知母皂苷AⅢ酶解工艺优选

目的:优选知母皂苷AⅢ的酶解工艺。方法:采用β-葡萄糖苷酶水解知母皂苷制备知母皂苷AⅢ,以知母皂苷AⅢ转化率为指标,通过单因素和正交试验考察反应温度、反应时间、pH及酶用量对知母皂苷AⅢ酶解工艺的影响。结果:最佳酶解工艺条件为温度55℃,pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液,酶用量600 U.g-1,反应时间3 h。结论:优选的酶解工艺简单可靠,反应条件温和,适用于工业化生产。     

鲜人参皂苷β-葡萄糖苷酶生物转化研究

目的研究β-葡萄糖苷酶对鲜人参皂苷粗提物和乙酰氨基葡萄糖的生物转化过程。方法利用高效液相色谱与电喷雾质谱联用技术分析鉴定了3种不同生物转化工艺的产物类型。结果不同的酶法转化工艺,鲜人参皂苷得到的产物不同。3种工艺下都能发生β-葡萄糖苷酶对鲜人参皂苷抽提物的水解反应,但只有第2种工艺发生了N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖的转移反应,所得到的新的N-乙酰氨基糖代皂苷化合物转化率较高,第1种工艺和第3种工艺主要发生的β-葡萄糖苷酶的酶水解反应。结论在β-葡萄糖苷酶和人参皂苷混合24h,再添加乙酰氨基葡萄糖,可形成新的氨基皂苷,经过电喷雾HPLC-ESI-MS分析,[M+Na]+979.9,[M+K]+995.6,M.W 957.6。     

知母皂苷AⅢ药理活性及机制研究进展

对知母皂苷AⅢ的药理作用及机制研究进展进行综述。知母皂苷AⅢ是知母的最主要活性成分之一。研究表明,知母皂苷AⅢ具有改善学习和记忆障碍、抑制血小板聚集和血管扩张、抗肿瘤、降糖、降血压、抗炎、抗氧化、抗辐射、抗病毒和抗真菌等药理活性。     

大豆皂苷对α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

目的：研究大豆皂苷对α-葡萄糖苷酶(EC3．2．1．20)的抑制作用。方法：以C18反相柱层析和高效液相色谱法从大豆胚轴分离大豆皂苷，比色法测定大豆皂苷单体对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果：大豆皂苷具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制作用，且表现为非竞争性抑制作用。其中B类、E类和DDMP皂苷的抑制作用为最强，其半抑制浓度(IC50)值为10-40μmol／L；A类皂苷的抑制作用则较弱。结论：大豆皂苷是α-葡萄糖苷酶抑制剂，经常食用可能有助于延缓糖尿病患者餐后血糖的持续升高。     

知母皂苷对小鼠血糖的影响

目的:研究知母皂苷对正常小鼠和糖尿病小鼠糖耐量及空腹血糖的影响,探讨其降糖作用机制.方法:测定知母皂苷对α-葡萄糖苷酶活性的抑制;正常小鼠口服给药,测定空腹血糖和糖耐量;四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型口服给药,测定空腹血糖及糖耐量.结果:知母皂苷对正常小鼠无降血糖作用,但可使糖耐量曲线趋于平缓;知母皂苷能够显著提高糖尿病小鼠糖耐量,降低实验性糖尿病小鼠的空腹血糖.结论:知母皂苷具有一定的降糖作用.     

β-葡萄糖苷酶水解黄芪甲苷的研究

目的采用β-葡萄糖苷酶水解黄芪甲苷,并对其酶水解动力学进行初步研究。方法以HPLC-ELSD法检测水解液中黄芪甲苷及水解产物环黄芪醇-6-O-β-D-葡萄糖苷(CMG)的量,以黄芪甲苷的水解转化率为指标,考察各反应因素对转化率的影响,并对该反应进行动力学研究。结果最佳反应条件为反应温度50℃,溶液pH值5.0,酶浓度460 U/mL,底物初始浓度0.1 mmol/L,反应时间48 h;在此条件下,水解转化率达到90%以上。在最佳反应条件下,该水解反应过程符合单底物Michaelis Menten方程,其中最大反应速率(Vm)值为0.037 mmol/(L.min),米氏常数(Km)值为5.8 mmol/L。结论采用β-葡萄糖苷酶水解黄芪甲苷制备CMG可行;商品化的β-葡萄糖苷酶并非黄芪甲苷的特异性水解酶。     

知母皂苷AⅢ调控miR-494对原发性皮肤黑色素瘤生物学行为的影响

目的:探讨知母皂苷AⅢ调控miR-494对原发性皮肤黑色素瘤增殖、迁移和侵袭的影响。方法:体外培养人黑色素瘤A375细胞,分别用0、4、8、16 μmol/L的知母皂苷AⅢ处理A375细胞24 h。将miR-NC、miR-494转染至A375细胞,作为miR-NC、miR-494组; 将anti-miR-NC、anti-miR-494转染至A375细胞,再用知母皂苷AⅢ(16 μmol/L)干预,作为anti-miR-NC+16 μmol/L组、anti-miR-494+16 μmol/L组。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞增殖情况; 蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达; Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况; 实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)检测细胞miR-494表达水平。结果:与对照组比较,8、16 μmol/L中、高剂量组的知母皂苷AⅢ明显下调组细胞A值、迁移数量和侵袭数量以及Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05)。与对照组比较,8 μmol/L中剂量组、16 μmol/L高剂量组的知母皂苷AⅢ明显上调细胞miR-494表达水平(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-494组细胞A值、迁移数量和侵袭数量以及Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显降低(P<0.05)。与anti-miR-NC+16 μmol/L组比较,anti-miR-494+16 μmol/L组细胞miR-494表达水平显著降低; 细胞A值、迁移数量和侵袭数量以及Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:知母皂苷AⅢ上调miR-494抑制原发性皮肤黑色素瘤增殖、迁移和侵袭。     

盐酸阿霉素和知母皂苷AⅢ共载脂质体的制备及包封率的测定

目的建立盐酸阿霉素和知母皂苷AⅢ共载脂质体包封率的测定方法。方法采用薄膜分散法制备盐酸阿霉素和知母皂苷AⅢ共载脂质体,分别用透析法、微柱离心法和超高速离心法分离脂质体和游离药物,采用HPLC法测定游离药物含量和脂质体中的药物含量,计算得出盐酸阿霉素和知母皂苷AⅢ的包封率。结果确定盐酸阿霉素和知母皂苷AⅢ共载脂质体处方为DPPC-DSPE-PEG2000-TAⅢ-DOX比例为5∶1∶1∶1,采用薄膜分散法制备的脂质体大小适中,粒径为(55.4±0.40)nm,PDI为0.20±0.02,电位为(-17.4±0.6)mV;在所选的色谱条件下,脂质体的其他组分不干扰样品的测定,盐酸阿霉素在24.9～498.0μg/mL(r=0.999 9),知母皂苷AⅢ在50.55～1 011.00μg/mL(r=0.999 6)线性关系良好。研究结果表明微柱离心法能有效地将盐酸阿霉素和知母皂苷AⅢ双载脂质体与游离药物分离,测得的包封率分别为(85.12±1.27)%、(76.51±0.46)%。结论薄膜分散法可用于盐酸阿霉素和知母皂苷AⅢ共载脂质体的制备;微柱离心法准确度高、重复性好并快捷方便,可用于包封率的测定。     

知母皂苷AⅢ抑制人脑胶质瘤增殖生长的机制研究

考察知母皂苷AⅢ抑制人脑胶质瘤U87MG细胞增殖的作用及机制分析。在裸鼠皮下荷瘤模型中,知母皂苷AⅢ组与模型组相比,显著降低瘤重。知母皂苷AⅢ呈剂量依赖性抑制U87MG细胞的体外增殖;呈剂量依赖性降低β-Catenin,Cyclin D1,Bcl-2的蛋白表达,同时升高p21在蛋白和基因水平的表达;降低ERK磷酸化水平,抑制β-Catenin的核转移,同时提高p38和JNK蛋白的磷酸化水平。联用JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB203580后可逆转知母皂苷AⅢ处理而提高的p21和降低的β-Catenin的蛋白表达。知母皂苷AⅢ部分通过干预MAPK及Wnt/β-Catenin信号通路而抑制脑胶质瘤U87MG的增殖。     

HPLC-ELSD 法测定滋肾通关胶囊中2种知母皂苷类成分

目的：采用HPLC-ELSD法测定滋肾通关胶囊中知母皂苷BⅡ、AⅢ的含量,为其质量标准的建立提供依据。方法：采用KromasilC18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）,以乙腈-水为流动相梯度洗脱,流速为1.0mL/min,漂移管温度为115℃,载气流速为3L/min。结果：知母皂苷BⅡ和AⅢ进样量分别在0.53～21.28μg和0.54～21.36μg范围内呈良好的线性关系,精密度、重复性、稳定性的RSD均低于3%,加样回收率为103.9%和98.7%,滋肾通关胶囊中知母皂苷BⅡ和AⅢ的含量分别为0.44%和0.32%,知母药材中这两种成分的含量分别为1.19%和0.59%。结论：本研究建立了同时测定滋肾通关胶囊及知母药材中知母皂苷BⅡ和AⅢ含量的方法,为滋肾通关胶囊及知母药材质量标准的建立和完善提供了参考。     

知母皂苷AⅢ抑制小鼠脑胶质瘤细胞GL261增殖的蛋白质组学研究

目的 利用蛋白质组学技术考察知母皂苷AⅢ抑制小鼠脑胶质瘤细胞GL261(简称“GL261细胞”)增殖的分子机制。方法 (1)将GL261细胞分为空白对照组(知母皂苷AⅢ0μmol/L)和不同剂量知母皂苷AⅢ给药组(1、2、4、6、8、10μmol/L),同时设置溶媒对照组[0.05%二甲基亚砜(DMSO)]和阳性药物组(紫杉醇,1μmol/L),按照分组分别将药液加入含10%胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基中,混匀依次加入96孔板中,孵育72 h,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测各组细胞存活率。(2)将GL261细胞分为空白对照组、知母皂苷AⅢ给药组(3.5、7μmol/L),按照分组分别将药液加入含10%FBS的DMEM中,混匀后依次加入96孔板中,孵育24 h,采用平板克隆法测定细胞的克隆形成,流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用蛋白质组学技术分析潜在的靶标蛋白和相关的信号通路,并使用蛋白免疫印迹法对关键蛋白进行验证。结果 与空白对照组比较,知母皂苷AⅢ呈剂量依赖性显著抑制GL261细胞活力和克隆形成,同时诱导GL261细胞凋亡(P<0....     

知母皂苷AⅢ对黑色素瘤B16细胞生长和Bax,Bcl-2 mRNA的影响

目的观察知母皂苷AⅢ对体外培养黑色素瘤B16细胞增殖和凋亡的影响。方法体外培养B16细胞,分别以浓度为1,2,4,8,16μmol·L-1的知母皂苷AⅢ作用24 h,通过MTT比色法检测对细胞生长的影响;倒置显微镜观察对细胞形态的影响;Annexin V-FITC/PI双染流式检测对细胞凋亡的影响;逆转录PCR检测对细胞凋亡相关基因Bax,Bcl-2的影响。结果 8,16μmol·L-1的知母皂苷AⅢ明显抑制细胞增殖,24 h的半数抑制浓度(IC50)为10.16μmol·L-1;细胞形态显示16μmol·L-1的知母皂苷AⅢ使细胞体积缩小变圆,细胞减少。与对照组比较,10μmol·L-1知母皂苷AⅢ细胞凋亡率为(4.83±0.25)%(P0.01),而Bax/Bcl-2比值升高(P0.05)。结论体外实验显示知母皂苷AⅢ能明显抑制B16细胞生长,并能诱导部分细胞发生凋亡。由于诱导细胞凋亡率与24 h的IC50有一定差距,因此知母皂苷AⅢ对B16细胞生长的影响可能不仅仅与激活凋亡信号通路有关,还与其他细胞生长信号通路有关。     

HPLC-ELSD法同时测定知母药材中2种皂苷含量

目的:用HPLC-ELSD同时测定知母药材中2种皂苷的含量.方法:采用Kromasil C12柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以甲醇-水梯度洗脱,流速1 mL·min-1,柱温为30℃.蒸发光散射检测器漂移管温度50℃,蒸发温度70℃,以氮气为雾化气,压力为1.03×105Pa.结果:知母皂苷C在0.310～3.10 μg,知母皂苷AⅢ在0.323～3.23μg,进样质量的对数值与峰面积的对数值呈良好的线性关系.知母皂苷C回归方程为lgA=1.25421gM+5.734.7,r=0.9995,测定的平均回收率(n=6)98.1%,RSD2.0%;知母皂苷AⅢ回归方程为lgA=1.32841gM+5.937,r=0.9996,测定的平均回收率(n=6)97.3%,RSD1.5%.结论:建立的含量测定方法准确、快速,是控制知母药材质量较理想的方法.对我国北方主要知母产地药材中两种皂苷含量测定和比较表明不同产地野生知母质量差异较大.     

知母皂苷AⅢ对白血病细胞HL-60增殖、凋亡和细胞周期的影响及机制探讨

目的探讨知母皂苷AⅢ对人白血病细胞HL-60增殖、凋亡和细胞周期的影响及可能机制。方法对照组应用未加药的完全培养基培养,实验组分别采用10、50、100 nmol/L知母皂苷AⅢ处理,分别采用水溶性四氮唑(WST-1)法、流式细胞术双标法、分光光度法、流式细胞术单标法及蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞存活率、凋亡率、半胱天冬酶-3(Caspase-3)活化水平、细胞周期分布及相关通路蛋白表达情况。结果知母皂苷AⅢ在10~100 nmol/L范围内可抑制HL-60细胞的增殖,且与对照组相比,实验组HL-60细胞的存活率均降低(P0.05);与对照组相比,实验组处理24、48 h后的凋亡率及Caspase-3活化率均升高,处理48 h后的G0/G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低(P0.05);与对照组相比,100 nmol/L知母皂苷AⅢ处理后磷酸酶基因(PTEN)蛋白水平升高,而蛋白激酶B(Akt)、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和原癌基因(C-myc)水平均降低(P0.05)。结论知母皂苷AⅢ对人白血病细胞HL-60有细胞毒性作用,主要体现在抑制增殖、诱导凋亡和细胞周期阻滞方面,其机制可能与该药物抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/Akt和Wnt/β-catenin通路有关。     

鲜地黄中α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的提取与初步纯化

目的:从鲜地黄中提取并初步纯化α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。方法:以总酶活为考察指标,通过正交试验确定两种酶的最佳提取条件。以酶活力和蛋白质含量为考察指标,确定两步盐析法的硫酸铵饱和度。结果:提取温度和溶剂量对α-Gal的提取具有显著性影响,而提取溶剂对-βG lu的提取具有显著性影响,因此确定以3倍量(v/w)磷酸盐缓冲液,4℃提取4 h为两种酶的最佳提取条件。以30%和60%为两步盐析的最佳硫酸铵饱和点。结论:鲜地黄中存在α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶,两步盐析法可以使二者得到初步纯化。     

蒺藜皂苷对大鼠小肠α-葡萄糖苷酶的抑制作用

目的:研究蒺藜皂苷(STT)对大鼠小肠α-葡萄糖苷酶的抑制作用及对餐后血糖水平的影响。方法:提取大鼠小肠α-葡萄糖苷酶,测定STT对其活性的抑制作用;一次性灌胃蔗糖(2 g.kg^-1)或葡萄糖(2 g.kg^-1),同时灌胃STT(100 mg.kg^-1),测定60 min后血糖水平的变化;每天一次性灌胃STT(100 mg.kg^-1),连续14 d,测定小肠α-葡萄糖苷酶活性以及灌胃蔗糖(2 g.kg^-1)60 min后血糖水平的变化。结果:0.1,1,10 mg.mL^-1的STT能够显著抑制α-葡萄糖苷酶的体外活性(P<0.001),抑制率分别为(20.83±1.66)%,(43.73±2.39)%和(52.62±2.69)%;STT显著抑制大鼠一次性灌胃蔗糖60 min后血糖水平的升高(P<0.01),变化幅度为对照的(52.61±6.24)%,但对灌胃葡萄糖没有作用;连续灌胃STT 14 d后,α-葡萄糖苷酶活性显著低于对照(P<0.05),为对照的(58.17±3.24)%,灌胃蔗糖60 min后血糖变化幅度为对照的(69.50±4.28)%(P<0.05)。结论:STT抑制大鼠餐后血糖水平的升高,是由其对小肠α-葡萄糖苷酶的抑制作用实现的。     

知母皂苷B-Ⅱ抑制秀丽隐杆线虫Aβ蛋白毒性作用及机制研究

目的 探究知母皂苷B-Ⅱ(timosaponin B-Ⅱ,TSB-Ⅱ)对秀丽隐杆线虫体内β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积的作用及可能机制.方法 以转基因线虫CL4176为模型,考察TSB-Ⅱ对线虫瘫痪、寿命、氧化应激和热应激、活性氧水平、Aβ体外聚集等实验的影响,蛋白点印记分析观察药物对线虫体内Aβ聚集情况...     

知母皂苷AⅢ调控代谢抗脑胶质瘤生长的机制研究北大核心CSCD

该研究利用非靶向代谢组学技术考察知母皂苷AⅢ(timosaponin AⅢ, TIA)干预脑胶质瘤原位荷瘤小鼠血清中的代谢物变化,探究脑胶质瘤颅内生长及TIA干预的代谢相关机制。小鼠随机分为空白组、脑胶质瘤原位荷瘤模型组及TIA组。HPLC-LTQ-Orbitrap Elite液质联用检测以上3组小鼠处理4周后各组小鼠血清中的代谢产物变化,对检测到的代谢物进行主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)后,根据变量重要性投影(variable important in projection, VIP)和P(P<0.05)遴选差异代谢物。结果显示,TIA显著抑制脑胶质瘤的体内生长,对体质量影响不大。血清样本组间可明显区分,与空白组相比,模型组中神经酰胺、琥珀酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、硫酸吲哚酚、3a, 6b, 7b-三羟基-5b-胆酸共6个差异代谢物的水平均降低。与模型组相比,TIA组中5种差异代谢物,除苯酚硫酸盐含量降低之外,PC[20:4(5Z,7E,11Z,14Z)-OH(9)/DiMe(9,3)]、邻棕榈酰肉碱、α-酮戊二酸、柠檬酸的水平均显著提高。通过MetaboAnalyst进行通路分析,以上差异代谢物富集于三羧酸循环,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径。结果表明,脑胶质瘤在颅内生长过程中α-酮戊二酸、柠檬酸等代谢物水平降低,TIA通过调控三羧酸循环,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径,提高α-酮戊二酸、柠檬酸等代谢产物水平,发挥抗脑胶质瘤颅内生长的作用。     

知母皂苷对Aβ25-35引起小脑颗粒细胞损伤的保护作用及其机制探讨

目的 观察知母皂苷对淀粉样β蛋白25-35( Aβ25-35)激活小鼠巨噬细胞引起小脑颗粒细胞损伤的保护作用及探讨其作用机制.方法 小鼠小脑颗粒细胞与腹腔巨噬细胞联合培养及腹腔巨噬细胞单独培养,损伤组加入Aβ25-35( 20μmol/L),保护组同时加入不同质量浓度知母皂苷(10、30、100μmol/L).联合培养的细胞通过免疫组化染色观察微管相关蛋白-2( MAP-2)的表达和测定乳酸脱氢酶(LDH).单独培养的巨噬细胞用ELISA法和Griess法分别测定培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和一氧化氮(NO).Western blot检测巨噬细胞磷酸化p38MAPK表达水平.结果 知母皂苷组可使MAP-2表达阳性的小脑颗粒细胞数目较Aβ25-35组明显增加,LDH漏出量减少;巨噬细胞培养液中IL-1β和NO生成量减少以及巨噬细胞磷酸化p38MAPK表达水平明显降低.SB203580也能抑制Aβ25-35引起的IL-1β和NO生成量增加.结论 知母皂苷通过抑制Aβ25-35激活巨噬细胞p38MAPK通路,使IL-1β和NO表达水平降低,从而对小脑颗粒细胞起到保护作用.     

知母甾体总皂苷中知母皂苷BⅡ的鉴别及含量测定

目的建立知母甾体总皂苷提取物中知母皂苷BⅡ的TLC鉴别及HPLC含量测定的方法。方法 TLC法:展开剂:正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)的上层溶液,显色剂:香草醛硫酸试液,105℃加热至斑点清晰。HPLC-ELSD法:采用Agilent HC-C18(5μm,4.6 mm×250 mm),流动相:甲醇-水梯度洗脱,流速:1 ml.min-1,漂移管温度40℃,载气压力3.5 bar。结果知母皂苷BII成分的TLC分离效果较好;HPLC法测得知母皂苷BII进样量在0.506～10.12μg范围内呈良好的线性关系;平均回收率(n=6)为97.44%,RSD为1.67%。结论该方法简便准确,可用于知母甾体总皂苷提取物的质量控制。