人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化

目的探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性。方法贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离,扩增培养,待细胞融合,传代培养。检测细胞的生长曲线、表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能。结果克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上,表达CD13、CD29、CD59,不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA-DR;传代17代时能诱导分化为神经元样细胞。结论该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞,并保持分化潜能;克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性。     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞向软骨、脂肪和神经元样细胞分化的研究

目的：探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）多向分化潜能。 方法：从大鼠骨髓中获得间充质干细胞,体外培养传代。通过地塞米松、TGF-β1和维生素C诱导rMSCs向软骨细胞分化,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原进行鉴定。通过地塞米松和胰岛素诱导rMSCs向脂肪细胞分化,采用苏丹Ⅳ染色鉴定。在含IBMX、GDNF和IL-1β的培养基中诱导rMSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学方法检测神经细胞特异标志NSE和MAP-2a,b。 结果：rMSCs被诱导7 d后,分化成软骨细胞,甲苯胺蓝异染阳性、Ⅱ型胶原阳性。被诱导10 d后,分化成脂肪细胞,苏丹Ⅳ染色阳性。被诱导7 d和15 d后,分化成神经元样细胞,表达NSE和MAP-2a,b,15 d后NSE阳性率是(20.060±0.790)%,MAP-2a,b阳性率是(17.364±5.738)%。 结论：体外rMSCs被诱导分化成软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞,证明其具有多向分化潜能, 是组织工程研究中最有前途的种子细胞之一。     

成鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和向神经元样细胞分化的能力.方法:利用Percoll分离液(1.073×103g/L)梯度分离成年大鼠MSCs,采用3种不同的方法对其诱导分化,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、星形胶质细胞特异性标志(GFAP)和神经前体细胞(Nestin)的表达.结果:成功进行了成年大鼠MSCs的原代和传代培养,3种诱导方法均能使MSCs分化为神经元样细胞,都能表达NSE、NF和Nestin,而不表达GFAP.结论:MSCs能在体外分离、扩增、传代,并能向非间充类细胞分化.     

人脐带间充质干细胞经添加B27的无血清培养基诱导后分化成神经元样细胞

目的 评价人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）经添加B27的无血清培养基诱导后向神经元样细胞分化的能力和效率。方法 将第4代HUCMSCs分为4组：A组：血清培养基（SCM）处理14 d;B组：给予SCM+20 ng/mL神经生长因子（NGF）+10 ng/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）治疗14 d;C组：无血清培养基（SFM）处理14 d;D组：SFM+20 ng/mL NGF+10 ng/mL bFGF处理。每3 d更换各组细胞培养液。倒置显微镜观察神经球生长情况,流式细胞术分析细胞标记物。巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、人重肽神经丝蛋白（NEFH）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）通过qRT-PCR和Western blotting进行定量。结果 在诱导前,HUCMSCs表现出丰富的间充质干细胞表面标志物（CD29、CD44和CD105分别为99.5%、49.6%和77.7%）的表达。在第7、10、14天观察神经元样细胞的形成,D组最优,其次是C、B、A组。qRT-PCR和Western blotting结果显示,A、B、C、D组Nestin和GFAP表达逐渐减少,NEFH和NSE表达逐渐增加,A组与其他3组的GFAP、NEFH、Nestin和NSE表达差异有统计学意义（P<0.05）。结论 添加B27的SFM可以有效地将HUMSCs分化为神经元样细胞,添加细胞因子（NGF和bFGF）使分化效 果更显著。     

BDNF基因转染促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的: 将脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)基因转入骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC),使其作为种子细胞和基因治疗的载体将BDNF基因导入脊髓损伤组织,为探索一种更为有效的脊髓损伤治疗方法提供实验基础。方法: 分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞;实验组应用已构建的pEGFP-N1-BDNF进行基因转染,空质粒组用pEGFP-N1空质粒进行转染,阴性对照组只加入培养基,并进行Western 印迹分析;将转染BDNF的实验组、转染空质粒组和未转染的阴性对照组细胞在体外向神经元样细胞诱导分化,比较3组细胞诱导后神经元样细胞分化率,并进行统计学分析。结果: 流式细胞检测培养细胞CD90(+),CD44(+), CD34(-)、CD45(-);经Western印迹检测证实实验组MSC表达BDNF-EGFP;实验组细胞向神经元样细胞分化率高于空质粒组和未转染的阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论: BDNF基因转染MSC后,可以促进其向神经元样细胞分化,BDNF在MSC向神经元样细胞分化过程中具有重要作用。     

地黄多糖在诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程中对Notch1蛋白表达的影响

目的探讨地黄多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的作用,及其对Notch1蛋白表达的影响。方法以大鼠BMSCs为研究对象,取第3代细胞,分为对照组、β-巯基乙醇诱导组(5mmol/L BME)和地黄多糖诱导组(0.2 mg/mL)进行诱导实验,应用流式细胞仪检测诱导前后细胞生长周期改变情况,免疫细胞化学染色法检测神经标志物:神经巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Notch1蛋白的表达,Western blot检测Notch蛋白胞内片段(NICD)的表达情况。结果流式细胞仪检测示地黄多糖诱导后G0/G1期细胞比例明显升高,而S+G2/M期的细胞比例明显下降。免疫细胞化学染色显示,对照组不表达神经细胞标志物,各诱导组诱导后产生特异性神经细胞标志物表达。其中地黄多糖组nestin及NSE阳性细胞率高于β-巯基乙醇诱导组(P<0.05);GFAP阳性细胞率低于β-巯基乙醇诱导组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示地黄多糖诱导组诱导前为Notch1蛋白强阳性或阳性染色,并随诱导时间延长阳性细胞逐渐减少。Western blot结果显示地黄多糖诱导组诱导分化24 h后细胞内NICD含量逐渐下降,到第5天时,低于诱导前水平,且仍明显低于对照组。结论地黄多糖可能通过抑制Notch1蛋白表达而诱导BMSCs向神经样细胞分化,且主要向神经元样细胞方向分化。     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的逆转化现象

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(hMSC)分化为神经元样细胞后的逆转化现象.方法 从成人骨髓分离、培养和扩增hMSC.用参芪液诱导hMSC分化为神经元样细胞,并用免疫组化方法鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.采用RT-PCR方法检测10个基因(内胚层基因ceruloplasmin;中胚层基因SM22:外胚层基因Amyloid precursor protein、syntaxin;生殖系基因protamine;神经元特异性基因Neuro D、NF、NSE、GFAP、Tau)在诱导分化为神经元样细胞的动态变化以及逆转化细胞的基因表达变化.结果 hMSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞.免疫组化显示诱导出的神经元样细胞表达NSE、NF阳性,GFAP阴性.去除参芪液,观察到神经元样细胞又恢复为hMSC的外形,呈现宽大扁平或长梭形.基因检测显示逆转化的细胞基因表达与未分化hMSC相似.结论 参芪液可以促进hMSC分化为神经元样细胞,诱导分化过程可以出现逆转化现象.     

Differentiation of mesenchymal stem cells into dopaminergic neuron-like cells in vitro

INTRODUCTION The therapy of Parkinson’s disease is difficult, sopeople have been exploring more effective methods.Drugs can only treat symptoms of the diseases, andbrain tissue transplantation has been the most prosp-ective way, but the sources of transplantation cells needto be explored. The people have a new viewpoint ofthe central nervous system (CNS) regeneration andthe therapy of CNS diseases[1,2] because of the recentdiscovery of stem cell populations in CNS. But adultneura…     

体外诱导胎盘来源间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探索体外诱导胎盘间充质干细胞(PMSCs)分化为神经元样细胞的方法。方法:消化胎盘组织,贴壁培养细胞,观测形态并用流式细胞仪检测其细胞表面标志;用含叔丁对甲氧酚(BHA)、二甲基亚砜(DMSO)及碱性成纤维细胞因子(b-FGF)的条件培养基培养细胞,诱导分化为神经元样细胞,采用免疫细胞化学的方法对分化的细胞进行鉴定。结果:胎盘组织的贴壁细胞与骨髓间充质干细胞(BMSCs)有相似形态和细胞表面标志,诱导后细胞表达神经元和星形胶质细胞标志神经元特异性的烯醇化酶(NSE)、和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论:胎盘组织中存在能分化为神经元样细胞的间充质干细胞。     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的体外研究

目的 探索成人骨髓间充质干细胞在体外定向分化为神经元样细胞的条件。方法 采用Ficoll-paque(1．077g／m1)分离液密度梯度离心从人的骨髓分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增到第10代，选择4组不同组合的神经分化诱导条件，分别诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，通过免疫细胞化学鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达情况。结果各组诱导剂诱导后，骨髓间充质干细胞分化为具有典型的神经元形态的细胞，免疫细胞化学显示、NF-M呈强阳性反应，NSE表达强度提高，在最佳的分化条件下，即加入bFGF、ATRA、BME、BHA、DMSO诱导条件下，大约80％细胞表达NF—M，86％的细胞为NSE强阳性。结论 成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞，且具有较高的阳性分化率。     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响

目的 观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对兔源骨髓间充质于细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）定向分化为成骨细胞的作用及机制. 方法 离心法分离兔骨髓后,体外培养BMSCs,体积分数5％和10％的PRP与BMSCs共培养,观察BMSCs诱导分化过程中茜素红染色阳性率,应用酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaliphosphatase,ALP）活性,应用ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中骨钙素（osteocalcin,OCN）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的含量,应用real time-PCR检测成骨相关基因CTGF、ALP、成骨细胞核心结合因子α1（core-binding factor alpha 1,Cbf-α1）、兔Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和OCN的表达. 结果 BMSCs诱导分化后细胞茜素红染色阳性率、ALP活性、OCN及CTGF含量升高,CT-GF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN的mRNA表达增加. 结论 PRP可促进BMSCs向成骨细胞分化,可能与PRP促进BMSCs中CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN表达有关.     

依达拉奉联合表皮生长因子诱导人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化中端粒酶活性的变化

目的观察依达拉奉联合表皮生长因子（EGF）诱导人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）神经元样细胞分化过程中端粒酶活性的变化。方法依达拉奉联合EGF诱导hBMSCs,观察其形态变化。免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达,采用TRAP-ELISA和Western blotting分别检测诱导后hBMSCs端粒酶活性及端粒酶逆转录酶（TERT）变化。结果经诱导后,hBMSCs呈典型神经元样细胞分化,NSE阳性率为81.7%,GFAP阳性率为8.5%。端粒酶活性和TERT蛋白诱导4h后均无明显变化,但诱导6h后细胞端粒酶活性明显降低,诱导至24h时,细胞端粒酶活性已近阴性。Western blotting试验的结果与细胞端粒酶活性的改变一致。结论依达拉奉联合表皮生长因子体外可以诱导hBMSCs分化为神经元样细胞,端粒酶活性在诱导分化早期呈高表达,分化过程中逐渐降低直至消失。     

大鼠骨髓间充质干细胞在体外向神经元样细胞的分化

目的探讨2-ME与BHA对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为神经元样细胞的作用。方法大鼠股骨中分离MSCs,贴壁法体外扩增、传代。以二巯基乙醇（2-ME）预诱导,再加入2-ME、3-叔丁基-4羟基茴香醚（BHA）诱导。免疫细胞化学染色检测巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管联合蛋白-2（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、1-氨基丁酸（GABA）、酪氨酸羟化酶（TH）的表达,以鉴定分化细胞的表型特征。尿嘧啶脱氧核苷（BrdU）作为细胞分裂标记检测MSCs增殖特性。结果细胞诱导后具有神经细胞的形态,并被BrdU标记,nestin、NSE、MAP-2、AchE、GABA表达阳性,而GFAP、TH表达为阴性。结论2-ME和BHA在体外能够有效的诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

褪黑激素体外定向诱导骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨褪黑激素(melatonin,MT)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)不同时段向神经细胞分化的情况。方法:采用细胞培养技术分离培养和纯化大鼠MSCs,以MT为诱导剂诱导大鼠MSCs向神经细胞分化。分别在诱导后3,7,10,14 d以免疫荧光法测定神经干细胞特异性标志(nestin)、神经元细胞特异性标志(neurofilament,NF)和星形胶质细胞特异性标志(GFAP)的表达。结果:MT诱导分化3 d,部分细胞胞体收缩成三角形,有些成为简单的双极或多极细胞。诱导3 d细胞开始表达nestin,7~14 d表达nestin和NF,细胞不表达GFAP。结论:MT可诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究

 目的 分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）,并行多向分化潜能的鉴定。方法 经Percoll梯度分离法获得大鼠骨髓单个核细胞。贴壁培养后,通过倒置显微镜进行细胞形态学观察,并采用流式细胞术进行分析。传至第3代后,分别进行成脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞的诱导,并行免疫组织化学鉴定。结果 骨髓间充质干细胞大小较为均匀,基本上呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积增大,成纤维样细胞逐渐增多。经反复传代纯化的MSCs检测CD71、CD29呈阳性表达并证实骨髓间充质干细胞经诱导后分化为脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞。结论 在体外,大鼠骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化,为肝组织工程提供理想的细胞来源。方法:以肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4对种植于基底膜基质中的人骨髓间充质干细胞进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间,分别进行形态观察、AFP、Alb的免疫组化荧光染色及靛青绿的摄取与排泌试验。结果:该条件下诱导后的人骨髓间充质干细胞生成肝细胞样细胞,阳性表达肝细胞特有表面标志AFP、Alb,并具备肝细胞特有的摄取与排泌靛青绿的活性功能。结论:肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4及基底膜基质可能在体外人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在肝组织工程中的应用提供了理论与技术上的支持。     

低氧对人骨髓间充质干细胞向胆碱能神经元分化的影响

【目的】观察低氧对体外培养的人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）向胆碱能神经元分化的影响。【方法】将对照组和常氧分化组hBMSCs置于常氧（20％O2）环境中培养,低氧分化组细胞置于低氧（3％O2）环境中。采用免疫细胞化学法和高效液相色谱-电化学法,分别检测胆碱能神经元的数量和诱导分化后乙酰胆碱（ACh）的含量。【结果】对照组未见胆碱乙酰化酶（ChAT）阳性神经元,低氧分化组ChAT阳性神经元数量明显增多,约为常氧分化组的4倍（P〈0．01）,并且该组诱导分化后的细胞合成的ACh含量也高于常氧分化组（P〈0．05）。【结论】低氧可促进hBMSCs向胆碱能神经元方向分化,这为临床应用hBMSCs治疗阿尔茨海默病提供了新的思路。     

人骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外分离培养及鉴定。方法:成人骨髓取自手术中非血液系统疾病、非肿瘤及乙肝表面抗原阴性患者摘取的肋骨,采用贴壁筛选法进行体外扩增;用免疫组织化学法对培养的细胞进行鉴定。结果:体外培养的原代hMSCs9d融合,免疫组织化学染色CD44表达阳性。结论:贴壁筛选法在体外很容易分离培养和扩增hMSCs,可作为获得hMSCs的一种有效手段。