siRNA沉默EZH2对HL-60细胞迁移、增殖能力的影响及其机制

目的 探讨人类同源基因2(EZH2)对人急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60细胞迁移、增殖能力的影响及其机制.方法 通过慢病毒转染技术用siRNAs沉默HL-60细胞的EZH2基因,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及Western blot验证3个不同序列的siRNA敲除EZH2的效果并筛选出最佳序列.随后用CCK-8和流式细胞术分别检测细胞增殖活性和凋亡,并用Transwell迁移小室试验检测细胞的迁移能力,用Western blot方法检测细胞迁移、增殖及凋亡相关蛋白的表达水平.结果 在HL-60细胞中用siRNAs敲除EZH2后其增殖能力下降(P<0.05),凋亡增加(P<0.05).Transwell迁移小室试验结果显示,HL-60细胞敲除EZH2组(siEZH2组)的下室细胞比例比HL-60野生株细胞组(wild组)和空病毒组(NC组)明显降低;苏木素染色后发现siEZH2组膜上细胞基数明显低于wild组和NC组.Western blot检测显示,siRNA沉默EZH2后细胞迁移相关蛋白基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达下调,E-钙黏蛋白(E-cadherin)上调,增殖及凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)基因下调,而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)上调.结论 在HL-60细胞中敲除EZH2基因后其增殖、迁移能力下降,凋亡增加.     

siRNA沉默EZH2对HL-60细胞迁移、增殖能力的影响及其机制

目的 探讨人类同源基因2(EZH2)对人急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60细胞迁移、增殖能力的影响及其机制.方法 通过慢病毒转染技术用siRNAs沉默HL-60细胞的EZH2基因,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及Western blot验证3个不同序列的siRNA敲除EZH2的效果并筛选出最佳序列.随后用CCK-8和流式细胞术分别检测细胞增殖活性和凋亡,并用Transwell迁移小室试验检测细胞的迁移能力,用Western blot方法检测细胞迁移、增殖及凋亡相关蛋白的表达水平.结果 在HL-60细胞中用siRNAs敲除EZH2后其增殖能力下降(P<0.05),凋亡增加(P<0.05).Transwell迁移小室试验结果显示,HL-60细胞敲除EZH2组(siEZH2组)的下室细胞比例比HL-60野生株细胞组(wild组)和空病毒组(NC组)明显降低;苏木素染色后发现siEZH2组膜上细胞基数明显低于wild组和NC组.Western blot检测显示,siRNA沉默EZH2后细胞迁移相关蛋白基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达下调,E-钙黏蛋白(E-cadherin)上调,增殖及凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)基因下调,而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)上调.结论 在HL-60细胞中敲除EZH2基因后其增殖、迁移能力下降,凋亡增加.     

RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响

目的:研究RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞周期和增殖的影响.方法:体外构建EZH2基因的shRNA的表达载体,Lipofectamin 2000介导转染膀胱癌EJ细胞,采用RT-PCR和Western Blot方法检测特异性shRNA对EZH2基因沉默效果,转染后采用MTT法检测shRNA对细胞增殖的作用;应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变.结果:EZH2基因的shRNA表达载体有效下调EZH2基因的表达(P<0.05).与对照组比较,细胞增殖明显抑制(P<0.05);同时引起细胞G1期阻滞,RNA干扰后,G1期细胞增加[(84.0±8.7)% vs (52.0±6.8)%, P<0.05],S期细胞减少[(11.0±1.1)% vs (43.0±4.9)%, P<0.05].结论:EZH2基因有望成为应用RNAi技术探索膀胱癌基因治疗的潜在靶基因.     

siRNA沉默CD44表达对人胆囊癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的探讨siRNA沉默CD44表达对人胆囊癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法利用RNA干扰技术在人胆囊癌细胞株EH-GB1和GBC-SD中敲低CD44的表达;通过CCK8实验检测si-NC和si-CD44对人胆囊癌细胞株EH-GB1和GBC-SD增殖能力的影响;通过Transwell迁移实验检测其对迁移能力的影响;通过Transwell侵袭实验检测其对侵袭能力的影响。结果转染si-CD44对胆囊癌细胞GBC-SD和EH-GB1的增殖能力无明显影响（P＞0.05）,但能明显抑制胆囊癌细胞的迁移能力[si-NC组穿膜细胞数在人胆囊癌细胞株EH-GB1、GBC-SD分别为（193.7±3.９）、（193.7±7.８）个,明显大于si-CD44组的（88.7±5.8）、（110.3±5.５）个（t=15.12、10.42,均P＜0.05）]和侵袭能力[（si-NC组穿膜细胞数在人胆囊癌细胞株EH-GB1、GBC-SD分别为（175.3±7.5）、（188.0±9.0）个,明显大于si-CD44组的（85.3±3.7）、（73.0±3.6）个（t=10.74、11.84,均P＜0.05）]。结论CD44能够促进胆囊癌细胞的侵袭、迁移能力,可能作为胆囊癌治疗的生物靶点。     

特异性siRNA沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响

目的 探讨RNA干扰（RNA interference,RNAi）沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞侵袭的影响.方法 根据TDGF-1基因序列特点设计3个小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）后,转染人乳腺癌MDA-MB-468细胞,用荧光实时定量RT-PCR筛选出效果最好的siRNA.以该siRNA转染处理乳腺癌MDA-MB-468细胞后,分别采用实时定量RT-PCR和western blot检测TDGF-1基因mRNA和蛋白水平,以划痕试验方法评测癌细胞迁移能力;用Boyden模型观察癌细胞侵袭能力.结果 根据TDGF-1基因序列特点设计的3个siRNA均能抑制TDGF-1基因mRNA水平,以S1效果最好.S1 siRNA转染组TDGF-1 mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性（P＜0.001,P＜0.001）.体外试验发现,TDGF-1 siRNA转染可有效抑制乳腺癌细胞集落生长、侵袭和迁移能力,且与浓度相关（P＜0.005,P＜0.005,P＜0.005）.结论 TDGF-1在乳腺癌细胞迁移、侵袭中起着重要的作用;采用TDGF-1 siRNA转染可抑制乳腺癌细胞侵袭.     

siRNA沉默EPAS1基因对胰腺癌细胞凋亡和增殖的影响

目的 研究由2型重组腺相关病毒(rAAV2)介导的靶向缺氧诱导因子2(EPAS1/HIF-2)的小干扰RNA(siR-NA)对人胰腺癌PANC-1细胞凋亡和增殖的影响.方法 将人胰腺癌细胞株PANC-1分为实验组、阴性对照组(阴性组)和空白对照组(空白组),实验组和阴性组分别转染rAAV2-EPAS1-siRNA和rAAV2-EGFP病毒,空白组不转染病毒,进行常氧和缺氧培养.RT-PCR和Western blot检测EPAS1基因表达,Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖能力.结果 在常氧和缺氧状态下,实验组细胞EPAS1 mRNA和蛋白表达受抑制,显著低于阴性组和空白组,差异均有高度统计学意义(p<0.001).在缺氧状态下,实验组细胞的凋亡率明显升高,增殖受抑制,与阴性组和空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 通过siRNA抑制缺氧状态下胰腺癌细胞中EPAS1基因表达,能诱导胰腺癌细胞凋亡,抑制胰腺癌细胞增殖.     

特异性siRNA沉默LASP-1对HepG2细胞增殖和迁移的影响

目的应用RNA干扰技术沉默细胞内LASP-1蛋白的表达,探讨LASP-1蛋白对人肝癌HepG2细胞增殖和迁移的作用。方法根据LASP-1mRNA编码序列设计RNA干扰靶点并构建特异性小干扰RNA（siRNA）,通过脂质体转染入HepG2细胞,采用Westernblot法检测LASP-1蛋白的表达。采用CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell和划痕愈合实验方法,观察HepG2细胞增殖及迁移情况。结果（1）LASP-1siRNA对LASP．1蛋白表达水平有显著的下调作用（P〈0．05）。（2）体外实验结果显示,与HepG2组及阴性对照组相比,siRNA组HepG2细胞增殖和克隆形成率明显被抑制（P〈0．05）,其迁移能力也下降（P〈0．05）。结论下调LASP-1蛋白表达可显著抑制HepG2细胞的增殖和迁移能力,提示LASP-1在肝癌细胞恶性增殖和转移过程中具有重要作用,为临床上寻找抑制肝癌增殖转移的靶点提供新的思路和方法。     

EZH2对人喉鳞状细胞癌HEP-2增殖、迁移和侵袭的影响

目的：探讨Zeste基因增强子同源物2(EZH2)在人喉鳞状细胞癌组织和HEP-2、SCC10A细胞中的表达及其对人喉鳞状细胞癌细胞HEP-2增殖、迁移和侵袭的影响。方法：收集宣城中心医院30例喉鳞状细胞癌和10例癌旁正常喉黏膜组织标本,qRT-PCR检测喉鳞状细胞癌组织和癌旁组织以及喉鳞状细胞癌细胞HEP-2、SCC10A中EZH2的表达。采用Lipofectamine2000将EZH2 shRNA质粒转染至HEP-2细胞中,通过qRT-PCR和Western blot检测EZH2 shRNA的转染效率,并通过Western blot检测EZH2下游相关信号分子的表达水平。CCK8实验检测HEP-2细胞的增殖,划痕实验和 Transwell侵袭实验检测细胞的迁移、侵袭能力。运用裸鼠体内成瘤实验检测EZH2对HEP-2细胞体内成瘤能力的影响。结果：EZH2在喉鳞状细胞癌组织及细胞中显著高表达(P＜0.01)。EZH2 shRNA质粒转染后可抑制细胞的增殖能力,细胞的迁移和侵袭也均受到明显抑制。裸鼠体内成瘤实验结果显示,EZH2 shRNA组的HEP-2细胞肿瘤形成能力明显减弱。结论：EZH2在喉鳞状细胞癌组织和细胞中高表达;EZH2 shRNA能够在体外抑制喉鳞状细胞癌细胞HEP-2的增殖、迁移和侵袭,并抑制RAF1-ERK信号通路的活化;EZH2能够在体内抑制喉鳞状细胞癌细胞HEP-2的成瘤能力。     

siRNA沉默膀胱癌肝素酶基因对T24细胞增殖及MMP-2表达的影响

目的研究siRNA干扰沉默膀胱癌肝素酶基因对T24细胞增殖及MMP-2表达的影响 方法体外化学合成肝素酶特异性小干扰RNA（siRNA）,用脂质体2000转染至T24膀胱移行细胞癌细胞内,常规分为正常对照组、空白对照组、阴性对照组和转染实验组进行实验,用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况,反转录聚合酶链法（RT-PCR）检测肝素酶基因的表达,免疫细胞化学方法检测MMP 2的表达。结果RNA干扰沉默T24膀胱移行细胞癌细胞肝素酶基因后,T24细胞增殖活力下降,三个不同干扰组细胞活力分别下降了(28.55±3.66)%、(27.20±3.25)%和(37.29±4.82)%。肝素酶mRNA表达下降,膀胱移行细胞癌细胞中MMP-2（明胶酶A）的表达亦明显下降（P均＜0.05）。结论RNA干扰肝素酶基因后,细胞活力及肝素酶mRNA表达水平下降并且明显抑制膀胱癌细胞中MMP-2的表达。     

人卵巢癌顺铂耐药细胞EZH2基因沉默对Drosha基因表达的影响

目的探讨RNA干扰沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)基因对卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP的Drosha基因表达的影响。方法获得稳定表达EZH2短发夹状RNA(shRNA)的人卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP-shEZH2,实时荧光定量PCR法和免疫印记法检测转染株的Drosha基因表达。结果以未转染组A2780/DDP细胞Drosha的表达水平为100.00%,EZH2-shRNA转染组A2780/DDP-shEZH2细胞Drosha的mRNA及蛋白水平分别上升(53.33±9.24)%和(51.28±3.25)%。结论沉默EZH2基因可以上调Drosha基因的表达。     

siRNA沉默MUC16对胆囊癌细胞增殖和迁移的影响

目的探讨siRNA沉默黏蛋白(mucin,MUC)16基因对人胆囊癌细胞(GBC-SD)增殖和迁移的影响及其分子机制。方法采用慢病毒感染和siRNA干扰技术沉默GBC-SD中MUC16基因(GBC-SD+MUC16-siRNA组),同时设立阴性对照组(GBC-SD+NC组)和空白对照组(GBC-SD组)。RT-PCR检测各组GBC-SD细胞中MUC16表达情况,噻唑蓝实验检测GBC-SD细胞增殖能力,划痕实验检测GBC-SD细胞迁移能力,蛋白免疫印迹实验检测GBC-SD细胞中PCNA和CD44蛋白表达情况。结果GBC-SD+MUC16-siRNA组细胞增殖率和细胞迁移数目均低于GBC-SD组(P < 0.05);GBC-SD+MUC16-siRNA组MUC16、CD44蛋白表达均低于GBC-SD组、GBC-SD+NC组(P < 0.05~P < 0.01),PCNA蛋白表达亦低于GBC-SD+NC组(P < 0.05)。结论siRNA沉默MUC16具有一定的抑制胆囊癌细胞增殖和迁移作用,可为胆囊癌的治疗提供新的实验证据。     

siRNA沉默eIF4E诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡及其机制

目的：观察真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)基因的靶向小干扰RNA(siRNA)对喉癌Hep-2细胞中eIF4E基因表达的影响,探讨其诱导喉癌细胞凋亡的作用机制。方法：采用脂质体LipofectamineTM 2000将siRNA-eIF4E转染入人喉癌Hep-2细胞（siRNA-eIF4E组）,同时设空白对照组和空质粒组。MTT法检测siRNA对Hep-2细胞增殖的抑制作用,罗丹明染色检测转染后细胞内线粒体膜电位的变化,TUNEL染色法检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blotting法检测凋亡相关基因转录和蛋白表达水平的变化。结果：与空白对照组及空质粒组比较, siRNA-eIF4E组Hep-2细胞中eIF4E基因转录和表达水平明显下调（P<0.01）,Hep-2细胞生存率下降（P<0.05）,细胞线粒体膜电位降低（P<0.05）,细胞凋亡率增加（P<0.05）,凋亡相关基因Bim、Bid及Caspase-3表达上调（P<0.05）。结论：siRNA-eIF4E在体外可抑制人喉癌Hep-2细胞增殖,其机制可能是通过激活线粒体凋亡途径诱导Hep-2细胞凋亡。     

siRNA沉默Msi1表达对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的探讨siRNA沉默Msi1基因表达对人宫颈癌Hela细胞增殖、迁移及侵袭的影响。方法针对Msi1基因mRNA序列设计合成siRNA,转染人宫颈癌Hela细胞;实验分Msi1siRNA组、空白对照组、脂质体组及阴性对照组;通过RT-PCR法检测Msi1基因在mRNA水平的表达;分别利用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色试验、群体倍增时间及平皿克隆实验分析干扰Msi1基因对人宫颈癌Hela细胞的生长抑制效应;通过细胞划痕实验观察干扰Msi1对细胞迁移能力的影响;利用Transwell小室实验观察干扰Msi1对细胞侵袭能力的影响。结果Msi1siRNA能有效抑制人宫颈癌Hela细胞中Msi1基因的表达;Msi1siRNA转染Hela细胞24、48、72h后,与其他各组比较,Msi1siRNA组Hela细胞的生长、增殖速度明显减缓（均P＜0.05）。空白对照组Hela细胞群体倍增时间为（20.18±0.01）h,而干扰Msi1基因处理后的Hela细胞,群体倍增时间延长至（35.68±0.04）h（P＜0.05）;同时平皿克隆实验结果发现,Msi1siRNA处理后的Hela细胞与其他各组相比,Hela细胞生长明显减慢（均P＜0.05）;细胞划痕实验和Transwell小室实验分别显示处理后的Hela细胞其迁移和侵袭能力均明显下降,与其他各组相比差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论沉默Msi1基因表达对人宫颈癌Hela细胞的增殖、迁移及侵袭有负性调节作用。     

siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响

目的: 观察HPV16 E6 siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响.方法: 利用脂质体将HPV16 E6特异性siRNA表达载体转染Caski细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E6 mRNA的变化,流式细胞仪检测E6蛋白和细胞凋亡率的变化,MTT法和细胞克隆法检测细胞增殖的变化.结果: HPV16 E6 siRNA表达载体可明显抑制Caski细胞E6 mRNA和E6蛋白的表达,抑制率分别为89.5%和98.1%;表达载体可明显增加细胞凋亡率,抑制细胞的增殖和克隆的形成.结论: HPV16 E6 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达,增加细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增殖和克隆的形成.     

siRNA沉默eIF4E诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡及其机制

目的:观察真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)基因的靶向小干扰RNA(siRNA)对喉癌Hep-2细胞中eIF4E基因表达的影响,探讨其诱导喉癌细胞凋亡的作用机制。方法:采用脂质体LipofectamineTM2000将siRNA-eIF4E转染入人喉癌Hep-2细胞(siRNA-eIF4E组),同时设空白对照组和空质粒组。MTT法检测siRNA对Hep-2细胞增殖的抑制作用,罗丹明染色检测转染后细胞内线粒体膜电位的变化,TUNEL染色法检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blotting法检测凋亡相关基因转录和蛋白表达水平的变化。结果:与空白对照组及空质粒组比较,siRNA-eIF4E组Hep-2细胞中eIF4E基因转录和表达水平明显下调(P<0.01),Hep-2细胞生存率下降(P<0.05),细胞线粒体膜电位降低(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),凋亡相关基因Bim、Bid及Caspase-3表达上调(P<0.05)。结论:siRNA-eIF4E在体外可抑制人喉癌Hep-2细胞增殖,其机制可能是通过激活线粒体凋亡途径诱导Hep-2细胞凋亡。