高侵袭力及稳定高表达增强型绿色荧光蛋白的膀胱癌细胞株的建立

目的:建立具有高侵袭力及稳定高表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的膀胱癌细胞株. 方法:通过构建侵袭小室,以穿透人工基底膜、聚碳酸脂膜能力为依据,筛选从人膀胱癌细胞系EJ中筛选具有体外高侵袭能力的膀胱癌细胞亚系(EJ-m3).用pEGFP-C1转染人膀胱癌细胞系EJ及其高侵袭力亚系,经G418抗性筛选和96孔板有限稀释获得稳定高表达EGFP的单克降细胞株.并用流式细胞术检测EGFP表达率,通过细胞周期、生长曲线和体外侵袭实验,对转染和未转染EGFP的细胞生物学行为进行综合分析. 结果:筛选出了具有高侵袭力的膀胱癌细胞EJ-m3,并获得了稳定高表达EGFP的细胞株EJ- GFP和EJ-m3-GFP.该两株细胞EGFP的表达率均为99.9%,增殖指数、生长曲线和体外侵袭力与未转染前相似(P>0.05). 结论:用改良侵袭实验筛选膀胱癌细胞系的高侵袭力亚系的方法是可靠的.转染EGFP的细胞其生物学行为并未发生改变.所获得的具有高侵袭力和稳定高表达EGFP的膀胱癌细胞为膀胱癌侵袭及转移的研究提供了良好的实验平台.     

高侵袭力人胃癌细胞亚系MKN-28s的建立

目的以穿透人工基底膜的能力大小为依据筛选具有体外高侵袭能力的胃癌细胞亚系。方法用体外培养法收集扩增能侵袭穿透人工基底膜的胃癌细胞亚系;比较母亚两系的侵袭能力;流式细胞术检测母亚两系细胞周期;免疫组织化学SP法观察母亚两系细胞Flt-4蛋白表达情况。结果从母系MKN-28中成功筛选出高侵袭力胃癌细胞亚系MKN-28S;显微镜下细胞计数示亚系侵袭至膜背面的数量较母系明显增多（P〈0.05）,细胞侵袭力增强;亚系中Flt-4蛋白表达同母系相比显著增高;亚系增殖指数（PI）高于母系。结论MKN-28S细胞较MKN-28细胞具有更强体外侵袭力和增殖能力。     

Boyden小室侵袭试验测定膀胱癌细胞的体外侵袭力

目的 :用Boyden小室侵袭试验测定膀胱癌细胞的体外侵袭力 ,并探索肿瘤细胞侵袭与其它生物学习性之间的关系。方法 :采用人工基底膜构建侵袭小室。测定EJ、T2 4、BIU 873个膀胱癌细胞株的体外侵袭力 ,并测定细胞的生长曲线、集落形成率、体外趋化运动性等指标 ,分析这些指标与体外侵袭力的关系。用扫描电镜观察侵袭过程中癌细胞的形态变化。结果 :EJ、T2 4、BIU - 87的侵袭细胞数分别为 :39 2 6± 13.90、77 0 0± 13 2 8、166 53± 2 7 2 0 ,癌细胞的体外侵袭力分别与细胞的体外运动性和生长曲线有密切关系。电镜下可见细胞通过变形运动穿过微孔 ,并伸出丝状伪足来协助运动。结论 :Boyden小室侵袭试验为测定体外癌细胞侵袭力较可靠的方法。肿瘤的侵袭力与细胞的某些生物学习性有关 ,因而测定有关指标也可间接判断肿瘤的侵袭力。     

CXCR4在不同转移潜能肝癌细胞中的表达及意义

  目的研究趋化因子受体CXCR4在高、低转移潜能肝癌细胞中的表达,并探讨其在肝癌细胞增殖和侵袭转移过程中的作用。方法 利用3B肝癌细胞株对人工基底膜穿透能力的差异获得不同转移潜能肝癌细胞亚系,并通过transwell小室侵袭实验比较两细胞亚系的侵袭能力从而对其进行验证, 应用RT-PCR和Western Blot检测CXCR4在两细胞亚系中的表达。CCK8法检测两细胞亚系生长曲线和倍增时间,流式细胞仪检测两细胞亚系细胞周期和凋亡率。结果成功筛选出高、低转移潜能肝癌细胞亚系,并通过transwell小室侵袭实验证实高转移潜能肝癌细胞的侵袭能力高于低转移潜能肝癌细胞;RT-PCR和Western Blot均显示高转移潜能肝癌细胞在基因水平和蛋白水平的CXCR4表达均显著高于低转移潜能肝癌细胞;且两细胞亚系体外生长速度、倍增时间、细胞周期和凋亡率均具有明显差异。结论上述结果表明CXCR4在肝癌进展中发挥了重要的作用,可能为未来肝癌的诊疗提供理论依据。     

第六届全军泌尿外科学术会议

第六届全军泌尿外科学术会议,1996年5月12～16日在广州召开。会议共收到论文520余篇,其中会议交流250余篇,270余名代表参加了会议。 一、泌尿系肿瘤 用体外筛选的方法,从裸鼠皮下接种不转移的膀胱癌细胞系中,筛选出能形成淋巴结转移和体外侵袭能力更高的细胞亚系,将母代和筛选后的子代进行对照,发现子代细胞明胶酶产量明显增加,DNA含量增加,细胞增殖速度加     

体内外连续筛选建立人前列腺癌高转移细胞亚系及其生物学特性

目的 建立人前列腺癌小鼠转移模型,筛选前列腺癌高转移细胞亚系.方法 采用DU145细胞悬液原位注射法接种BNX小鼠,建立前列腺癌小鼠COI模型,取肺转移灶体外培养并采用侵袭小室体外筛选高侵袭性细胞,扩增后进行原位注射,如此将肺转移灶癌细胞在小鼠体传代2次,筛选高转移细胞亚系.结果 (1)原位细胞悬液注射法接种10只小鼠均成瘤,并都伴有肠系膜、腹股沟淋巴结,其中3只发现肺转移.(2)获得高转移前列腺癌细胞亚系DU145-M3,其侵袭能力强,肿瘤转移相关基因MAPK4和TIPM-2低表达,MMP-2高表达.结论 COI法是有效的前列腺癌转移模型制作方法;体内外连续筛选可获得高转移细胞亚系.     

KISS-7基因与膀胱癌转移的相关性及其稳定表达对细胞侵袭能力影响

目的 探讨KISS-1基因与膀胱癌转移的相关性,及其稳定表达对膀胱癌细胞细胞侵袭能力的影响.方法 应用荧光定量PCR方法检测原发未转移膀胱癌和原发伴转移膀胱癌组织中KISS-1 mRNA的表达.构建真核表达载体pIRES2-KISS1,转染膀胱癌T24细胞系并筛选单克隆稳定转染细胞株,检测转染前后细胞的侵袭能力变化.结果 原发伴转移膀胱癌组织中的KISS-1 mRNA表达较原发未转移膀胱癌中明显下降,具有统计学差异(P＜0.05).单克隆稳定转染细胞系中KISS-1蛋白明显增加,细胞侵袭能力也随之明显降低(P＜0.05).结论 KISS-1基因与膀胱癌的转移相关,其表达增高能够抑制T24细胞的侵袭能力.     

E-cadherin基因转染对膀胱癌细胞生长及浸润能力的影响

目的　利用转基因技术 ,观察E cadherin(ECD)对膀胱癌生长和浸润转移能力的影响。方法　将细胞间粘附分子ECD真核表达载体转染具有高浸润转移能力的膀胱癌细胞系Ts3L ,测定细胞的生长曲线、克隆形成能力、体外浸润能力及细胞的周期分布。结果　ECD基因转染后的膀胱癌细胞生长速度明显减慢 ,达 3 5 7%;凋亡细胞比例明显增加 ,超高倍体细胞比例明显减少 ;Ts3L/ECD细胞克隆形成能力显著降低 (P <0 0 1) ;Ts3L/ECD细胞的浸润能力明显低于其母代及对照细胞。结论　ECD对肿瘤的生长和浸润转移都有显著的抑制作用 ,是一个重要的肿瘤生长和浸润转移的抑制因子     

膀胱肿瘤细胞体外侵袭过程的扫描电镜观察

目的侵袭是恶性肿瘤转移发生最初的一步,黏附、蛋白水解及细胞游走能力是影响侵袭的3个主要因素。文中旨在通过扫描电镜观察膀胱肿瘤细胞在体外侵袭实验中的侵袭过程。方法采用大鼠ESH肉瘤细胞外基质提取Matri-gel构建侵袭小室,BIU-87-m3常规体外侵袭7 h,扫描电镜观察侵袭膜的室腔面及背面,了解肿瘤细胞侵袭情况。结果侵袭膜室腔面观察到膀胱肿瘤细胞贴附于Matrigel表面生长,向聚碳酸酯膜上的小孔伸出伪足及正在穿过Matrigel及聚碳酸酯膜上小孔;背面观察到膀胱肿瘤细胞穿过侵袭膜后贴附于侵袭膜背面生长及穿过侵袭膜的伪足。结论从形态学上证实了肿瘤细胞侵袭特性的存在及传统体外侵袭实验设计的科学性和体外检测肿瘤细胞侵袭力的可行性。     

Rho激酶抑制剂对膀胱癌细胞侵袭能力的影响

目的：探讨Rho激酶抑制剂对体外培养的膀胱癌细胞侵袭能力的影响。方法：培养膀胱癌细胞株T24,采用CCK-8实验、体外细胞侵袭实验、细胞运动实验测Rho激酶抑制剂对细胞生长和侵袭运动能力的影响。结果：经Rho激酶抑制剂处理后的膀胱癌细胞株T24的侵袭和运动能力明显下降,呈浓度依赖性,且当药物浓度〉75μmol/L后,细胞的生长受到明显的抑制。结论：Rho激酶信号转导系统对膀胱癌细胞的侵袭和生长有重要的影响。     

不同转移潜能乳腺癌细胞亚系的建立与生物学特性的分析

目的探讨利用细胞穿透人工基质膜能力的差异筛选不同转移潜能乳腺癌细胞的可行性,并分析二者生物学特性差异。方法人乳腺癌细胞系MDA-MB-435s经过连续人工基质膜侵袭试验后获得高、低转移潜能细胞株,并应用细胞生长曲线测定、侵袭力、黏附率实验,促血管形成实验分析所筛选出的不同转移潜能乳腺癌细胞的生物学性质的差异。结果获得2株转移潜能不同的乳腺癌细胞株,它们具有差异明显的体外生长速度、侵袭力、黏附力和促血管形成能力。结论利用细胞穿透人工基底膜能力的差异能够筛选出高、低转移潜能的乳腺癌细胞。     

人胃癌细胞高转移亚系的初步筛选及母亚两系生物学特性的比较

目的 筛选高转移胃癌细胞亚系并与其母系进行生物学特性的比较.方法 利用transwell小室筛选高转移力胃癌细胞亚系,通过HE染色比较母亚两系细胞形态改变;流式细胞仪检测母亚两系细胞周期;免疫细胞化学法检测两系细胞中MMP-9蛋白表达;transwell侵袭小室模型比较母亚两系的迁移能力.结果 利用transwell小室从母系MKN-28中成功筛选出高转移力胃癌细胞亚系MKN-28S, 母亚两系细胞形态上无明显差异,亚系增殖指数(PI)高于母系,且亚系中 MMP-9蛋白表达同母系相比显著增高,显微镜下细胞计数示亚系迁移至膜背面的数量较母系明显增多 (P＜0.05),细胞运动能力明显增强.结论 MKN-28S细胞较MKN-28细胞具有更强增殖能力和更高迁移力.     

层粘连蛋白对小鼠肺癌细胞移动性及粘连性的影响

探讨内源性和外源性层粘连蛋白（Ｌａｍｉｎｉｎ，ＬＮ）对癌细胞粘连性及移动性的影响。方法通过体外实验，利用外源性ＬＮ作用于小鼠肺腺癌细胞系高、低转移亚系细胞，比较这两种细胞的移动性和粘连性，并观察其细胞骨架改变及内源性ＬＮ的表达。结果无外源性ＮＬ时，具有转移特性的小鼠肺腺癌细胞亚系体内转移潜能与其体外移动性、粘连性呈负相关。但当外源性ＬＮ作用４８小时后，高转移亚系细胞形态发生改变，在细胞骨架重组的同时其移动性和粘连性明显加强，这一变化与细胞转移行为呈正相关。高转移亚系细胞较低转移亚系细胞的细胞骨架网络分布不均匀不规则，并且其内源性ＬＮ呈高表达。结论癌侵袭、转移行为与癌细胞ＬＮ受体含量、内源性ＬＮ的分布以及癌细胞外ＬＮ的存在与否密切相关。     

人皮肤鳞状细胞癌体外三维模型的建立及高侵袭性鳞癌细胞的生物学评价

目的建立人皮肤鳞癌细胞体外三维培养模型,分离高侵袭性细胞亚群,并比较其生物学特性。方法利用复方壳多糖组织工程皮肤,成功建立人皮肤鳞癌细胞体外三维培养模型,消化分离得到高侵袭性鳞癌细胞亚群,比较肉桂醛和干扰素作用后对不同侵袭特性细胞亚群的增殖抑制效果,同时比较不同侵袭特性细胞亚群在裸鼠中成瘤效果的不同。结果不同浓度的肉桂醛和干扰素对皮肤鳞癌细胞的增殖抑制差异有统计学意义(P<0.01),不同侵袭特性的皮肤鳞癌细胞亚群之间的增殖抑制差异也有统计学意义(P<0.01),另外,两种不同侵袭特性的细胞亚群的成瘤特性差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功建立人皮肤鳞癌体外三维培养模型,同时运用此种三维培养模型能够筛选得到侵袭特性更强的细胞亚群。     

Rac1在肝癌细胞株生长和侵袭中的意义

目的:证实Rac1在肝癌细胞的生长与侵袭中的意义,寻找可能的肿瘤基因治疗新靶点。方法:特异性抑制Rac1蛋白表达的siRNA干扰肝癌高转移细胞株97-H,观察肝癌高转移细胞株97-H内Rac1表达、细胞生长、肿瘤细胞的活力和体外侵袭力的变化。结果:肝癌高转移细胞株97-H内Rac1表达、细胞生长受抑制,肿瘤细胞的活力和体外侵袭力显著降低。结论:Rac1表达的减少能够显著抑制肝癌细胞的生长和侵袭,可能成为肿瘤基因治疗新的靶点。     

食道鳞状上皮细胞癌转移体外细胞模型的建立

目的建立一个适宜的食道鳞状上皮细胞癌（ESCC）体外转移研究模型。方法将ESCC细胞系HK2置于未处理细胞培养皿中培养、传代,筛选出具有非锚定依赖生长能力的细胞株。以体外侵袭实验。软琼脂克隆形成实验比较、验证筛选细胞系与母代细胞的侵袭能力和非锚定依赖生长能力。利用比较蛋白质学的方法分析筛选细胞与母代细胞间的蛋白表达图谱差异。结果成功筛选出具有较高转移能力并可传代培养的HK2-AD细胞株。HK2和HK2-AD细胞侵袭至小室膜反侧的细胞数分别为（16．7±2．5）和（28．7±7．4）,软琼脂集落生成实验表明,HK2和HK2-AD细胞形成的集落数分别为（16．8±3．2）和（25±5．1）,差异均有统计学意义（P〈0．05）。HK2-AD细胞中一些与细胞运动、细胞无氧代谢及抑制凋亡相关的蛋白质分子表达明显上调。结论利用肿瘤细胞的非锚定依赖生长特性建立了一个高转移能力、呈三维生长的HK2-AD细胞株,为ESCC肿瘤转移机制研究和药物筛选提供了一个有价值且易于操作的食道癌转移体外细胞模型。     

腹膜浸润筛选模型体外筛选胆管癌细胞不同转移性亚群

目的　探讨以腹膜为载体用于体外细胞筛选的可行性。方法　利用经处理后的脏层腹膜 ,分离筛选胆管癌细胞不同转移性亚群 ,并以体外侵袭实验验证所筛选出的不同转移性亚群细胞间侵袭能力的差别。结果　以腹膜为筛选介质 ,成功地筛选出胆管癌细胞高、低转移性亚群 ,两亚群细胞间在粘附、迁移能力上均存在着显著的差别 (P <0 0 5 )。结论　腹膜浸润筛选模型用于细胞筛选可行、有效。     

高强度聚焦超声不完全消融对体外培养肝癌细胞的影响

目的通过高强度聚焦超声不完全消融筛选残留肝癌细胞,探讨其生物学行为改变及对血管形成的影响。方法在声功率5 W下,获得高强度聚焦超声辐照肝癌细胞的温度-时间关系,在某一温度下筛选出高强度聚焦超声不完全消融最佳肝癌细胞亚系并继续培养获得稳定子代。细胞活性实验检测细胞增殖率及热耐受性;划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测迁移和侵袭能力;观察内皮细胞管腔形成的变化。结果随着高强度聚焦超声照射时间增加,温度增加,细胞死亡率增加,在48℃及以上温度肝癌SMMC7721细胞基本全部死亡,而47℃筛选出的SMMC7721肝癌细胞亚系增殖率、热耐受性较正常肝癌细胞增强(P<0.05),运动能力、侵袭能力无明显变化(P>0.05);并能促进内皮细胞增殖、迁移和管腔形成(P<0.05)。结论高强度聚焦超声能够杀灭肿瘤细胞,然而高强度聚焦超声不完全消融会促使肝癌细胞生物学行为转变并能促进血管形成。     

皮质肌动蛋白在不同转移潜能乳腺癌细胞中的表达及意义

目的筛选不同转移潜能的乳腺癌细胞亚系,并探讨皮质肌动蛋白(cortactin)在乳腺癌细胞增殖和侵袭过程中的作用。方法经过连续人工基质膜侵袭实验后获得高、低转移潜能的乳腺癌细胞亚系,通过透射电镜观察比较两系细胞的超微结构,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测两系细胞增殖能力,流式细胞仪检测两系细胞周期,Transwell侵袭小室模型比较两系的迁移能力。应用免疫细胞化学法、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹分析法检测cortactin蛋白在两系细胞中的表达。结果利用人工基质膜侵袭实验筛选出高、低转移潜能乳腺癌细胞亚系,并且两系细胞形态上无明显差异。MTT实验显示高转移潜能细胞体外生长速度显著快于低转移潜能细胞(P0.05)。流式细胞仪检测结果显示,高转移潜能细胞亚系与低转移潜能细胞亚系相比,G0/G1期细胞前者比后者少[(52.67±3.69)%vs(64.46±2.79)%],而S期细胞前者比后者多[(30.53±6.19)%vs(24.63±2.04)%]。高转移潜能细胞亚系增殖指数(PI)高于低转移细胞亚系[(47.32±3.69)%vs(35.53±2.80)%,P0.05],侵袭能力显著强于低转移潜能细胞亚系[(61.46±7.08)vs(25.32±4.87)个/视野,P0.05]。免疫组化、RT-PCR和蛋白质印迹分析均显示在高转移潜能细胞亚系中cortactin在基因和蛋白水平的表达均高于低转移潜能细胞亚系(P0.05)。结论 Cortactin的过表达与乳腺癌的增殖和转移过程密切相关。     

槲皮素对人肝癌高转移细胞生长及侵袭能力的影响

目的 探讨槲皮素对肝癌高转移细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 以人高转移肝细胞癌细胞系HCCLM6为研究对象,倒置显微镜观察槲皮素对肝癌细胞HCCLM6细胞形态的影响,MTT法检测槲皮素对细胞增殖的影响,Transwell小室侵袭实验检测槲皮素对肝癌细胞侵袭能力的影响.结果 倒置显微镜下槲皮素组细胞密度降低,悬浮细胞增多;槲皮素组较对照组HCCLM6细胞存活率减低;槲皮素能抑制肝癌细胞在Transwell小室中的侵袭作用.结论 槲皮素能抑制肝癌高转移细胞HCCLM6的增殖和侵袭能力.