋藏试验表明组织相容性较好,无急性炎症反应,血管化能力较强,降解速度慢,真皮构架稳定性好.结论:海绵状胶原膜可作为真皮支架移植于创面.     

生物反应器内再造组织工程化心肌的实验研究

目的：在体外模拟以微策略条件下构建心肌细胞-胶原复合体,探索组织工程化心肌组织体外再造的可行性。方法：采用顺序消化及差速贴壁法从1-2d龄新生大鼠的心肌组织中分离心肌细胞,并将其与多孔胶原复合形成复合体。复合体在旋转生物反应器（rotary cell culture system,RCCS）中进行培养,观测复合体内心肌细胞的生长状况、超微结构、细胞代谢率及细胞组分的变化,并将其与正常心肌和常规培养的复合体进行比较。结果：在RCCS中培养的复合体内的细胞具有心肌细胞的特殊超微结构,免疫组化显示其中的α-横纹肌肌动蛋白染色呈强阳性,与静止培养的复合体细胞相比,细胞代谢更加旺盛。结论：采用组织工程技术可以在RCCS中培育出组织工程化心肌组织。     

瘢痕疙瘩组织中胶原合成情况的研究

目的 探讨瘢痕疙瘩中胶原过度积累的形成原因。方法 用透射电镜观察瘢痕疙瘩的超微结构。用ABC法免疫组化检测瘢痕疙瘩中新合成的胶原。用地高辛标记的人Ⅰ型前胶原al(Ⅰ）cDNA探针与从瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中提取RNA进行斑点杂交。结果 在超微结构上,多数瘢痕疙瘩成纤维细胞拥有丰富的高度发达的粗面内质网。斑点杂交结果显示瘢痕疙瘩组织中Ⅰ型胶原mRNA水平升高。免疫组化染色显示瘢痕疙瘩中成纤维细胞有丰富的Ⅰ型前胶原表达。结论 在活跃增生的瘢痕疙瘩中,成纤维细胞胶原合成功能处于活化状态,胶原合成增加是瘢痕疙瘩中胶原过度积聚的重要原因。     

地塞米松联合医用胶原蛋白海绵在鼻内镜手术后复查中的应用

目的探讨地塞米松联合医用胶原蛋白海绵对鼻内镜手术后术腔上皮化的影响。方法将符合人选标准的功能性鼻内镜鼻窦手术术后患者92例,随机分为激素及医用胶原蛋白干扰组（50例）和单纯明胶海绵处理对照组（42例）,术腔均进行分离粘连、吸破囊泡、鼻动力系统切除息肉等处理,干扰组术腔行地塞米松联合医用胶原蛋白海绵填塞,对照组术腔行明胶海绵填塞。根据术区恢复情况制定个性化定期复查,随诊6月。结果干扰组：完全上皮化43例（86％）,部分上皮化5例（10％）,无效2例（4％）。对照组：完全上皮化30例（71．4％）,部分上皮化7例（16．7％）,无效5例（11．9％）,干扰组完全上皮化高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。两组部分上皮化比较无统计学意义（P〉0．05）。每次复查平均用时：干扰组（6．1±2．2）min,对照组（16．4±2．5）min,差异有统计学意义（P〈0．05）。完全上皮化病例复查次数：干扰组（4．3±0．2）次,对照组（7．8±0．8）次,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论地塞米松联合医用胶原蛋白海绵应用于功能性鼻内镜鼻窦手术术后术腔,可减少鼻腔粘连、出血、囊泡及息肉复发,减轻黏膜炎性反应和水肿,促进术腔上皮化,明显缩短治愈慢性鼻窦炎的疗程,值得临床上推广运用。     

兔膀胱移行上皮细胞构建组织工程尿道的初步研究

目的 探索以膀胱移行上皮细胞为种子细胞构建组织工程尿道的可行性。方法 取兔膀胱移行上皮细胞，体外培养传代后作为种子细胞与自制胶原膜体外联合培养并行裸鼠体内移植，通过对复合物扫描电镜、HE染色及角蛋白免疫组化检测，了解细胞在材料上的生长情况。结果 2h后移行上皮细胞在胶原膜上贴附生长，复合物移植体内20d后，移行上皮细胞分化成层，层厚1～5层。结论 该方法获取的膀胱移行上皮细胞是构建组织工程尿道的良好种子细胞，与胶原膜构建的复合物在体内形成了尿道类似物，有望成为替代尿道的组织工程材料。     

多孔纳米羟基磷灰石/胶原复合材料的制备及性能

目的：探讨多孔纳米羟基磷灰石/胶原复合材料（NHAC）简单有效的复合方法和结构及其作为新型骨替代材料应用于组织工程的可行性。方法：以氢氧化钙和磷酸为原料合成多孔纳米羟基磷灰石晶体,从牛肌腱中提取可溶性I型胶原,应用戊二醛交联冻干法使二者复合制备成生物膜,用XRD和扫描电镜,对材料晶相组成、微观形貌、结构、晶粒大小进行分析。 结果：通过对合成工艺研究,制得的生物膜呈三维网孔状结构,孔径10～40 μm,大小均匀,由纳米尺度（10 nm×50 nm~20 nm×80 nm）的羟基磷灰石和胶原纤维组成。复合材料在晶相组成和尺寸上类似于天然骨。结论：NHAC复合材料有望成为理想的骨替代材料。     

大鼠成骨细胞与TCP/HA支架材料复合培养的实验研究

目的　为开展骨组织工程研究 ,建立成骨细胞与支架材料的体外复合培养模型。方法　取SD新生大鼠颅骨 ,组织块法培养成骨细胞 ,形态学结合免疫细胞化学鉴定其生物学特征 ,矿化液诱导后 ,茜素红染色显示钙结节形成 ;以磷酸三钙 /羟基磷灰石 (tricalcium phosphate/hydroxyapatite,TCP/HA)为支架 ,相差显微镜下观察纤粘连蛋白对细胞在支架材料上粘附的影响。结果　培养的成骨细胞呈短梭形或多角形 ,抗碱性磷酸酶单抗染色阳性 ;矿化液诱导后 2 0d茜素红染色 ,见红色着色的钙结节 ;纤粘连蛋白能促进成骨细胞在TCP/HA支架上的粘附。结论　本实验成功地建立体外成骨细胞培养方法 ,细胞外基质活性分子的加入能促进细胞与支架材料的粘附。     

体外诱导骨髓间充质干细胞构建纤维蛋白胶软骨模块

目的:探讨体外构建骨髓间充质干细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程软骨模块的可行性。方法:分离兔骨髓间充质干细胞,种植在改良纤维蛋白胶支架内。实验组培养液中加入TGF-β1和BMP-6,对照组未加入诱导因子。体外进行形态组织学观察。1、2、3和4周取材作Masson染色、Ⅱ型胶原染色和扫描电镜观察。结果:细胞在支架上贴附,增殖。实验组中Masson染色可见胞浆及细胞周围有胶原形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论:TGF-β1和BMP-6可诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化,在改良纤维蛋白胶支架内体外成功构建组织工程软骨模块。