兔角膜缘干细胞两种培养方法的比较

目的对采用消化法和组织块法培养兔角膜缘干细胞进行对比,以期确定合理的角膜缘干细胞体外培养方法。方法采用3T3成纤维细胞滋养层培养体系,分别用消化法和组织块法培养兔角膜缘上皮细胞,用免疫组织化学技术检测培养的细胞中ΔNp63的表达。采用流式细胞技术分析分离的角膜缘上皮细胞悬液中间质细胞的含量,采用扫描电镜观察去除上皮的角膜缘基质表面。结果采用消化法培养,培养的细胞中ΔNp63表达较多,细胞最终可以分化为复层上皮结构。在分离的细胞悬液中,间质细胞含量小于5%,扫描电镜显示角膜缘上皮细胞能被完全消化。结论在角膜缘干细胞的培养中,在干细胞的含量方面,消化法培养要明显优于组织块法培养。     

体外培养不同代角膜缘干细胞特性分析

目的比较不同代角膜缘干细胞的生物学特性,为角膜缘细胞移植在临床中的氉应用提供依据。方法组织块培养法体外培养角膜缘干细胞,光镜观察、HE染色和免疫荧光染色分析原代、第1代和第2代角膜缘细胞形态学特性;流式细胞技术定量检测原代、第1代和第2代角膜缘细胞ABCG2表达;MTT比色法测定体外培养原代、第1代和第2代角膜缘干细胞的增殖活性变化。结果倒置相差显微镜下可见原代细胞培养24h有单个细胞从组织块边缘迁出,48h细胞局部可见拉网样生长趋势,72h出现大片细胞,细胞呈现多边形或多角形,96h细胞几乎铺满整个培养板。随着传代次数的增加,细胞形态变得不规则,CK3单克隆抗体表达阳性率逐渐增强;p63单克隆抗体原代和第1代细胞间表达阳性率无明显差别,第2代细胞表达量明显减弱。流式细胞检测显示原代、第1代和第2代细胞ABCG2表达阳性率分别为13.41%、22.96%和4.43%。MTT结果显示随传代次数增加细胞增殖活性逐渐下降。结论原代和第1代角膜缘干细胞可以作为制备组织工程角膜上皮细胞膜片的较理想种子细胞。     

兔角膜缘干细胞体外壳聚糖共混膜上培养的形态学观察

目的 探讨壳聚糖作为兔角膜缘干细胞体外培养载体的可行性。方法 应用消化培养法在壳聚糖材料上对兔角膜缘细胞进行原代培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，并在电子显微镜下观察壳聚糖的结构以及第7d时细胞的形态。结果 壳聚糖呈现三维多孔结构相互连接成网状，孔径直径大小约90μm，其上有细胞生长，7d左右形成单层次，9d后细胞培养开始出现老化现象。结论 壳聚糖上可成功地对兔角膜缘组织进行原代培养，可用作组织工程角膜的载体材料。     

结膜松弛症球结膜成纤维细胞的原代培养及形态学观察

目的：观察原代培养的结膜松弛症(CCH)球结膜成纤维细胞生长状况及形态变化,确定最佳传代时间以获得稳定、一致的CCH球结膜成纤维细胞。

方法：采用组织块贴壁法获得CCH原代球结膜成纤维细胞,胰蛋白酶差速消化法进行成纤维细胞纯化,倒置显微镜下观察并记录不同时期成纤维细胞的生长状况及形态变化,免疫荧光细胞化学染色行成纤维细胞鉴定。

结果：CCH结膜组织贴壁24h即可见少量细胞从组织块周围爬出,第2～7d为细胞生长对数期,细胞生长快、增殖旺盛,轮廓清晰,分布均匀,数目增多,细胞核清晰; 第9～15d细胞生长进入平台期,组织块逐渐老化失去活性,细胞增长缓慢,排列疏松,体积变大,形状扁平,细胞浆内见大量颗粒状物质和小泡产生,部分细胞从培养瓶底脱落,细胞之间出现较大空隙。传代纯化后细胞的大小、形态基本一致,经鉴定为成纤维细胞,呈长梭形、扁平星状或多突的纺锤形,中间宽大,有卵圆形细胞核,两头相对细小,伴向外伸出2～3个长短不一的细长突起。

结论：采用组织块贴壁法可成功获得原代CCH球结膜成纤维细胞,当细胞生长至第8d时行消化、传代可获得稳定、一致的CCH球结膜成纤维细胞。     

异种角膜基质材料的制备和体外细胞种植的实验研究

目的研究异种角膜基质生物支架材料的制备方法和体外种植兔角膜基质细胞后细胞在材料上的生长、增殖情况。方法将York猪全层角膜用去垢剂联合0．25％胰蛋白酶、DNA-RNA酶祛除猪角膜基质细胞并冻干制备成支架材料；将兔角膜组织块用胶原酶消化后，用含10％血清的DMEM培养液体外培养，并做波形丝蛋白，角蛋白免疫组织化学染色检测；将培养的兔角膜基质细胞的2～3代接种在材料上，培养5d后，做HE染色、扫描电镜观察。结果猪角膜基质片经脱细胞处理后，细胞成分祛除干净并保留了角膜组织的三维网格状结构，网状间隙明显增大，利于细胞生长；体外培养的兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色为阳性、角蛋白染色为阴性；HE染色、扫描电镜结果显示兔角膜基质细胞在支架材料上生长、增殖良好。结论异源性角膜经祛脱细胞处理而获得的生物支架材料利于异种细胞的黏附和增殖，可进一步用于组织工程角膜的研究。     

体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层克隆兔角膜缘干细胞

目的研究兔胚胎成纤维细胞体外克隆兔角膜缘干细胞。方法兔胚胎成纤维细胞经丝裂霉素C(MMC)处理成饲细胞,用消化法培养兔角膜缘基底层细胞并接种于含有经MMC处理饲细胞的12孔培养板,进行原代培养。观察其光镜特征、电镜结构,用间接免疫细胞化学染色等对克隆的细胞进行综合鉴别。结果克隆的细胞呈典型的上皮细胞形态,电镜下可见微绒毛、桥粒、张力丝等典型上皮细胞结构,单克隆抗体AE1、PCNA染色后细胞大多数阳性,单克隆抗体AE5染色后细胞染色偶见阳性。结论体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层成功地克隆出兔角膜缘干细胞。     

以干燥脱水法保存的异种角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织

目的:观察以干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织的生物学特性。方法:采用组织块培养法获得新西兰大白兔角膜缘干细胞,经胰蛋白酶消化法获得细胞,种植于干燥脱水法保存的鸵鸟角膜板层基质上,采用气液界面培养法进行培养,通过倒置显微镜、透射电子显微镜、荧光显微镜观察其形态学、生长特点,超微结构及免疫学特征。结果:在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质上种植兔角膜缘干细胞,接种72h后,细胞形成单层,移置气液交界面后继续培养7～10d,逐渐形成复层。经光镜、透射电镜、及免疫学检测显示其具有角膜上皮组织的生物学特性。结论:兔角膜缘干细胞能够在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质载体上生长,并可形成复层,基本具有正常角膜上皮细胞的形态、超微结构和生物学特性。     

超低温冷藏对体外培养兔角膜缘上皮细胞活性的影响

目的 分析超低温冷藏兔角膜缘上皮细胞活性变化.设计实验性研究.研究对象超低温冷藏兔角膜缘上皮单细胞悬浮液/兔角膜缘上皮单细胞悬浮液.方法 采用NIH 3T3饲细胞培养体系,将角膜缘上皮制成单细胞悬浮液后-182℃冷藏1周,复苏后行体外培养.以角膜缘上皮单细胞悬浮液为对照组.通过测定细胞贴壁时间、分裂周期、MTT值、3H-胸苷值分析细胞代谢和增殖活性,测定单克隆形成率分析干细胞性,采用AE5免疫组织化学方法鉴定培养上皮细胞,HE染色观察培养角膜上皮细胞形态,PAS染色鉴别结膜杯状细胞.主要指标细胞贴壁时间,分裂周期,MTT值,3H-胸苷值,单克隆形成率及角膜上皮细胞形态等.结果 体外培养超低温冷藏、复苏兔角膜缘上皮细胞的细胞贴壁率、分裂周期、单克隆形成分别为(73.16 13.36)%,(25.42±18.73)小时,(13.17±2.87)%,对照组为(74.89±15.72)%,(20.04±9.70)小时,(15.17±3.25)%.细胞代谢、增殖力也较对照组弱(P>0.05).HE染色示细胞形态、结构无差异,AE5免疫组化染色均为阳性,而PAS染色均为阴性.结论 超低温冷藏可降低体外培养兔角膜缘上皮细胞生物学活性,但其影响有限不足以改变细胞生物学特性和在眼表修复中的应用.(眼科,2008,17:108-112)     

培养兔自体角膜缘干细胞移植的实验研究

目的 观察以羊膜为载体的兔角膜缘于细胞膜片移植治疗兔角膜缘于细胞缺损的效果。方法 制造兔角膜缘干细胞缺损的动物模型,以右眼为实验眼,从兔左眼取角膜缘组织,将兔角膜缘干细胞消化下来,接种于铺有羊膜的无菌六孔培养板中,待细胞形成多层角膜上皮细胞后,对兔角膜缘干细胞缺损动物模型行角膜缘干细胞羊膜移植术,并对治疗后的角膜进行裂隙灯及病理学检查。结果 临床和组织病理学染色证实：体外培养的兔角膜缘干细胞可在羊膜上继续增生、分化为多层角膜上皮细胞;角膜缘干细胞移植术后兔角膜缘轻度充血、角膜上皮完整、基质细胞浸润减轻、新生血管减少或消失。结论 应用角膜缘干细胞羊膜移植术可恢复其角膜上皮结构的完整性,减少角膜新生血管的形成,维持角膜缘的细胞屏障功能。     

一种培养原代小鼠角膜基质细胞的新方法

目的改良小鼠角膜基质细胞分离培养方法 ,为角膜基质细胞生物学和角膜组织工程等研究提供更好的种子细胞。方法采用Dispase酶消化法联合组织块贴壁法分离、培养原代小鼠角膜基质细胞,倒置显微镜下观察细胞生长情况,通过间接免疫荧光化学染色Vimentin表型和RT-PCR检测Vimentin、Lumican和CK12基因表达对培养的细胞进行鉴别。结果倒置显微镜下可见小鼠角膜基质细胞呈三角形和树枝状,细胞间连接明显,可形成网状连接;免疫荧光化学鉴定小鼠角膜基质细胞表达Vimentin阳性;RT-PCR显示Vimentin和Lumican基因表达阳性,CK12表达阴性。结论 Dispase酶消化法联合组织块贴壁法培养可获得具有角膜基质细胞特性的细胞,本方法为体外获得单纯小鼠角膜基质细胞提供了简单高效的途径。     

LV-EGFP标记兔角膜基质细胞体外基质层移植的实验观察

目的:探讨兔角膜基质细胞(CSCs)体外移植兔角膜后的存活时间。方法:体外培养原代兔CSCs,并行细胞免疫组化鉴定,利用慢病毒载体(LV)携带标记基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染兔CSCs,倒置荧光显微镜下观察转染后细胞生长状态及荧光强度,体外动物实验,随机分为2组,实验组行LV-EGFP标记的兔CSCs细胞悬液角膜基质注射,对照组等量生理盐水角膜基质注射,转染后1wk,1mo取材冰冻切片观察移植的CSCs荧光,石蜡切片行苏木素-伊红(HE)染色观察组织形态。结果:LV-EGFP转染兔CSCs在倒置荧光显微镜下24h后可见少量荧光,96h和110h荧光较强,转染后的CSCs与正常CSCs细胞形态无明显差异;转染后1wk,1mo实验组中角膜基质层中可见绿色荧光,对照组中无绿色荧光;石蜡切片1wk实验组见明显上皮细胞增生及角膜轻微水肿,少量炎症细胞浸润,转染后1mo实验组上皮细胞增生减弱,未见角膜层水肿;对照组1wk,1mo均未见明显异常。结论:LV-EGFP标记的兔CSCs行体外角膜基质移植,可在角膜中至少存活1mo,且与邻近组织相容性较好。     

人角膜缘干细胞体外培养后生物学特性的变化

目的 探讨人角膜缘干细胞体外培养后细胞形态学，抗原性和增殖能力的变化。方法 消化培养法体外培养人角膜缘干细胞。获得细胞单层并观察细胞形态学变化。利用间接免疫荧光组化检测人角膜缘组织HLA-DR抗原在培养前，后的变化，检测培养后细胞增殖核抗原和角膜上皮64KD角蛋白的表达。结果 原代细胞在培养1周形成单层细胞形态以圆柱状细胞为主，培养前角膜缘上皮下少星HLA-DR抗原分布，培养后单层细胞DR抗原表达阴性；单层细胞中多量，散在分布的增殖细胞核抗原阳性细胞，并且部分细胞表达64KD角蛋白，结论 角膜缘干细胞体外培养后分化为角膜上皮，不表达HLA-DR抗原，介仍保持较强的分裂增殖能力，可能是临床移植治疗干细胞缺乏眼表疾病患者的一种有效手段。     

角膜基质诱导胚胎干细胞定向分化的初步实验研究

目的:探索角膜基质接触诱导胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES.细胞)定向分化的可能性。方法:分别在去上皮的新西兰白兔表层角膜缘基质上、晶状体上皮细胞饲养层上培养ES-D_3细胞,裸鼠皮下移植使其形成复层细胞,一段时间后,行扫描电镜和光镜观察。结果:I.ES细胞在新鲜表层角膜缘基质上增殖缓慢,2～3周形成较大细胞集落,光镜下细胞形态单一,体积较正常ES细胞大,电镜下细胞核已演变为细长形,移植到裸鼠皮下2周形成上皮样细胞复层,电镜下可见微绒毛,而角膜基质非上皮面的ES细胞仍保持其小细胞状态不变。2.晶状体上皮细胞与ES细胞共培养只能延缓其分化时间,不能诱导其定向分化。结论:表层角膜缘基质具有诱导ES细胞定向分化的潜能,体外培养条件下可能不发生晶状体诱导的第三级胚胎诱导。眼科学报1999;15:195-198。     

胎儿角膜缘干细胞的培养和生物学特性观察

角膜缘干细胞(limbalstemcells,LSC)及利用角膜缘干细胞移植(limbalstemcellstransplantation,LSCT)重建眼表的研究正在国内外广泛展开。而实行LSCT其前提是必须有LSC供体,尽管当前LSC的来源有自体、同种异体和体外培养的自体及同种异体等几种,但均有其局限性。人胎儿细胞的增殖和分化潜能较成人同类细胞大,此外,胎儿的免疫系统没有发育完善,胎儿组织存在免疫宽容现象[1]。贾卉等[2]研究还发现,胎儿角膜中与免疫反应有关的细胞和细胞间黏附分子较成人少,故胎儿器官、组织或细胞移植较少甚至无免疫排斥反应发生。因此,为探寻一种新的…     

培养的同基因兔角膜缘干细胞移植治疗兔眼表烧伤

目的:探讨培养的同基因兔角膜缘细胞移植治疗眼表疾病的方法和疗效。方法:采用消化培养法,兔角膜缘组织进行体外培养,载体为冰冻保存人羊膜,培养的细胞形成单层后移植到已去除病变组织的碱烧伤兔眼球表面,6例兔三度碱烧伤眼进行了培养的同基因兔角膜缘干细胞移植,通过HE染色和免疫荧光染色法,观察眼表结构的愈合情况。结果:术后上皮化进程加快(2～3wk,P<0.05),2mo内均形成较稳定的眼表上皮结构,角膜轻度血管化和结膜化。结论:培养的同基因角膜缘干细胞移植术可作为治疗眼表烧伤、重建眼表的有效方法。     

In vitro tissue engineering of lamellar cornea using human amniotic epithelial cells and rabbit cornea stroma

AIM:To reconstruct the lamellar cornea using human amniotic epithelial (HAE) cells and rabbit cornea stroma in vitro using tissue engineering technology.METHODS: Human amnia taken from uncomplicated caesarean sections were digested by collagenase to obtain HAE cells, and the cells were cultured to proliferate. Rabbit corneal epithelial cells were removed by n-heptanol to make lamellar matrix sheets. The second passage of HAE cells were cultured on the corneal stroma sheets for 1 or 2 days, then transferred to an air-liquid interface environment to culture for 2 weeks. Tissue engineered lamellar cornea (TELC) morphology was observed by Hematoxylin-eosin (HE) staining; its ultrastructure was observed by transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM); corneal epithelial cell-specific keratin 3 and keratin 12 were detected with immunofluorescence microscopy.RESULTS:HAE cells grew on the rabbit corneal stroma, forming a monolayer after 1-2 days. About 4-5 layers of epithelial cells developed after 2 weeks of air-liquid interface cultivation, a result similar to normal corneal epithelium. Rabbit corneal stromal cells were significantly reduced after one week, then almost completely disappeared after 2 weeks. TEM showed desmosomes between the epithelial cells; hemidesmosomes formed between the epithelial cells and the basement membrane. SEM revealed that the HAE cells which grew on the lamellar cornea had abundant microvilli. The tissue-engineered cornea expressed keratin 3 and keratin 12, as detected by immunofluorescence assay.CONCLUSION: Functional tissue-engineered lamellar corneal grafts can be constructed in vitro using HAE cells and rabbit corneal stroma.     

不同术式治疗原发性翼状胬肉的临床效果分析

目的:比较分析羊膜移植术、自体角膜缘干细胞移植术及术中应用0.2g/L丝裂霉素C治疗原发性翼状胬肉的临床效果。方法:回顾性分析我院232例曾行原发性翼状胬肉手术的患者,其中82例行羊膜移植术治疗,90例行自体角膜缘干细胞移植术治疗,60例在术中应用0.2g/L丝裂霉素C治疗,比较三种术式术后复发率及并发症。结果:自体角膜缘干细胞移植术和术中应用0.2g/L丝裂霉素C治疗原发性翼状胬肉的复发率低于羊膜移植术(P<0.05);而自体角膜缘干细胞移植术和术中应用0.2g/L丝裂霉素C之间复发率无差异(P>0.05)。角膜上皮缺损,流泪和畏光在0.2g/L丝裂霉素组发生比例较其他两组高(P<0.05),在自体角膜缘干细胞移植组和羊膜移植组两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结膜充血及结膜下出血在三组间无统计学差异(P>0.05)。结论:与其他两种术式相比,自体角膜缘干细胞移植术治疗原发性翼状胬肉,有着复发率低、并发症少的优点。     

角膜缘干细胞体外培养的研究进展

角膜缘干细胞是位于角膜缘Vogt栅栏区的一种成体单能干细胞,其可通过自我更新以补充角膜上皮的损伤修复,在维持正常角膜上皮完整性、角膜透明度以及维持正常视力中发挥着重要作用。各种原因造成的角膜缘干细胞缺失将导致患者角膜混浊、眼表血管化,最终失明,目前治疗相关疾病的主要方法为体外培养角膜缘干细胞后再行移植治疗,其中如何高效地体外扩增角膜缘干细胞成为治疗成功与否的关键,本文就角膜缘干细胞定位、获取方法以及体外扩增方式等进行综述。     

两种手术方式治疗复发性翼状胬肉伴睑球粘连的疗效对比

目的:角膜缘干细胞移植与羊膜移植治疗复发性翼状胬肉伴睑球粘连的疗效分析。方法:复发性翼状胬肉伴睑球粘连患者80例。按照随机方式分为翼状胬肉切除术联合角膜缘干细胞移植、翼状胬肉切除联合羊膜移植组,每组40例。术后随访6mo,观察翼状胬肉及睑球粘连的复发率。结果:角膜缘干细胞移植组有2例复发(5%),羊膜移植组有8例复发(20%),两组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:两种术式均能显著降低复发性翼状胬肉术后复发率,但角膜缘干细胞移植术后复发率更低。