产地对蟾酥鲜浆成分组成影响的研究

目的:研究不同产地蟾酥鲜浆中成分组成的差异,探讨蟾酥药材质量差异较大的原因。方法:采用高效液相色谱法测定不同产地的蟾酥鲜浆中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵3种蟾毒配基类成分的含量,比较不同产地蟾酥鲜浆液相色谱图谱的相似性。结果:不同产地蟾酥鲜浆中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵含量及三者之间的组成比例和液相色谱图谱有较大的差异。在不考虑加工过程对成分影响的前提下,只有山东、辽宁、安徽产的蟾酥符合《中国药典》的规定,且液相色谱图谱相似度较大。结论:不同产地的蟾酥鲜浆成分组成存在明显的差异,应完善蟾酥的质量控制体系,保证其用药的安全性和有效性。     

蟾酥适宜初加工方法研究

目的:通过评价不同的干燥方法对蟾酥药材质量的影响,确定蟾酥适宜初加工方法。方法:采用8种不同的干燥方法(17℃风干、60℃烘干、80℃烘干、105℃烘干、120℃烘干、阴干、晒干、冷冻干燥)处理鲜蟾酥样品,观察干蟾酥的外观色泽,同时利用HPLC对干蟾酥的沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基等指标进行测定。结果:热风干燥80℃以上能够显著降低蟾酥中沙蟾毒精的含量,同时随着温度升高,蟾酥颜色逐渐变深,但对远华蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基没有显著影响。结论:综合考虑含量、外观色泽、加工效率等因素,蟾酥适宜初加工方法为60℃热风干燥,得到的干蟾酥质量好,加工效率也较高。     

温度、光照及pH对蟾酥提取液中指标成分稳定性的影响

目的:考察温度、光照及pH对蟾酥提取液中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、总蟾毒色胺稳定性的影响。方法:采用HPLC测定蟾酥提取液中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量,检测波长296 nm,流动相乙腈-水(58∶42);利用UV测定蟾酥提取液中总蟾毒色胺的含量,检测波长559 nm。分别考察高温(60,40℃),强光照射[(4 500±500)Lx]及不同pH(40℃,pH分别为4.32,4.99,5.73,6.47,6.97,7.75)条件下蟾酥提取液放置0,5,10 d后华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、总蟾毒色胺的含量变化。结果:60℃条件下放置10 d后3种指标成分降解率均5%;40℃及(4 500±500)Lx条件下华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的降解率均5%;总蟾毒色胺在上述条件下的降解率均5%。华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、总蟾毒色胺分别在pH 5.73,6.47,6.47时降解最慢。结论:蟾酥提取液中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基受高温及强光照射的影响较小,总蟾毒色胺受高温及强光照射的影响较大;pH是影响蟾酥提取液中3种指标成分稳定性的主要因素,不同pH条件对3种指标成分的稳定性有不同程度的影响。     

蟾酥不同干燥方法比较研究

目的:研究不同干燥方法对蟾酥药材质量的影响。方法:以水分含量和三种蟾毒配基类成分脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵的含量为指标,检测室内避光阴干、室内晾晒、室外晒干、45℃烘干、80℃烘干五种不同干燥方法对蟾酥质量的影响。结果:室内阴干、室内晾晒、室外晒干5 d后,水分达到《中国药典》要求,45℃烘干、80℃烘干干燥的样品分别于48 h、12 h达到要求;不同干燥方法的蟾酥中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基总量都大于6.0%,且室内阴干室内晾晒阳光晾晒恒温45℃恒温80℃。结论:综合考虑蟾毒配基类成分含量、成本及操作难易度等因素,蟾酥的干燥宜采用室内避光阴干的方法。     

产地对蟾酥药材质量的影响

目的: 建立蟾酥药材质量分析方法,并分析产地对其有效成分的影响。 方法: 以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基为对照,采用薄层色谱法和高效液相色谱法进行分析和含量测定。 结果: 不同产地蟾酥药材所含成分类型基本相似,但在成分含量上存在明显的差异,以脂蟾毒配基含量变化最为明显,其中产地山东的蟾酥的华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量基本最高;成分差异在薄层色谱图谱中主要表现在斑点2(脂蟾毒配基)、斑点3(华蟾酥毒基)、斑点4、斑点6和斑点9上,在高效液相图谱中表现在3,4,6,7,8,9,14,15号峰上,且还可以看出7,8号峰的含量与14号(华蟾酥毒基)、15号(脂蟾毒配基)峰含量可能存在相关性。 结论: 不同产地蟾酥药材存在明显质量差异;本文方法稳定可行,重现性和专属性好,可用于蟾酥鉴别及质量分析。     

蟾蜍类药材质量研究

目的:研究不同产地、不同生长年限的蟾蜍类药材质量均一性。方法:用高效液相色谱法测定12份蟾蜍类药材样品中蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基,4种指标成分含量。结果:各样品中均可检测出4种指标成分,不同产地蟾酥、干蟾、蟾衣药材间品质差异较大;干蟾样品中4种指标成分含量,小的干蟾个体明显高于大的干蟾个体样品;蟾衣样品中,脂蟾毒配基含量:蟾衣(大)蟾衣(小),蟾毒灵含量:蟾衣(小)蟾衣(大)。结论:本实验为合理开发、应用蟾蜍类药材资源提供理论和实验依据。     

不同蟾皮提取物中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基血浆蛋白结合率的研究

目的研究不同蟾皮提取物中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的血浆蛋白结合率。方法采用平衡透析法,以高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定,比较两种蟾皮提取物及不同浓度的蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基对照品溶液的血浆蛋白结合率。结果建立的LC-MS/MS法线性良好,精密度、准确度、回收率以及稳定性均符合生物样品分析要求。3种不同浓度蟾毒灵的血浆蛋白结合率分别为(75.03±1.97)%、(72.33±2.51)%、(71.80±1.53)%;蟾皮药材提取物1中的为(-16.67±1.58)%,蟾皮药材提取物2中的为(71.93±1.48)%。3种不同浓度的华蟾酥毒基血浆蛋白结合率分别为(52.33±4.13)%、(52.47±3.84)%、(47.60±2.46)%;蟾皮药材提取物1中的为(-51.23±3.53)%,蟾皮药材提取物2中的为(40.93±1.29)%。3种不同浓度的脂蟾毒配基血浆蛋白结合率分别为(91.27±1.09)%、(93.60±0.85)%、(88.13±0.76)%;蟾皮药材提取物1中的为(52.67±3.58)%,蟾皮药材提取物2中的为(80.13±2.38)%。结论蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的血浆蛋白结合率跟药物浓度不呈依赖性,蟾皮药材提取物1中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的血浆蛋白结合率显著低于对照品蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基,而蟾皮药材提取物2的血浆蛋白结合率基本与对照品一致;提示蟾皮药材提取物1中混合物体系导致蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的血浆蛋白结合率的改变。     

以蟾酥制剂为例,探讨一测多评法在中成药质量评价和控制中的应用研究

一测多评法,作为适合中药特点的质量评价模式,已被广泛用于中药材、饮片和提取物的质量评价,但其在组方复杂的成方制剂中的应用仍处于探索和研究阶段。该文基于《中国药典》2020年版收载的蟾酥质量标准中3种蟾毒配基类成分含量测定的一测多评法,选择7种代表性的蟾酥制剂,探讨了蟾酥药材中华蟾酥毒基对蟾毒灵和脂蟾毒配基的相对校正因子(0.923和1.04)直接应用于其制剂质量评价的可行性。采用与药材相同的色谱条件对制剂进行分析,结合专属性实验,5种制剂(牙痛一粒丸、喉症丸、熊胆救心丸、六神丸和牛黄消炎丸)可以直接应用相对校正因子进行含量计算,并以喉症丸为例,开展了3种成分同步测定的方法学验证,蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的加样回收率在90.64%~106.1%。采用相对校正因子0.923和1.04计算的24批蟾酥制剂中蟾毒灵和脂蟾毒配基的含量与外标法结果无显著性差异。10批六神丸样品中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基质量分数分别为1.27~2.61、2.44~5.66、0.988~3.16 mg·g~(-1);3个厂家10批喉症丸样品中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基质量分数分别为0.760~1.32、1.35~2.39、0.600~1.55 mg·g~(-1)。该研究为蟾酥制剂质量标准的完善和提高提供数据支撑,并为拓展一测多评法在中成药质量评价和控制中的应用提供简化的研究思路和方法。     

蟾酥中3种脂溶性有效成分提取工艺及含量测定方法

目的:优化蟾酥中脂溶性成分蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的提取工艺,并建立了测定蟾酥提取物中上述3种成分含量的HPLC方法。方法:以蟾酥中脂溶性成分蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基含量为指标,采用L9(34)正交试验对蟾酥提取工艺进行了优化;建立的HPLC法,Diamonsil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-水(55:45),流速1.0mL.min-1,检测波长296 nm。结果:最佳提取工艺条件为A2B3C3D2,即75倍量95%乙醇80℃提取120 min;所建立的HPLC方法蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基均得到很好的分离,且重现性、精密度、线性关系良好,最小检测限分别为14.6,9.0,11.8ng.mL-1。结论:确定了蟾酥最佳提取条件,HPLC能准确测定蟾酥提取物中蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的含量,方法简便,结果准确。     

高效液相色谱法测定救心软胶囊中蟾酥的含量

目的建立救心软胶囊中蟾酥的主要成分华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱(RP-HPLC),以C18为固定相,流动相为乙腈-0.5%磷酸二氢钾(用磷酸调节pH值为3.0)(45∶55),检测波长296nm。结果华蟾酥毒基和脂蟾毒配基与其他成分分离良好。华蟾酥毒基在进样量0~5.86μg(r=0.999 8),脂蟾毒配基在进样量0~5.88μg(r=0.999 97)线性关系良好,华蟾酥毒基和脂蟾毒配基加样回收率为99.81%,RSD为2.25。结论该法操作简便、准确、重现性好,可用于救心软胶囊中蟾酥的质量控制。     

基于指纹图谱结合多元统计分析不同干燥方式蟾蜍肉氨基酸类成分

目的 建立不同干燥方式所得蟾蜍肉氨基酸类成分的指纹图谱及4个氨基酸的含量测定方法,比较不同干燥方式对蟾蜍肉品质及其氨基酸含量的影响。方法 采用异硫氰酸苯酯柱前衍生化-高效液相色谱法,建立热风干燥、冷冻干燥、真空干燥和阴干干燥4种方式所得蟾蜍肉干燥样品的指纹图谱,同时测定4个氨基酸含量,并进行相似度评价;运用SPSS 22.0软件进行聚类分析,运用SIMCA 14.1软件进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）。结果 不同干燥方式得到的16批蟾蜍肉样品指纹图谱相似度结果均大于0.970,共匹配出10个共有峰,指认出缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸4个氨基酸;PCA提取出2个主成分,累积方差贡献率为87.95%;PLS-DA得出异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸的变量重要性投影（VIP）值均大于0.7,提示4个氨基酸可作为评价不同干燥方式所得蟾蜍肉品质的关键指标;阴干干燥、热风干燥、冷冻干燥和真空干燥4种方式所得蟾蜍肉氨基酸总质量分数测定值分别为7.92%、4.62%~5.37%、7.89%~9.02%和4.60%~9.24%。结论 所建立的指纹图谱及含量测定方法稳定可行,结合多元统计分析发现不同干燥方式对蟾蜍肉氨基酸含量产生较大影响,可为蟾蜍肉干燥方式和质量控制研究提供参考。     

基于蟾蜍分泌腺转录组对蟾蜍二烯酸内酯合成途径关键基因的挖掘

目的 挖掘蟾蜍二烯酸内酯（bufadienolides,BDs）生物合成途径的关键基因。方法 使用激光捕获显微切割技术捕获中华大蟾蜍分泌腺[耳后浆液腺（CE）、皮肤浆液腺（CK）和皮肤粘液腺（CN）]为实验材料,在DNBseq测序平台进行转录组测序,并进行生信分析及对转录组结果进行验证。结果 共得到63.01 Gb原始数据和4 550个差异基因,其中CE和CK共有上调差异基因880个,其GO和KEGG富集显示主要在甾类激素生物合成、胆汁酸合成和C21类固醇生物合成等功能;CN上调差异基因主要富集在蛋白质糖基化、细胞黏结、体液免疫应答等功能。在CE、CK组上调的差异基因富集结果中发现有28种与BDs合成相关的物质的代谢、合成及运输等功能,且参与调控的基因有94个。对上述基因进行蛋白互作网络分析（protein-protein interaction network,PPI）分析,结果显示,94个基因中有34个存在互作关系,其中基因AMACR、HSD17B4、SCP2及ACOT8参与调控胆汁酸合成,基因LOC122926609参与调控石胆酸结合,结合文献分析,作者认为初级胆汁酸合成途径是B...     

中华大蟾蜍皮肤Cathelicidin家族新型抗菌肽的鉴定及其抗菌活性

对中华大蟾蜍皮肤转录组进行了测定,通过对得到转录组数据的组装、注释和序列比对得到1个新型Cathelicidin家族前体c DNA。按照Cathelicidin家族抗菌肽的加工方式,推导出该前体可能编码2个成熟的中华大蟾蜍Cathelicidin家族抗菌肽,命名为BG-CATH25,BG-CATH29。圆二色散测定了合成BG-CATH25,BG-CATH29的二级结构特征,结果揭示BG-CATH25,BG-CATH29在不同缓冲体系中以无规则卷曲的构象为主。对实验所用4种细菌的抗菌活性研究表明BG-CATH25,BGCATH29对嗜水气单胞菌有较强的抑菌活性,MIC分别为1.25,10 mg·L-1。     

蟾蜍TNFRSF11b、TNFRSF9基因克隆及生物信息学分析

目的 克隆中华蟾蜍肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因的全长序列,并分析其序列特征。方法 根据转录组测序所得的TNFRSF11b、TNFRSF9基因片段设计特异性引物,以中华蟾蜍蟾皮为材料,利用逆转录聚合酶链式反应（PCR）技术获得BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）序列,并采用生物信息学手段分析其序列特征,通过实时荧光定量PCR方法检测BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因在中华蟾蜍7种组织/器官中的表达情况。结果 克隆获得蟾蜍BbgTNFRSF11b基因的全长cDNA序列为1233 bp,编码410个氨基酸,理论相对分子质量为46.97 kDa,等电点为8.64,不存在跨膜区及信号肽,为亲水性蛋白,具有多个磷酸化位点。BbgTNFRSF9基因的全长cDNA序列为829 bp,编码247个氨基酸,理论相对分子质量为67.874 kDa,理论等电点为5.12,存在信号肽,为疏水性蛋白,具有多个磷酸化位点,进化树分析发现BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因与其他动物TNFRSF11b、TNFRSF9基因相似度不高,表明该基因虽有特殊结构域但不同物种间差异较大。组织表达分析显示,BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因在耳后腺中表达显著高于其他部位。结论 成功获得蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因序列,掌握其序列特征,为后续深入研究该蛋白的功能提供参考。     

蟾酥药材和饮片(蟾酥粉)的质量标准研究

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans或黑眶蟾蜍B.melanosticus耳后腺及皮肤腺分泌物的干燥加工品。蟾酥粉为蟾酥的酒制加工品。该研究针对现行蟾酥标准局限性和存在问题,结合前期研究,构建改进的蟾酥药材整体质量控制方法和标准,包含采用优化的薄层鉴别方法进行定性鉴别;采用【含量测定】项下的色谱条件建立HPLC特征图谱;完善一测多评法的相对校正因子,并将其用于38批蟾酥药材中蟾蜍甾的含量测定,制定合理含量限度。在此基础上,参照药材拟修订方法,对不同批蟾酥粉进行【性状】、【鉴别】(薄层鉴别)、【特征图谱】、【检查】(水分)和【含量测定】等检测项研究,起草蟾酥粉的质量标准。该研究为完善《中国药典》2020年版蟾酥的质量标准提供参考。     

蟾酥活性成分下调极光激酶表达并促进肝癌细胞周期阻滞的机制研究

目的探讨极光激酶(AURK)在肝癌中的作用,以及蟾酥活性成分华蟾毒配基和蟾蜍灵下调AURK表达和抑制肝癌Hep G2细胞增殖的机制。方法 Kaplan-Meier生存函数法分析极光激酶A(AURKA)和极光激酶B(AURKB)m RNA表达水平与肝癌患者生存期的关系;MTT法检测Hep G2细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期变化,蛋白免疫印迹法检测AURKA、AURKB、Xklp2靶向蛋白(TPX2)、染色体结构维持蛋白2(SMC2)、DNA拓扑异构酶2(TOP2A)和细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)的表达水平。结果 Kaplan-Meier生存分析显示AURKA和AURKB m RNA表达水平与肝癌患者生存期呈现显著负相关;华蟾毒配基和蟾蜍灵可抑制Hep G2细胞生长,抑制效应呈现时间和浓度依赖性;华蟾毒配基和蟾蜍灵均引起细胞周期G2/M期阻滞,下调AURKA、AURKB、TPX2、SMC2、TOP2A和CDK1蛋白表达(P0.05)。结论 AURKA和AURKB m RNA表达水平与患者生存期呈现显著负相关。华蟾毒配基和蟾蜍灵能有效促使AURKA和AURKB表达下调,调控有丝分裂相关分子,引起Hep G2细胞周期阻滞,从而抑制其增殖。     

蟾皮化学成分和药理活性的研究进展

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans或黑眶蟾蜍B.melanosticus的干燥全皮,已纳入壮药名录。作为一种民族药,常用于满族、回族和朝鲜族的民间药方,具有清热解毒和利水消肿之功效。目前已从蟾皮中发现100多个化合物,包括蟾蜍二烯羟酸内酯类、吲哚生物碱类、蟾蜍环酰胺类以及甾体类等成分。随着国内外药理学研究的不断深入,蟾皮单体成分呈现诸多药理作用,如抗肿瘤、抗炎、免疫调节、抗乙肝病毒、强心等,并且对特异的药物代谢酶具有较高的敏感性。通过查阅近20年来的国内外文献,对蟾皮的化学成分、药理活性、单体成分与药物代谢酶的相互作用等方面进行综述,以期为蟾皮更好的开发和应用提供参考。     

HPLC法测定麝香保心片中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量

建立麝香保心片中华蟾酥毒基和脂瞻毒配基的含量测定方法。应用HPLC法，采用ODSC18柱，0.5%磷酸二氢钾溶液-乙腈（45：55）（用磷酸调节PH值为3.2)为流动相，检测波长为296nm。结果：华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的平均加样回收率分别为97.54%和97.60%，RSD分别为1.43%和1.69%，精密度和重现性均良好。结论：本法操作简便、快速、准确，可用来控制样品的质量。     

HPLC法测定麝香保心片中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量

建立麝香保心片中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定方法。应用 HPLC法,采用 ODSC18柱,0.5％磷酸二氢钾溶液-乙腈(45:55)(用磷酸调节 pH值为 3.2)为流动相,检测波长为 296nm。结果:华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的平均加样回收率分别为97.54％和97.60％,RSD分别为1.43％和1.69％,精密度和重现性均良好。结论:本法操作简便、快速、准确,可用来控制样品的质量。