EYA4基因在结直肠癌中的甲基化状态及其意义

背景：EYA4（eyes absent4）是一种非巯基蛋白酪氨酸磷酸酶,参与器官发育、细胞凋亡调控、先天性免疫、DNA损伤修复、血管生成等过程。目的：研究EYA4基因在结直肠癌中的甲基化状态及其意义。方法：选取2006年6月～2007年1月上海交通大学医学院附属仁济医院31例结直肠癌患者,采集其癌组织和相应癌旁非癌组织。以5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza—dC）处理人结肠癌细胞株HT29、HCT116、SW480、SW1116。应用MSP技术检测结直肠癌组织、癌旁非癌组织、HT29、HCT116、SW480、SW1116细胞中EYA4基因启动子的甲基化状态。分析结直肠癌患者临床病理特征与EYA4基因甲基化关系。采用RT—PCR和蛋白质印迹法分别检测结肠癌细胞株中EYA4基因和蛋白的表达水平。结果：结直肠癌组织EYA4基因启动子甲基化率显著高于癌旁组织（77．4％对6．5％,P〈0．01）。EYA4基因和蛋白在启动子甲基化的HT29、HCT116、SW480细胞中不表达,在启动子非甲基化的SW1116细胞中显著表达。以5-Aza—dC处理后EYA4基因和蛋白在LIT29和SW480细胞中表达上调。结论：EYA4基因是结直肠癌发生的甲基化相关基因,有望成为结直肠癌的诊断标记物。     

人胰腺癌细胞株MUC2基因启动子区甲基化状态检测和分析

近年表观遗传学修饰方式之-的DNA甲基化成为肿瘤研究的热点。目前已发现胰腺癌中存在MUC2表达异常。目的：探讨人胰腺癌细胞株MUC2表达与其基因启动子区甲基化的关系，以了解胰腺癌的发生机制。方法：以人胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3、CFPAC-1、PANC-1、SW1990和PaTu8988s为研究对象，以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学方法检测去甲基化制剂DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理前后各胰腺癌细胞株MUC2 mRNA／蛋白表达的变化，以甲基化特异性PCR（MSP）结合测序检测MUC2基因启动子区CpG岛甲基化状态。结果：5-Aza-CdR处理前．胰腺癌细胞株AsPC．1、CFPAC-1和SW1990无MUC2mRNA／蛋白表达或低表达：经5-Aza-CdR处理后，MUC2mRNA／蛋白重新表达。MSP结合测序显示上述胰腺癌细胞株MUC2基因启动子区CpG岛存在高甲基化。结论：人胰腺癌细胞株MUC2表达抑制与其基因启动子区CpG岛高甲基化相关。MUC2基因启动子区CpG岛高甲基化可能在胰腺癌的发生、发展中起-定作用。     

启动子区甲基化和组蛋白乙酰化对人食管鳞癌细胞SFRP1基因表达的影响

目的探讨食管鳞癌(ESCC)细胞株中分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)1基因表达与启动子区甲基化和乙酰化的关系。方法采用RT-PCR方法检测SFRP1 mRNA表达,并用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测SFRP1基因启动子区甲基化状态,检测5-氮杂脱氧胞苷(DAC)及曲古抑菌素(TSA)对SFRP1基因核酸表达情况的影响。染色质免疫共沉淀方法检测SFRP1基因启动子区域组蛋白乙酰化状态。结果 ESCC细胞株的甲基化率高于正常细胞株。应用DAC及TSA联合处理ESCC细胞株可恢复SFRP1mRNA表达。ESCC细胞株中SFRP1基因启动子区域存在乙酰化组蛋白H3、H4。结论 ESCC细胞株中存在SFRP1基因高甲基化及组蛋白乙酰化。启动子区甲基化和组蛋白乙酰化可能是SFRP1基因表达沉默的主要原因。     

IRX1在胰腺癌中的表达及其启动子区甲基化状态

目的 检测胰腺癌的易洛魁族同源盒基因(IRX1)的表达及其启动子区的甲基化状态,探讨两者间的相关性.方法 采用实时PCR法检测12例胰腺癌组织及6株胰腺癌细胞株的IRX1 mRNA 表达.基因序列分析IRX1基因启动子区结构.应用甲基化抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理胰腺癌细胞,采用甲基化特异性PCR(MSP)、非甲基化特异性PCR (USP)及实时PCR检测处理前后IRX1启动子甲基化状态和IRX1 mRNA表达.结果 胰腺癌组织IRX1 mRNA的表达量为0.31±0.11,显著低于癌旁正常胰腺组织的1.05±0.32(P ＜0.01).胰腺癌细胞AsPCl、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990的IRX1 mRNA表达量分别为0.36±0.08、0.34±0.16、0.37±0.11、0.25±0.06、0.31±0.04、0.36±0.02,均显著低于人肾上皮293细胞的1.03±0.28(P＜0.05或＜0.01).IRX1基因启动子区富含CpG岛.各胰腺癌细胞株IRX1基因启动子CpG岛对应位点均有甲基化,经5-Aza-dC处理后甲基化状态得以逆转,IRX mRNA的表达也得以恢复.结论 胰腺癌的IRX1 mRNA表达下降,与其IRX1基因启动子区CpG岛高甲基化状态相关.     

维生素D受体在结直肠癌中的表达及其调控机制

背景:维生素D受体(VDR)属于类固醇激素受体超家族,参与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫应答等多种生物学过程,在多种恶性肿瘤中呈低表达。目的:探讨VDR在结直肠癌中的表达及其调控机制。方法:收集2010年2月-2012年12月上海交通大学医学院附属仁济医院收治的结直肠癌患者30例,以免疫组化法检测癌组织和相应癌旁非癌组织标本的VDR表达情况。从基因表达汇编(GEO)数据库中提取224例结直肠癌患者的临床资料,分析其癌组织VDR表达与患者临床病理特征和生存期的关系。采用组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶EZH2-siRNA或5-氮杂胞嘧啶核苷(5-AZA)处理人结肠癌细胞株HCT116和SW620,以实时PCR检测VDR表达水平,以甲基化特异性PCR(MSP)检测VDR启动子区甲基化水平。结果:结直肠癌患者癌组织VDR阳性表达率显著低于癌旁非癌组织(26.7%对70.0%,P0.001)。结直肠癌组织VDR表达与肿瘤组织学分期、远处转移、脉管转移、淋巴结转移呈负相关(P0.05);VDR高表达者生存期显著长于低表达者(P=0.032)。与转染对照-siRNA相比,HCT116、SW620细胞转染EZH2-siRNA后,EZH2 mRNA表达水平和VDR启动子区甲基化水平均显著降低(P0.05),VDR mRNA表达水平显著升高(P0.05)。5-AZA处理HCT116、SW620细胞后,VDR启动子区甲基化水平较阴性对照组显著降低(P0.05),VDR mRNA表达水平显著升高(P0.05)。结论:结直肠癌中VDR表达下调且与患者预后呈正相关。VDR在结直肠癌中的转录抑制受组蛋白甲基化和DNA甲基化共同调控。     

胰腺癌细胞株原钙黏附蛋白8基因的甲基化状态

目的 分析原钙黏附蛋白8(protocadherin 8,PCDH8)基因在胰腺癌细胞株的甲基化状态.方法 抽提6株胰腺癌细胞株PANC1、ASPC1、BxPC3、CFPAC、PaTu8988、SW1990和2例正常胰腺组织的总RNA,以甲基化特异性PCR(MSP)法检测PCDH8甲基化情况.应用DNA甲基化转移酶(DNMT)抑制剂5-氮杂2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理6株胰腺癌细胞株,采用实时定量PCR法检测处理前后细胞的PCDH8 mRNA表达.结果 2例正常胰腺组织PCDH8基因未发生甲基化,PANC1、BxPC3、CFPAC胰腺癌细胞株PCDH8基因部分甲基化,而PaTu8988、ASPC1、SW1990细胞完全甲基化.PCDH8mRNA在PANC1、SW1990、PaTu8988胰腺癌细胞株中有表达,表达的相对值(RQ)分别为1.576±0.648、0.013±0.008、0.002±0.001;BxPC3、CFPAC、ASPC1细胞株无PCDH8 mRNA表达.5-Aza-dC处理后,胰腺癌细胞株PANC1、ASPC1、BxPC3、CFPAC、PaTu8988、SW1990均有PCDH8 mRNA表达,表达量较处理前明显升高,相对表达量分别为7.463±2.628、10.696±1.539、7.852±2.762、421.815±1.493、118.595±4.089、6.690±1.884.结论 PCDH8基因启动子高甲基化是导致该基因在胰腺癌细胞株表达下降的主要原因之一.     

食管鳞癌细胞株金属硫蛋白3基因CpG岛超甲基化的临床意义

目的 探讨金属硫蛋白3(MT-3)基因CpG岛超甲基化与食管鳞状细胞癌的关系.方法选取TE-1、TE-13、TTN和ECA-109四种食管鳞癌细胞株,用甲基化特异性聚合酶链反应和逆转录聚合酶链反应技术,在5-氮2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理前后,对各细胞株的MT3基因CpG岛超甲基化及mRNA表达进行比较.结果 四种食管鳞状细胞癌细胞株的MT3基因均存在不同程度的CpG岛超甲基化.5-aza-CdR处理后超甲基化状态解除,mRNA表达明显提高(P均<0.05).结论 食管鳞状细胞癌细胞株中MT3基因CpG岛超甲基化可抑制其mR-NA表达:超甲基化解除后MT3基因的mRNA表达相应升高.     

实时荧光定量PCR和甲基化特异性PCR检测结直肠癌APC、MLH1基因甲基化状态

背景：启动子区甲基化致肿瘤抑制基因失活在结直肠癌的发生、发展中起重要作用,检测肿瘤相关基因的甲基化状态,可能为寻找新的结直肠癌诊断、预后相关标记物提供依据.目的：比较实时荧光定量PCR（FO-PCR）与甲基化特异性PCR（MSP）检测基因甲基化状态的差异.方法：以FQ-PCR检测66例结直肠癌组织和20例癌旁组织中与结直肠癌的发生、发展相关的抑癌基因APC和错配修复基因MLH1的甲基化状态,同时以MSP检测结直肠癌组织中APC基因的甲基化状态.结果：根据FQ-PCR结果,结直肠癌组织中APC、MLH1基因甲基化阳性率显著高于癌旁组织（48.5%和54.5%对0%和0%,P=0.000）.FQ-PCR和MSP可检出的甲基化阳性对照DNA最低浓度分别为0.015 ng/μl和1.5 ng/μl,两者对APC基因甲基化状态的检测结果差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：在DNA甲基化的检测手段中,FQ-PCR的敏感度优于MSP.     

TIP30基因启动子甲基化与大肠癌细胞5-氟尿嘧啶化疗敏感性的关系

目的探讨TIP30启动子CpG岛甲基化状态与大肠癌细胞对5-氟尿嘧啶(5-Fu)敏感性的关系。方法采用MTT法检测HCT116和HT29大肠癌细胞株对5-Fu的敏感性。应用甲基化特异性PCR(MSP)方法,检测2细胞株对5-Fu敏感性有差异的大肠癌细胞株中TIP30基因启动子CpG岛甲基化状态,并用RT-PCR检测其mRNA的表达水平。结果 TIP30基因在HCT116及HT29癌细胞中甲基化状态有差异,其表达水平与启动子CpG岛甲基化状态有关,并且二者对5-氟尿嘧啶敏感度不同。结论 TIP30基因启动子甲基化状态可能影响大肠癌细胞对化疗药物的敏感性,为大肠癌患者的个体化治疗提供了可能。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胰腺癌细胞PANC1的组织因子途径抑制物-2表达及CpG岛甲基化的影响

目的 探讨甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对胰腺癌细胞系PANCI的抑癌基因组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI-2)甲基化水平及基因表达的影响.方法 应用1×10-7、5 × 10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC处理胰腺癌细胞系PANCI.用甲基化特异性PCR(MSP)、RT-PCR及蛋白质印迹法检测细胞TFPI-2基因的甲基化状态、mRNA及蛋白的表达.结果 未经5-Aza-dC处理的PANCI细胞的TFPI-2基因CpG岛为完全甲基化,无TFPI-2 mRNA及蛋白的表达.1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC处理后,PANC1细胞的TFPI-2基因CpG岛甲基化逆转,从不完全甲基化到完全非甲基化;TFPI-2 mRNA相对表达量分别为0.211±0.087、0.327 ±0.068、0.609±0.017;TFPI-2蛋白相对表达量为0.429±0.121、0.675±0.044、1.132±O,124,呈剂量依赖性增加(P＜0.05).结论 胰腺癌细胞系PANC1的TFPI-2启动子高甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因.5 -Aza-dC能够逆转其高甲基化状态,并诱导TFPI-2 mRNA及蛋白重新表达.     

Hypermethylation and expression regulation of secreted frizzled-related protein genes in colorectal tumor

INTRODUCTION Secreted frizzled-related proteins (sFRPs) comprise a family of five secreted glycoproteins that antagonize Wnt canonical and noncanonical signaling by different mechanisms directly or indirectly[1]. Wnt signaling regulates cell growth, motil…     

Hypermethylation and aberrant expression of Wnt antagonist secreted frizzled-related protein 1 in gastric cancer

AIM： To identify the methylation of secreted frizzled-related protein 1 （SFRP1） in gastric cancer and to investigate the aberrant expression of SFRP1 and its correlation with the clinical pathological features of patients.
METHODS： We determined SFRP1 methylation and SFRP1 mRNA expression in 3 gastric cancer cell lines SGC-7901, BGC-823, HGC-27, from 52 primary gastric cancer specimens and matched tumor adjacent tissue specimens by methylation-specific （MSP） PCR and RT-PCR respectively. Fisher＇s exact test was used to analyze the statistical association between clinical pathological data and aberrant expression of SFRP1.
RESULTS： In 3 cancer cell lines, BGC-823 and HGC-27 had methylated SFRP1 and lost SFRP1 mRNA expression. After treatment of BGC-823 and HGC-27 with the demethylating agent, 5-aza-2′-deoxycytidine, SFRP1 was re-expressed. In 52 primary gastric cancer specimens and matched tumor adjacent tissue specimens, hypermethylation of SFRP1 was detected in 23 （44%） and 8 （15%） specimens respectively （x^2= 10.34, P 〈 0.01）. Loss of SFRP1 expression was detected in 17（33%） and 6 （12%） specimens respectively （x^2= 6.75, P 〈 0.01）. There was a significant correlation between SFRP1 hypermethylation and SFRP1 expression loss. SFRP1 expression was also correlated significantly with tumor stage and lymph node status, but not with patient sex, age and histological type.
CONCLUSION： SFRP1 inactivation is a common and early event caused mainly by hypermethylation in gastric cancer. SFRP1 expression loss may be correlated with tumor metastasis in primary gastric cancer.     

Silencing of secreted frizzled-related protein genes in MSI colorectal carcinogenesis

BACKGROUND/AIMS: The epigenetic pathway of colorectal carcinogenesis has recently become the focus of attention. The most common epigenetic change is the promoter hypermethylation of tumor suppressor genes. Secreted frizzled-related proteins have been identified and are reported to act as inhibitors of the Wnt signaling pathway. It has also been reported that microsatellite unstable cancers show more frequent hypermethylation in tumor suppressor genes and less frequent APC mutation. METHODOLOGY: Fifty-one sporadic colorectal cancers were investigated, of which 22 were MSI-H and 29 were MSI-L/MSS. Methylation-specific polymerase chain reaction was performed to detect the methylation status of SFRP1, 2 and 5 genes. RESULTS: All of the samples showed hypermethylation in the promoter region of SFRP1. MSI-H cancers showed more frequent hypermethylation in SFRP2 than MSI-L/MSS cancers, though there was no statistical significance. SFRP5 promoter hypermethylation was significantly more frequent in MSI-H cancers than in MSI-L/MSS cancers. CONCLUSIONS: SFRPs may act as an important inhibitor of the Wnt signaling pathway in MSI-H cancers.     

SFRP1基因启动子甲基化在胰腺癌患者血清中的检测及临床意义

目的研究分泌型卷曲相关蛋白1(secreted frizzled-related protein 1,SFRP1)基因启动子区异常甲基化与胰腺癌发生的相关性。方法选择胰腺癌患者22例为实验组,另选择健康体检者24名为对照组,提取外周血清DNA,利用甲基化特异性PCR法(MSP)检测SFRP1基因启动子区域甲基化状态。结果在22例胰腺癌患者中,7例存在SFRP1基因甲基化现象,甲基化阳性率为31.8%;而在24名健康体检者血清中仅1人检出SFRP1甲基化,甲基化阳性率为4.2%,两者差异有统计学意义(P0.05)。SFRP1基因甲基化与患者年龄、性别及血清CA19-9水平无相关性。联合检测血清SFRP1甲基化及CA19-9水平可显著提高胰腺癌检出率。结论血清SFRP1基因启动子区异常甲基化可能参与胰腺癌的发生,并为疾病的早期监测提供可能的分子理论依据。     

增殖诱导配体在大肠癌细胞株上的表达、定位及意义

目的了解增殖诱导配体（APRIL）在大肠癌细胞株上的表达、定位及意义。方法分别采用RT-PCR和Western Blotting技术检测APRIL在大肠癌细胞株SW620、LOVO、HCT116、HT29及SW480上的表达,同时采用ATP法检测这些大肠癌细胞株对5-FU的耐药性;以LOVO细胞为研究对象,用细胞免疫荧光技术分析APRIL蛋白的细胞定位情况。结果 RT-PCR和Western-blotting检测显示,APRIL在不同大肠癌细胞株中存在差异性表达,在LOVO、HCT116相对高表达,而在SW480、SW620、HT29相对低表达,其表达水平与5-FU耐药性呈正相关。激光共聚焦显微镜观察发现APRIL蛋白在LOVO细胞中主要定位于细胞浆,胞核中少见。结论 APRIL在大肠癌细胞株上有差异表达,其表达水平与大肠癌细胞株的5-FU耐药性有相关性。APRIL主要定位于胞浆。