Cx43基因对近端流出道隔心肌化过程的调控机制

目的:探讨connexin43（Cx43）基因在小鼠近端流出道隔心肌化的作用及其机制。 方法:选用胚胎（ED）11.5 d至出生后1 d的Cx43基因剔除（KO）纯合型（Cx43-/-）、杂合型（Cx43+/-）及野生型（Cx43+/+）C57/BL6小鼠作为研究对象；采用PCR方法鉴定基因型；HE染色观察心脏结构，免疫组化法测定横纹肌肌动蛋白α-SCA、凋亡相关分子active caspase-3及神经嵴细胞的标志物AP-2的表达。 结果:①Cx43-/-小鼠大多出生后24 h内即死亡。大体解剖见明显的右室流出道圆锥部异常膨隆，右心房扩张；组织切片HE染色示右室流出道壁大量异常小梁状组织增生突起，形成多个囊状结构，右室流出道腔明显狭窄，右室腔扩张。Cx43+/-和Cx43+/+心脏无明显异常。②Cx43-/-小鼠近端流出道隔中央区域α-SCA的表达明显滞后。③Active caspase-3组化显示Cx43+/+凋亡细胞主要出现在近端流出道隔，ED12.5至ED15.5均可见到；Cx43+/-凋亡减少，Cx43-/-则仅见很少凋亡细胞。④Cx43-/-流出道AP-2的表达增多，且表达位置异常。 结论:Cx43 KO小鼠以右室流出道异常增生引起的梗阻性畸形为主要特征，该病变过程可能与胚胎期近端流出道隔心肌化迟滞有关，其近端流出道隔细胞凋亡减少和神经嵴细胞表达异常很可能参与了流出道心肌化异常的形成，表明Cx43在近端流出道隔心肌化过程中具有重要作用。     

小鼠胚胎心流出道心肌性隔的形成机制

目的:探讨小鼠胚胎心流出道近端心肌性隔的形成机制与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性细胞的功能。方法:免疫组织化学方法对12～16d小鼠胚胎心连续切片进行染色。用TUNEL染色对13～15d小鼠胚胎心切片进行染色。结果:胚龄12d,流出道嵴内观察到少量α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)阳性的心肌细胞。胚龄13～14d,流出道壁α-SCA阳性的心肌细胞向间充质隔内长入。隔中央可见α-SCA阳性细胞独立存在。胚龄15～16d,流出道近端心肌性隔形成。胚龄13～15d,间充质隔中央凋亡细胞逐渐增多。结论:流出道近端心肌性隔形成的机制包括心肌化、募集与间充质细胞的原位分化。在此过程中,部分α-SMA阳性细胞凋亡;未凋亡的mSMA阳性细胞可能原位转分化为心肌细胞。     

骨形态发生蛋白-2在小鼠胚胎心流出道发育中的作用

目的 探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在小鼠胚胎心流出道发育过程中的作用。 方法 对胚龄9d(E9) ～E15（各胚龄取3～7只）小鼠心连续石蜡切片,用抗α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)抗体、抗胰岛素增强子结合蛋白(ISL-1)抗体、抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体、抗BMP-2抗体进行免疫组织化学染色。结果 E9,流出道心胶质内无细胞,心肌增殖活性低,BMP-2弱表达于流出道心肌、心内膜及心包腔背侧壁。E9～11,流出道增长,心包腔背侧壁ISL-1阳性细胞至流出道远端分化为心肌细胞后增殖逐渐减弱。E10～11,流出道嵴内间充质细胞逐渐增加,可见BMP-2、PCNA阳性细胞;流出道BMP-2表达逐渐增强达高峰,向两端延伸逐渐减弱,动脉端可及心包反折处。E12,流出道缩短,BMP-2表达减弱。E13～15,流出道隔逐渐肌化,BMP-2在心脏近大血管部心肌呈较弱表达。E10～13,流出道远段心肌呈低增殖活性,近段及右心室心肌增殖成小梁致右心室形成及扩大。结论 BMP-2诱导第二生心区(SHF)细胞分化为心肌细胞添加至心动脉端,参与心流出道嵴的发育。BMP-2抑制流出道心肌增殖,流出道近段BMP 2表达减弱重启了心肌细胞增殖,致右心室形成及流出道缩短。低水平的BMP 2可能诱导流出道隔间充质细胞向心肌分化。     

小鼠胚胎心脏发育过程中转化生长因子的表达特点

目的：探讨不同转化生长因子(TGF)β异构体在小鼠胚胎心脏的时空表达规律和心脏发育关系。方法：小鼠胚胎连续切片,免疫组化PAP法染色。结果：TGFβ1和TGFβ3的表达开始于胚胎发育第9d,第12d达高峰,第13d后,表达下降,尤以室间隔和左心室致密心肌下降明显。直到第10～11d,各部才出现较强的TGFβ2染色,第12d后,TGFβ2染色明显下降。心肌TGFβ2和TGFβ3表达增强的同时,流出道嵴表面和半月瓣原基表面内皮细胞变为立方形,显较强的TGFβ2和TGFβ3染色。结论：TGF／3类生长因子集中表达于小鼠胚胎心脏发育的9～13d,3种TGFβ异构体可能以旁分泌和内分泌的形式在心肌分化、外形演变和内部分隔过程中发挥重要调节作用。     

孕期饮酒介导的组蛋白低甲基化对子代心脏发育基因过表达的影响

目的:探讨组蛋白甲基化修饰失衡在孕期酒精暴露致子代心脏发育相关基因表达异常中的作用及其机制。方法:选取健康昆明小鼠,于孕期0.5 d开始给予56%乙醇(5 mL/kg)灌胃,同时给予G9a-组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase, HMT)抑制剂BRD4770(1 mg/kg)灌胃,于胚胎14.5 d、胚胎16.5 d和新生0.5 d收集子代小鼠心脏。RT-qPCR检测心脏发育相关基因Gata4、Cx43和β-MHC的mRNA表达水平,比色法检测HMT活性,Western blot检测小鼠心肌组织组蛋白H3K9me3、G9a-HMT、Cx43及β-MHC的表达水平。结果:比色法结果表明,孕期酒精暴露的子代小鼠心肌组织中HMT活性与生理盐水对照组相比显著降低(P0.05);Western blot结果表明酒精组小鼠心肌组织中G9a-HMT及组蛋白H3K9me3表达水平与生理盐水对照组相比显著降低(P0.05);RT-qPCR结果显示Gata4、Cx43和β-MHC的mRNA表达水平在酒精组显著升高(P0.05),且Western blot结果也表明酒精组Cx43和β-MHC蛋白水平显著高于生理盐水对照组(P0.05)。同时,G9a-HMT特异性抑制剂BRD4770能够进一步降低小鼠心肌组织中组蛋白H3K9me3甲基化水平(P0.05),且Gata4 mRNA表达水平及Cx43和β-MHC的转录和翻译水平在抑制剂干预组较酒精组显著升高(P0.05)。结论:G9a-HMT介导的组蛋白甲基化修饰失衡可能参与了孕期酒精暴露所致的子代心脏发育相关基因表达异常。     

小鼠胚胎心流出道近段心室化形成右心室小梁部

目的探讨小鼠胚胎心流出道快速缩短及右心室形成机制。方法用抗α-横纹肌肌动蛋白(SCA)、抗肌球蛋白重链(MHC)抗体标记心肌,抗GATA-4抗体标记心肌及其前体细胞,抗α-平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体标记早期心肌细胞,抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体显示增殖细胞,抗人/鼠活性Caspase-3(CAS-3)抗体检测凋亡早期细胞,对胚龄9d(E9)~E12(不同胚龄胚胎各取3~5只)小鼠胚胎心连续切片行免疫组织化学染色。结果E11时动脉囊及流出道远端心肌界退却至心包腔内,GATA-4、SCA、SMA染色示第二生心区前体细胞不断分化为心肌细胞添加在心动脉端使流出道延长。小鼠胚胎心流出道于E12缩短,缩短前及缩短过程中全长未检测到CAS-3阳性细胞。E10~12时右心室及流出道近段心肌不断增生形成小梁并侵入邻近的流出道嵴内,流出道近端嵴逐渐小梁状心肌化改建为右心室壁;E12时近段间充质性流出道嵴内出现散在的SCA、SMA阳性心肌细胞及与流出道心肌相延续的SCA、SMA弱阳性心肌细胞流,这些结果表明近段流出道心肌小梁化、流出道嵴小梁状肌化形成了右心室小梁部。结论小鼠胚胎流出道近段心室化致右心室小梁部形成及流出道快速缩短,心肌细胞凋亡及转分化对流出道快速缩短的作用甚微。     

核纤层蛋白A、转录因子TBX3、缝隙连接蛋白43表达与小鼠胚胎心发育

目的 探讨小鼠胚胎心脏工作心肌和传导系心肌在形态发生和分化过程中核纤层蛋白A（lamin A）、转录因子TBX3、缝隙连接蛋白43（Cx43）的表达特点。
方法 用抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗α-横纹肌肌动蛋白（α-SCA）、抗胰岛因子1（ISL-1）、抗Cx43、抗lamin A和抗转录因子TBX3,对46只胚龄8～15d小鼠胚胎心脏连续石蜡切片进行免疫组织化学及免疫荧光染色。 结果 胚龄9d,TBX3在原始心管的表达集中在房室管壁。10d始,TBX3阳性的表达逐渐从房室管壁沿着静脉瓣延续至窦房结、右心房背侧壁和房间隔。胚龄12～13d,TBX3阳性表达结构构成了中枢传导系雏形,包括窦房结、左右静脉瓣、房间隔、房室管、房室结和房室束。Cx43首先在胚龄9d的左心室腹侧壁和部分小梁心肌出现弱阳性表达,随着发育,Cx43逐渐在TBX3阴性的心房、心室工作心肌表达。Lamin A首先出现在10d房室管心内膜垫间充质细胞和左心室部分小梁心肌,随后在右心室小梁心肌出现,至胚龄15d,心室和心房小梁心肌及房室瓣均可见lamin A阳性表达,但致密心肌和中枢传导系心肌持续呈阴性表达。 结论 中枢传导系统雏形在小鼠胚龄13d形成,呈TBX3阳性,Cx43阴性的互补性表达。致密心肌和中枢传导系心肌在15d仍为lamin A表达阴性,说明此部分心肌分化成熟较晚。     

连接蛋白43在小鼠胚胎心的时空表达规律

目的:探讨连接蛋白43 (Cx43)在小鼠胚胎心的时空表达规律及意义.方法:用抗Cx43、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)和抗横纹肌肌节肌动蛋白(α-SCA)对胚龄9～17 d小鼠胚胎心连续切片进行免疫组织化学或免疫荧光显色;免疫印迹检测胚龄11、13、15、16d和17d小鼠胚胎心组织中Cx43的含量变化.结果:胚龄9～10 d,仅在左心室腹侧壁及原始小梁最先检测到Cx43弱阳性表达.随着发育,Cx43在心房心室阳性范围逐渐扩展,阳性表达逐渐增强.而在某些特定部位,如窦房结、房室管、房室结和房室束等始终未见Cx43阳性染色.结论:Cx43在胚胎心的时空表达模式与心工作心肌和传导系心肌的发育及兴奋传导功能相适应.     

Cx43、β-catenin、Smo在第二生心区的表达规律及意义

背景：第二生心区对于胚胎心脏发育具有重要意义，其发育异常会导致多种心脏畸形，Cx43基因敲除后第二生心区细胞的形成和增殖减少，但具体原因尚未明确。目的：(1)明确β-catenin、Smo以及Cx43在内胚层与第二生心区的表达模式，观察其有无共表达；(2)探究Cx43与Wnt/β-catenin通路或Shh通路之间是否存在相互作用，共同参与第二生心区的发育。方法：选取胚龄10-12 d的ICR小鼠胚胎石蜡包埋连续切片，进行免疫组织化学染色、苏木精-伊红染色、免疫荧光染色；剥离胚龄11 d小鼠胚胎的原始消化管用于蛋白印迹实验和免疫共沉淀。结果与结论：(1)胚龄10-12 d,Cx43与Isl1在前肠腹侧和心包腔背侧壁的部分间充质细胞呈共表达，Isl1阳性细胞增多的同时Cx43阳性细胞也增多；(2)胚龄10-12 d,Cx43与β-catenin在内胚层腹侧共表达；(3)胚龄10-12 d,Cx43与Smo在内胚层上共表达；(4)免疫共沉淀结果表明Cx43与β-catenin之间存在相互作用，共同参与第二生心区的发育。     

神经嵴细胞和胰岛因子-1阳性细胞与小鼠胚胎心动脉端的发育

目的:探讨神经嵴细胞和胰岛因子-1(ISL-1)阳性细胞与小鼠胚胎心动脉端发育的关系.方法:胚龄8～12 d小鼠胚胎心连续石蜡切片,进行免疫组织化学检测.结果:α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、心肌肌球蛋白重链(MHC)、转录因子ISL-1、激活蛋白-2α(AP-2α)的表达胚龄8d,AP-2α阳性神经嵴细胞主要表达于神经褶外胚层.胚龄9～11 d,AP-2α阳性神经嵴细胞在前肠两侧沿弓动脉逐渐迁移至流出道头端心内膜垫,并形成主肺动脉隔雏形.胚龄8～10 d,ISL-1阳性细胞分布于前肠及神经沟两侧中胚层,构成第2生心区,向流出道添加心肌细胞.胚龄10～11 d,ISL-1阳性细胞在前肠腹侧正中间充质中聚集、与AP-2α阳性细胞共同参与主肺动脉隔形成.心包腔背侧脏壁中胚层及鳃弓核心间充质的ISL-1阳性细胞与流出道α-SMA或MHC阳性心肌相延续.胚龄12d,主肺动脉隔及流出道心内膜垫失去AP-2α及ISL-1阳性表达,转变为α-SMA阳性表达结构.结论:AP-2α阳性心神经嵴细胞和第2生心区来源的ISL-1阳性心前体细胞共同参与了小鼠心动脉端的形态发生.胚龄8～10 d,ISL-1阳性细胞分化为流出道心肌细胞.胚龄10～12 d,ISL-1阳性心前体细胞与AP-2α阳性细胞共同参与了主肺动脉隔的形成和流出道的分隔.     

小鼠胚胎心脏流出道嵴的发育

目的探讨小鼠胚胎心脏流出道嵴内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性细胞的来源及流出道嵴融合时间充质细胞超微结构的变化。方法用抗α-SMA、抗α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)单克隆抗体、PlexinA2探针,对胚龄10～14d小鼠胚胎心脏切片进行免疫组织化学和原位杂交染色;透射电镜观察胚龄12.5d时小鼠心流出道嵴的融合过程。结果胚龄10～11d,小鼠神经管及其周围、动脉囊和弓动脉壁可见PlexinA2阳性细胞,并沿动脉囊壁迁入流出道嵴内,部分细胞同时表达α-SMA。胚龄12d,PlexinA2阳性细胞分布在脊神经节、咽前间充质、主肺动脉隔以及主、肺动脉壁。主肺动脉隔显α-SMA强阳性,但动脉壁仅见少量α-SMA阳性细胞。胚龄12.5d,流出道嵴内致密间充质细胞团形成并开始融合,PlexinA2表达较弱,α-SMA表达呈强阳性。在流出道嵴融合开始后,嵴表面的内皮细胞带形成继而断裂消失,由含微丝少、排列稀疏的间充质细胞取代。两侧致密细胞团逐渐靠拢、融合。有的间充质细胞内含较多线粒体和微丝,细胞之间形成细胞连接点;有的间充质细胞含微丝少,细胞膜间断融合。结论流出道心内膜垫内α-SMA阳性间充质细胞来自神经嵴;内皮细胞-间充质细胞转化可能参与了流出道嵴融合;致密细胞团内间充质细胞富含微丝束和细胞连接点或发生细胞膜融合有助于流出道嵴的融合。     

Cx43在造血调控及重建中的作用

目的:采用条件性基因敲除技术构建造血系统间隙连接蛋白43(Cx43)基因敲除(Cx43~(-/-))小鼠模型,并探讨Cx43在维持造血细胞自我更新及功能稳定中的作用。方法:将引进的2对转基因小鼠Cx43 loxP/loxP和Lyz-Cre/+杂交,选取F1雌性子代Cx43 loxP/-_Lyz-Cre/+与雄性Cx43 loxP/loxP合笼回配,提取所获得子代小鼠鼠尾组织基因组DNA,采用PCR方法鉴定小鼠基因型,RT-PCR方法筛选Cx43~(-/-)小鼠,同时分析小鼠不同器官中Cx43基因的表达差异;该类小鼠经5-氟尿嘧啶(5-FU;125 mg/kg)处理,在化疗前及化疗后第5、10和15天经眼球取血分析其血象变化。Cx43~(-/-)及Cx43~(+/+)小鼠予7.5 Gy(~(60)Co-γ)的致死量照射,剂量率1 Gy/min,照射后6 h分别给予事先准备就序的骨髓细胞,每只3×10~6细胞于尾静脉注入,2周后处死小鼠检测造血是否重建:分离股骨切片后,收集骨髓细胞进行细胞表型分析(选用的单抗为CD45R、Gr-1、CD4、 CD8a、TCRαβ、Mac-1、抗sIgM、TER119、Sca-1及CD117);同时进行体外造血细胞集落实验观察造血细胞的体外增殖能力。结果:本研究通过2种转基因小鼠间杂交和回交,成功获得造血系统选择性Cx43基因敲除小鼠;该类小鼠骨髓及外周血细胞无Cx43表达,参与造血的组织,如肝脏和脾脏中Cx43表达也显著下调(P0.01),而心脏和肾脏的Cx43表达则无影响,小鼠成年后外周血象分析并无明显异常,但应急代偿能力下降,经5-FU处理后,其造血功能恢复显著减缓,处理15 d后,Cx43~(+/+)小鼠造血功能已接近正常水平,而Cx43~(-/-)小鼠仍无明显的恢复迹象,血红蛋白、白细胞及血小板仍处低位,2者差别有统计学显著性(P0.01);体外集落试验也证实Cx43~(-/-)小鼠造血干/祖细胞的增殖能力下降,其CFU-GM或CFU-E集落数均明显少于Cx43~(+/+)小鼠(P0.01),但流式细胞术结果显示,Cx43~(-/-)小鼠骨髓中Lin~-/c-Kit~+/Sca-1~+细胞亚群数量与Cx43~(+/+)小鼠相比差异并无统计学显著性;Cx43~(-/-)小鼠在化疗或移植后其骨髓造血功能重建均延迟,且化疗15 d后骨髓切片及涂片均证实其骨髓中造血细胞增生程度明显降低,脂肪组织显著增多,而且T、B细胞发育也有异常。此外,其外周血中CD4~+CD8~+细胞比例比野生型小鼠增多(P0.05),但CD4~+T细胞显著减少(P0.01),尤其是TCRαβ亚群细胞减少最为明显(P0.01)。同样,Cx43~(-/-)小鼠外周血中CD45R~+sIgM~-细胞亚群比例与野生型小鼠相比显著减少(P0.01)。结论:骨髓中Cx43基因表达在造血干/祖细胞发育(尤其是应急状态时)具重要作用,敲除Cx43基因后造血干/祖细胞增殖减缓,造血及免疫重建功能受损。     

呼吸内胚层相关第二生心区与小鼠胚胎流出道远端的形态发生

目的探讨小鼠胚胎呼吸内胚层相关第二生心区(PSHF)发育与流出道远端形态发生的关系。方法用免疫蛋白印迹法检测抗胰岛因子-1(ISL-1)在80例胚龄10~14 d小鼠胚胎心脏标本的表达。另用抗ISL-1、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及抗心肌肌球蛋白重链(MHC)抗体,对36例胚龄11~13 d小鼠胚胎心连续石蜡切片进行免疫组织化学或免疫荧光染色。结果胚龄11~12 d是ISL-1蛋白在小鼠胚胎心脏表达的高峰时段。胚龄11 d,来自鳃弓或心包腔背侧壁等处PSHF的ISL-1阳性细胞延伸进入流出道远端管壁,流出道远端管壁则失去MHC表达,呈α-SMA阳性表达;来自PSHF的ISL-1阳性细胞则围绕呼吸内胚层呈对称性锥体结构分布,锥体顶端突入动脉囊腔呈ISL-1阳性突起。胚龄11.5 d,PSHF锥体顶端进入动脉囊头侧和尾侧管壁,形成流出道远端管壁上对称的ISL-1阳性柱结构;而动脉囊腔尚未分隔,流出道远端仍为单一管道。胚龄12 d,PSHF锥体突起失去ISL-1表达,呈较强的α-SMA表达。在PSHF锥体突起与流出道嵴融合前,两者之间出现主-肺动脉孔;两者融合后则形成α-SMA阳性的暂时性主-肺动脉隔,将动脉囊分隔成MHC阴性的心包内的主动脉和肺动脉。胚龄13 d,主-肺动脉隔逐渐消失,心包内主动脉和肺动脉分离。在MHC阴性的心包内大动脉管壁上出现了α-SMA阳性的平滑肌层,仍可见少量PSHF的ISL-1阳性细胞延伸进入心包内大动脉管壁。结论在小鼠胚胎发育11~13 d,PSHF将动脉囊分隔成心包内的主动脉和肺动脉,并参与心包内大动脉的侧面管壁和对侧面管壁的分化形成。     

胰岛素增强子结合蛋白1在小鼠胚胎心的时空分布

目的 观察转录因子胰岛素增强子结合蛋白1（ISL1）在小鼠胚胎心的表达与心、第二生心区及前肠内胚层的发育。 方法 胚龄8～13d小鼠胚胎心共18个,连续石蜡切片,用抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗ISL1、抗增殖细胞核抗原（PCNA）和抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体进行免疫组织化学染色、免疫荧光染色和Western blotting检测。 结果 胚龄9d,ISL1阳性心前体细胞进入流出道远端。胚龄10d,ISL1阳性细胞延伸入流出道近端及静脉窦心肌。胚龄11～12d,心内ISL1表达量逐渐增多并达高峰,动脉端ISL1阳性细胞分布于流出道远端壁、心包内主肺动脉壁及主肺动脉隔,静脉端ISL1阳性细胞主要限于窦房结和静脉瓣。动脉端前肠内胚层细胞索增至最长,周围前生心区ISL1阳性细胞密度也达高峰,并且明显多于后生心区。胚龄13d,心内及第二生心区ISL1阳性细胞显著减少,内胚层细胞索趋于消失。 结论 ISL1阳性细胞在小鼠胚胎心的表达主要集中在胚龄9～13d,其表达模式与第二生心区及前肠内胚层的发育密切相关。     

TGF-β1/Smad通路在血管紧张素Ⅱ下调缝隙连接蛋白43表达中的作用

目的:分析心肌梗死(MI)后心脏组织中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、缝隙连接蛋白43(Cx43)和转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad通路相关因子的变化情况,以探讨AngⅡ能否经由TGF-β1/Smad调节Cx43的表达。方法:采用左前降支冠状动脉(LAD)结扎建立大鼠心肌梗死模型后,20只SD雄性大鼠随机分为氯沙坦(20 mg·kg~(-1)·d~(-1))治疗组与MI组,分别于结扎后及治疗2周后检测心功能情况,并检测治疗2周后左室心肌组织不同区域AngⅡ、AngⅡ1型受体(AT1)、Cx43以及TGF-β1/Smad通路相关分子的变化情况。结果:氯沙坦组左室舒张末期内径(LVIDd)和左室收缩末期内径(LVIDs)明显缩小(P0.01),室间隔厚度(IVSd)及左室后壁厚度(LVPWd)明显减小(P0.05),左室射血分数(LVEF)显著增加(P0.01);梗死区和边缘区的AngⅡ水平明显降低;梗死区AT1表达显著降低;Cx43在心肌组织不同区域表达增高,TGF-β1、Smad 2、Smad 3在心肌组织不同区域表达均降低,而Smad 7表达增高。结论:心肌梗死后AngⅡ激活可能通过作用于TGF-β1/Smad通路导致Cx43表达下调。     

雌激素改善卵巢切除合并慢性铝中毒对大鼠心脏Cx43表达和金属元素变化的影响

目的 探讨雌激素治疗卵巢切除合并慢性铝中毒大鼠,对心脏间隙连接蛋白43(Cx43)表达和金属离子含量的影响. 方法 40只6月龄雌性SD大鼠,随机分为卵巢假切除组(Sham组),卵巢切除组(OVX组)、卵巢切除合并慢性铝中毒组(OVX+Al组)和卵巢切除合并慢性铝中毒及尼尔雌醇灌胃组(OVX+Al+E2组).于术后3个月,利用离子体发射光谱仪测定心脏金属元素含量,采用免疫组织化学和图像分析法观测心肌细胞Cx43表达.结果 1. Cx43表达:Sham组心房肌Cx43遍布于心肌细胞侧面连接和端闰盘处.心室肌分布于心肌闰盘处.OVX组心房肌的Cx43颗粒部分由细胞侧-侧连接处移至闰盘处或杂乱排列,心室肌Cx43由闰盘处移至细胞侧-侧连接处或杂乱地无序排列,少部分出现在细胞质中,OVX+Al组Cx43排列类似于OVX组,且更加紊乱.OVX+Al+E2组心房肌Cx43回复正常分布,但心室肌未发现回复.2.图像分析结果,各组大鼠心肌细胞Cx43的面积构成比比较无显著差异.3.金属元素含量:在Sham组,金属元素在心脏含量的排列顺序如下:Mg＞Ca＞Fe＞Zn＞Al＞Si＞Cu＞Mn＞Se和Cd.各组间比较具有显著差异的是:与Sham组比较,OVX组Zn降低;OVX+Al+E2组Al、Cd、Si、Se均升高;OVX+Al组与OVX组比较,Si升高、Zn降低.OVX+Al+E2组与OVX+Al组比较, Cd、Mn、Se升高. 结论雌激素改善卵巢切除及加铝后引起的心脏金属元素含量改变和心肌细胞间隙连接蛋白Cx43重构.     

小鼠心脏发育过程中Cx43表达的时空变化

目的：探讨小鼠心脏发育过程中连接蛋白43（connexin43，Cx43）表达的时空变化。方法：应用SP免疫组化和图像分析方法，观测胎小鼠、出生1d、6d、2月和14月小鼠心肌细胞Cx43的表达。结果：1、胎小鼠和出生1d小鼠心肌细胞Cx43呈斑点状遍布于心肌细胞侧-侧连接和细胞质内，闰盘处极少。2、出生6d时Cx43开始向端闰盘处聚集，2月和14月小鼠心室肌细胞Cx43已经典型分布于闰盘处，而心房仍分布于细胞侧面连接处和细胞质。3、分布密度总规律是：胎小鼠〈出生1d〈6d〉2月〉14月。结论：小鼠心肌细胞Cx43分布随心脏发育逐渐向闰盘处重排，其密度逐渐下降。心房肌Cx43的表达与分布具有一定的幼稚性。     

Expression patterns of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation 4, connexin 43 and podoplanin in the embryonic mouse heart and development of cardiac conduction system

目的 探讨小鼠胚胎心传导系的发生机制. 方法 用抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗超级化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)、抗缝隙连接蛋白43( CX43)和抗平足蛋白(podoplanin)抗体,对40只胚龄9～16d小鼠胚胎心进行连续石蜡切片并免疫组织化学或免疫荧光染色. 结果 胚龄9d,较强的HCN4阳性表达集中在MHC阴性的静脉窦壁,随心脏发育,HCN4较强阳性表达逐渐向窦房结转移.胚龄11d开始,CX43阴性表达显示部位特异性.CX43阴性染色经窭房结沿右心房背侧壁和左、右静脉瓣向房室管背侧壁延伸.胚龄13d,左、右静脉瓣与房间隔底部融合后,进一步延续为房室管背侧壁发育中的CX43阴性染色的房室结,继而与室间隔顶部CX43阴性的房室束相连.胚龄9～ 10d,在MHC阳性心肌、心包腔背侧壁脏壁中胚层心肌前体细胞及静脉窦周间充质均显示podoplanin阳性表达.胚龄11 ～13d,podoplanin阳性间充质细胞沿心脏外表面扩展形成podoplanin阳性间皮样心外膜. 结论 心脏发育早期,主起搏点位于静脉窦壁,起搏电位的产生早于收缩功能的发生.CX43阴性心肌是发育中的心传导系心肌,在胚龄11d即可观察到心传导系早期雏形.podoplanin参与促进心肌前体细胞向心肌细胞的分化.     

体外电刺激诱导大鼠骨髓间充质干细胞心肌特异性标志物MEF-2C和Cx43的表达

骨髓间充质干细胞(BMSCs)由于具有向心肌方向分化的潜能,目前已成为一种新的能够修复心脏组织损伤的重要治疗选择。在本实验中我们探讨了体外不同的电刺激时间对BMSCs向心肌方向分化的影响。实验共分为三组:1电刺激组,完全培养基培养的大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)受到电压为2V,频率为2 Hz,脉宽为5ms的电刺激,作用时间为30min/d、2h/d、4h/d、6h/d,连续作用10d;25-氮胞苷(5-Aza)组,5-Aza(10μmol/L)诱导rBMSCs 24h,然后采用完全培养基培养10d;3空白对照组,完全培养基静态培养rBMSCs 10d。通过实时荧光定量PCR方法检测各组rBMSCs的肌细胞特异性增强因子-2C(MEF-2C)mRNA和缝隙连接蛋白43(Cx43)mRNA的表达;通过Western blot方法检测各组rBMSCs的MEF-2C蛋白和Cx43蛋白的表达。实验结果显示:不同持续时间的电刺激组及5-Aza组的MEF-2CmRNA、Cx43mRNA表达量及MEF-2C蛋白、Cx43蛋白表达量均明显高于空白对照组(P0.05)。本实验结果提示,体外电刺激可以诱导rBMSCs向心肌方向分化,其中2h/d作用效果最佳,但其机制尚未明确。     

Notch2信号参与调控小鼠胚胎心脏主动脉与肺动脉瓣膜的发育

背景：先天性心脏畸形常表现为动脉瓣膜发育异常,其中以主动脉瓣二叶式畸形最常见,但目前对于胚胎主、肺动脉瓣膜的具体发育过程有待阐明。目的：探讨小鼠胚胎心脏流出道的分隔与主、肺动脉瓣膜原基形成及其重塑过程。方法：2月龄SPF级健康ICR小鼠雌鼠16只、雄鼠10只,于每日晚18:00以雌雄2∶1的比例进行合笼,次日6:00发现阴栓者记为妊娠0.5 d。选取胚龄9.5-15 d的小鼠胚胎石蜡包埋连续切片,免疫组织化学染色观察胚龄9.5-15 d的小鼠胚胎心脏Isl1、Nkx2.5、肌球蛋白重链、Ap2α、Sox9、α-平滑肌肌动蛋白、Snail、Jag1、Notch2、Alk3和p-Smad1/5/8的蛋白表达;心脏的三维重建观察流出道心内膜垫和插入垫的变化以及瓣膜的形态。结果与结论：(1)胚龄9.5-10.5 d小鼠胚胎,流出道内皮细胞经过上皮-间充质转化形成心胶质内的间充质细胞,参与形成流出道心内膜垫;胚龄11-11.5 d,咽前Isl1阳性细胞延伸入流出道壁形成插入垫,此过程未发生上皮-间充质转化;Notch2信号参与流出道心内膜垫形成过程但未参与插入垫的形成;(2)胚龄12.5 d,流...