Ⅳ型胶原快速黏附法体外分选人胎儿表皮干细胞

背景：发育生物学研究表明，表皮干细胞是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键性源泉，如何从皮肤组织中分离获得更多的表皮干细胞，并在体外培养过程中保持干细胞特性是其在皮肤组织工程中应用的重要前提。 目的：观察Ⅳ型胶原快速黏附法分选的人胎儿表皮干细胞体外生长状态及克隆形成情况，并与角质细胞进行对照。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2008-01/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。 材料：因创伤等原因致意外流产的妊娠24~26周龄胎儿皮肤标本，由南昌大学第一附属医院产科提供。Ⅳ型胶原为美国Sigma公司产品，角质细胞无血清培养基为美国Gibco公司产品。 方法：将Ⅳ型胶原用磷酸盐缓冲液稀释成100 mg/L，均匀涂被培养板后于超净工作台中风干备用。无菌条件下取胎儿皮肤标本，剪成3.0 mm×5.0 mm皮条片，4 ℃胰蛋白酶+EDTA联合消化8~10 h，表皮真皮分离，用角质细胞无血清培养基将表皮反复吹打，获得单细胞悬液接种于预处理好的Ⅳ型胶原培养板，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中，20 min后吸去培养液和未黏附细胞，加入含体积分数为0.1的胎牛血清、10 μg/L表皮生长因子及角质细胞无血清培养基的表皮干细胞培养液，细胞约70%~80%融合后传代扩增；将未黏附细胞接种于另一培养板中，相同条件下作为角质细胞对照培养。 主要观察指标：表皮干细胞的形态变化、免疫细胞化学染色鉴定结果及克隆形成率。 结果：经贴壁筛选的表皮干细胞接种后呈圆形，折光性较强；1 d后细胞略伸展为扁平的多角形，胞质近中央处有圆形核；3 d时出现表皮干细胞克隆；5 d时克隆数量明显增多，细胞之间紧密衔接，呈铺路石状；14 d 左右细胞基本融合。分离培养的人表皮干细胞克隆β1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。表皮干细胞克隆形成率明显高于角质细胞克隆形成率（t=1.972，P < 0.05）。 结论：采用Ⅳ型胶原快速黏附法成功筛选出纯度较高的人胎儿表皮干细胞，且呈明显克隆性生长，具有典型的干细胞生物学特性。     

羊膜负载表皮干细胞促进糖尿病大鼠创面的愈合

背景：表皮干细胞作为皮肤组织的特异性干细胞,具有强大增殖及多向分化潜能,与创面修复紧密相关。近期研究表明糖尿病皮肤创面愈合过程中表皮干细胞数量减少、活性降低是导致其创面难愈的重要原因。 目的：观察表皮干细胞在糖尿病大鼠创面愈合中的作用。 方法：分离培养及鉴定SD大鼠表皮干细胞,并以BrdU标记。建立糖尿病SD大鼠创面模型,抽签法随机分为3组：表皮干细胞组创面移植羊膜负载BrdU标记的表皮干细胞;羊膜组创面移植羊膜;空白对照组创面未给予干预。 观察创面愈合情况、计算创面愈合率,苏木精-伊红及免疫组织化学SP法检测创面愈合组织中BrdU及增殖细胞核抗原表达。用图像分析软件测量阳性细胞积分吸光度平均值。 结果与结论：表皮干细胞组治疗后7d创面缩小明显,治疗后14 d创面基本愈合,创面愈合率明显高于羊膜组、空白对照组 (P < 0.01)。表皮干细胞组创面及新生表皮中可见BrdU阳性细胞,而另两组皮肤创面组织中始终未见BrdU阳性细胞。各组创面组织中可见增殖细胞核抗原阳性细胞表达,但表皮干细胞组的阳性细胞积分吸光度平均值与羊膜组、空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)。结果证实糖尿病大鼠创面愈合过程中表皮干细胞与创缘表皮移行、创面的上皮化有直接关联,可有效促进其创面愈合。     

人表皮干细胞的体外分离和培养

背景：如何获得高纯度的表皮干细胞以及维持其干细胞表型和体外增殖特性，是目前表皮干细胞体外培养过程中急需解决的问题。 目的：建立人表皮干细胞体外分离和培养的技术方法。 设计、时间及地点：细胞观察，于2005-03/2006-05在南昌大学第一附属医院烧伤科完成。 材料：所用包皮来自2~12岁行包皮环切术的患者，患者无泌尿系统感染等疾病。 方法：取包皮皮片，采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞，Ⅳ型胶原快速黏附法富集分离表皮干细胞。收集处于指数生长期第二三代成纤维细胞的上清液，过滤后与角朊细胞无血清培养基等比例混合，并加入胎牛血清、表皮生长因子、牛垂体提取物等组成表皮干细胞培养液，用以人表皮干细胞的体外扩增培养，以角朊细胞作对照。 主要观察指标：传至第2代，通过平板克隆形成实验计算克隆形成率和克隆维持时间，采用免疫组织化学染色检测β1整合素和角蛋白19的表达。 结果：①与同一标本同一批次培养的角朊细胞相比，人表皮干细胞的克隆形成率明显升高，克隆维持时间延长（P < 0.01）。②表皮干细胞β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色均呈阳性。 结论：应用Ⅳ型胶原快速黏附法及人成纤维细胞条件培养基，对人表皮干细胞成功进行了体外分离和培养。     

1000/黄芪对人皮肤表皮干细胞增殖活性的影响

背景：利用干细胞技术修复创面是当前医学领域治疗伤口愈合的重要策略,黄芪具有扶正固本、益气活血、延缓衰老等作用,被广泛应用于临床各科多种病证的治疗。 目的：探讨黄芪对人皮肤表皮干细胞增殖活性的调控作用。 设计、时间及地点：细胞分子生物学实验,于2005-09/2008-06在南昌大学第一附属医院完成。 材料：烧伤整形患者植皮剩余皮片来源于南昌大学第一附属医院烧伤中心。黄芪注射液为正大青春宝药业有限公司产品,批号0207114,每毫升含黄芪甲苷≥1.0 mg,相当于含生药2 g。 方法：采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸联合消化法分离表皮,Ⅳ型胶原快速贴附法纯化培养人表皮干细胞。实验组以含黄芪、表皮生长因子和角质细胞无血清培养基组成的表皮干细胞培养液进行体外培养,对照组不含黄芪,其余培养条件相同。 主要观察指标：计算细胞克隆形成率,流式细胞仪测定细胞周期,免疫细胞化学染色法和图像定量分析法观察端粒酶反转录酶表达的变化。 结果：表皮干细胞呈贴壁生长,10 d左右有大的细胞克隆形成,实验组人表皮干细胞克隆形成率、G0/G1期细胞比例均明显高于对照组(t=3.17,P < 0.01;t=2.83,P < 0.05)。两组细胞端粒酶反转录酶均呈阳性表达,定量分析结果显示实验组平均吸光度值和阳性面积值均明显高于对照组(t=2.25,P < 0.05;t=4.12,P < 0.01)。 结论：黄芪可有效增强人皮肤表皮干细胞端粒酶反转录酶的表达和体外增殖活性。     

骨髓间充质干细胞在糖尿病创面中向皮肤腺上皮的分化***

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,目前已证实其在急性创面中能够向皮肤组织细胞转化,但在糖尿病创面中的分化报道甚少。 目的：观察糖尿病创面皮肤微环境中的骨髓间充质干细胞分化为皮肤附属器细胞的可行性。 方法：全骨髓法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第三四代细胞行5-BrdU标记。采用一次性腹腔注射链脲佐菌素法建立糖尿病大鼠模型,2周后在模型鼠背部制作圆形创面,取密度为1×109 L-1 5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞悬液1 mL注射于创面边缘,分别于细胞移植后2,3周切取创面中央再生组织制备切片,行BrdU和角蛋白免疫组织化学染色。 结果与结论：BrdU阳性细胞出现在表皮、真皮及皮下组织各层,部分阳性细胞位于皮脂腺及腺导管上皮中;连续切片中BrdU阳性细胞同时也表达角蛋白,以腺导管上皮多见。提示在糖尿病溃疡创面愈合过程中,骨髓间充质干细胞具有向皮肤附属器细胞分化的潜能。     

大鼠毛囊干细胞的体外分离培养及增强型绿色荧光蛋白示踪☆

目的：毛囊干细胞具有分化为表皮、皮脂腺和毛囊的能力，在烧伤、创伤及大面积皮肤缺损的细胞治疗和基因治疗等方面均有很好的应用前景，但其特异性标志物和体外培养条件等方面存在争议。实验拟进一步探讨毛囊干细胞体外分离培养的方法，以及增强型绿色荧光蛋白作为其示踪标志物的可行性。 方法：实验于2007-05/09在解放军第三军医大学细胞生物教研室完成。①材料：新生7 d龄SPF级SD大鼠5只，由解放军第三军医大学实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。pEGFP-N1质粒由本实验室保存。②实验方法：大鼠在体视显微镜下分离出含真皮鞘的完整毛囊，dispase消化，将毛囊从真皮鞘中挤出，收集形态完好且处于生长期的毛囊，分别在毛球部上端、皮脂腺下端横切毛囊，取中间部分置于胰酶和EDTA中联合消化，向所得细胞悬液中添加含10%胎牛血清DMEM/F12完全FAD培养基，常规培养7 d后，采用IV型胶原快速贴壁法两次筛选以分离纯化大鼠毛囊干细胞。待筛选后的细胞生长至70%~80%融合后，进行pEGFP-N1质粒细胞转染。③实验评估：通过超微结构观察与流式细胞仪检测CD34、α6-integrin的表达，对分离纯化的大鼠毛囊干细胞进行鉴定。转染24~72 h后，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，以毛囊干细胞克隆形成率判定标记细胞的增殖能力。 结果：①细胞形态及超微结构：筛选后的毛囊干细胞形态均一，呈铺路石状，透射电镜显示细胞胞体小，核浆比例大，核仁明显，细胞器发育不成熟，处于原始状态。②细胞表型：高表达CD34和α6-integrin，细胞阳性率≥ 90%。③pEGFP-N1质粒转染及示踪：转染16 h左右细胞出现微弱绿色荧光，经G418筛选后稳定表达绿色荧光蛋白。④细胞克隆形成率：与转染前比较，转染后细胞克隆形成率明显降低（t =4.541，P < 0.01）。 结论：①利用二步酶消化法联合IV型胶原快速贴壁法可以获得较高纯度的毛囊干细胞。②增强型绿色荧光蛋白能稳定标记毛囊干细胞，是较理想的示踪方法，但细胞增殖能力受一定影响。     

组织工程皮肤移植过程中白细胞介素10和肿瘤坏死因子α的表达

背景：白细胞介素10和肿瘤坏死因子α在异体异种皮肤移植局部免疫与排斥反应中发挥了重要作用。但在组织工程人工皮肤移植过程中局部皮肤组织内白细胞介素10和肿瘤坏死因子α的表达情况目前尚不清楚。 目的：采用表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤并移植修复兔全层皮肤缺损创面,观察创面修复效果和局部皮肤组织白介素10与肿瘤坏死因子α的表达变化。 方法：将体外培养的人表皮干细胞或角质细胞接种到脱细胞真皮支架中,构建组织工程人工皮肤;取新西兰白兔常规制作背部全层皮肤缺损创面随机分为4组,表皮干细胞组、角质细胞组用含表皮干细胞或角质细胞的组织工程皮肤移植于皮肤缺损创面;脱细胞真皮组移植单纯脱细胞真皮;对照组创面空置。观察创面修复情况,局部炎症反应,创面愈合时间。各组分别于术后7d在部分创面取材观察组织形态和白细胞介素10与肿瘤坏死因子α表达。 结果与结论：含表皮干细胞的人工皮肤移植后创面愈合良好,局部炎症反应轻微,无出血、积脓、坏死,创面愈合时间较角质细胞组明显缩短。白细胞介素10在各组均有表达,其中表皮干细胞组表达最强,角质细胞组次之,脱细胞真皮组和对照组最弱。肿瘤坏死因子α在各组也均有表达,其中角质细胞组表达最强,表皮干细胞组次之,脱细胞真皮组和对照组较弱。说明以表皮干细胞作为种子细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤可用有效促进皮肤缺损创面的修复治疗,创面修复过程中局部皮肤组织内白细胞介素10和肿瘤坏死因子的表达变化可能是其取得较好效果的主要机制之一。     

人阴道黏膜干细胞的筛选与培养

背景：目前国内外学者已经从人类或啮齿类等动物的皮肤、毛囊、角膜、口腔黏膜、肠道黏膜、牙齿断端、唾液腺等上皮组织中成功分离出干细胞，并应用于组织创伤修复的实验中，但人阴道黏膜干细胞的分离和应用的实验较少。 目的：探讨人阴道黏膜干细胞的分离、筛选与适合的体外培养方法。 设计：以细胞为对象的观察基础实验。 单位：广州医学院第三附属医院（原广州市第二人民医院）妇产科。 材料：实验于2004-10/2005-08在中山大学中山眼科中心实验室完成。实验室级别：卫生部眼科学重点实验室、广东省眼科视觉科学重点实验室、广东省教育厅眼科视觉科学重点实验室、广东省“五个一科教兴医工程”重点实验室。孕2周健康成年雌性昆明小鼠，由广州中医药大学实验动物中心提供。无细菌与病毒感染的患者的阴道黏膜标本5份，由广州医学院第三附属医院（原广州市第二人民医院）妇科提供。 方法：采用胰酶、胶原酶混合消化法获得阴道黏膜细胞。将丝裂酶素C处理的小鼠成纤维细胞作滋养层细胞。采用Ⅳ型胶原快速黏附法筛选人阴道黏膜干细胞，并采用免疫细胞化学方法鉴定。将所筛选的人阴道黏膜干细胞与原代人阴道黏膜细胞分别用采用碘化丙啶一步荧光染色法、流式细胞仪分别检测其细胞周期。以4组方法体外培养原代人阴道黏膜干细胞：滋养层细胞+上皮细胞完全培养液、滋养层细胞+DMEM/F12（3∶1）、无滋养层细胞+上皮细胞完全培养液、无滋养层细胞+DMEM/F12（3∶1）。培养至12 d，比较各组CK19、CK10阳性细胞比例、克隆形成率与凋亡前能传代的次数。 主要观察指标： ①所筛选的人阴道黏膜干细胞与原代人阴道黏膜细胞的G0/G1细胞比例、CK19、CK10阳性细胞的比例。②比较4种不同方法培养人阴道黏膜干细胞的CK19、CK10阳性的细胞比例、克隆形成率以及能传代的次数。 结果：所筛选的人阴道黏膜干细胞与原代人阴道黏膜细胞的G0/G1细胞比例、CK19、CK10阳性的细胞比例均有统计学差异（P < 0.05）。其中采用滋养层细胞+上皮细胞完全培养液培养人阴道黏膜干细胞12d，其克隆形成率与CK19阳性细胞比例最高，CK10阳性细胞比例最低，体外培养人阴道黏膜干细胞能稳定传15代以上。 结论：①Ⅳ型胶原快速黏附法可有效筛选人阴道黏膜干细胞。②滋养层细胞+上皮细胞完全培养液为体外培养原代人阴道黏膜干细胞的较佳方法。     

胚胎大鼠神经干细胞分离培养的实验研究

目的探讨胚胎大鼠神经干细胞的分离培养方法,并对其进行鉴定。方法从胚胎大鼠脑组织中分离神经干细胞,采用无血清培养技术,在生长因子的作用下使其在体外不断增殖克隆,同时利用免疫荧光染色的方法对培养的细胞进行鉴定。结果体外培养的细胞增殖成细胞克隆球并能稳定传代,经鉴定,均为nestin染色阳性细胞。结论利用无血清技术和特定生长因子,可以使来源于胚胎大鼠的神经干细胞在体外扩增并稳定传代。     

纳米仿生复合支架的生物相容性

背景：纳米材料构建具有生物活性的组织工程骨，可以很好的模仿体内细胞外基质的结构，有利于细胞黏附、生长。 目的：评价新型仿生壳聚糖/胶原纳米纤维支架与SD大鼠骨髓基质干细胞的体外相容性。 方法：分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞，流式细胞分析法对细胞表面抗原进行检测；相差显微镜观察细胞形态。聚电解质共凝聚技术制作仿生壳聚糖/胶原纳米纤维支架，取生长良好的P3代，与仿生壳聚糖/胶原纳米纤维支架体外联合诱导培养，通过细胞贴壁率、生长曲线、细胞活力、周期、细胞Ⅰ型胶原染色、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性。 结果与结论：骨髓基质干细胞可在体外分离扩增，表达CD29、CD44和CD106，不表达CD34和CD45，细胞形态为长梭形，仿生壳聚糖/胶原纳米纤维平均孔径为150 μm，与骨髓基质干细胞有较好的黏附性。提示骨髓基质干细胞可在体外长期、稳定培养；是理想的组织工程种子细胞；仿生壳聚糖/胶原纳米纤维与骨髓基质干细胞有良好的相容性，可用来做组织工程生物材料。