嵌合性硫代磷酸修饰的反义c-myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究

目的：探讨ｃ－ｍｙｃ基因表达在血管平滑肌细胞增殖信号传导通路中的作用和采用反义ｃ－ｍｙｃ寡脱氧核苷酸抑制血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）增殖的作用。方法：采用针对大鼠ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ包括ＡＵＧ在内的翻译起始区的前５个密码子的嵌合性硫代修饰的反义ｃ－ｍｙｃ寡脱氧核苷酸（ＡＳ－ＯＤＮ）,以ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ导入ＳＭＣ后,通过细胞计数和３Ｈ－ＴｄＲ掺入观察其对ＳＭＣ增殖的抑制作用。结果：ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ不仅对从静止状态刺激的ＳＭＣ增殖有抑制作用,而且对处于增殖状态的ＳＭＣ的增殖也有显著抑制作用,这种抑制作用可因加入正义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ而减弱甚至消除,而且随着剂量的增加,抑制作用越来越明显。一次性应用ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ可达到较持久的作用。而正义ＯＤＮ和错配ＯＤＮ对ＳＭＣ增殖无影响。结论：ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ以剂量依赖和序列特异方式抑制ＳＭＣ增殖。ｃ－ｍｙｃ基因表达在ＳＭＣ增殖的信号传导通路中起重要作用。为采用ｃ－ｍｙｃＡＳ－ＯＤＮ抑制ＳＭＣ增殖的反义战略防治再狭窄研究奠定了基础。     

反义Gαq/11亚基ODNs对平滑肌细胞DNA合成和PC蛋白表达的影响

目的：探讨Ｇｑ蛋白介导血管活性多肽对ｖＳＭＣＤＮＡ合成及增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）蛋白表达的影响。方法：用硫代修饰的Ｇαｑ／１１亚基反义寡聚脱氧核苷酸（Ｇαｑ／１１ＡＳ－ＯＤＮｓ），以６μｍｏｌ／Ｌ的浓度加入含１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１ＥＴ－１刺激无血清ＤＭＥＭ培养基中体外培养ｖＳＭＣ。用３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定ｖＳＭＣＤＮＡ合成、免疫细胞化学技术检测ｖＳＭＣＰＣＮＡ蛋白表达。结果：Ｇαｑ／１１ＡＳ－ＯＤＮｓ可明显抑制ｖＳＭＣＤＮＡ的合成，在１２ｈ，２４ｈ时抑制率分别为８４２％和８５３％；Ｇαｑ／１１ＡＳ－ＯＤＮｓ亦明显降低ｖＳＭＣＰＣＮＡ蛋白的表达。而相同浓度的正义Ｇαｑ／１１ＯＤＮｓ只呈现少量抑制作用。结论：本实验提示Ｇαｑ／１１ＡＳ－ＯＤＮｓ有可能进一步应用于由血管活性多肽刺激引起的ｖＳＭＣ增生性疾病如经皮冠脉腔内血管成形术（ＰＴＣＡ）后再狭窄的防治的研究     

粘着斑激酶活化对平滑肌细胞粘附和迁移的影响

目的:研究粘着斑激酶磷酸化在细胞外基质成份诱导平滑肌细胞粘附和迁移中的作用。方法:通过纤粘连蛋白(FN)诱导培养的平滑肌细胞粘附迁移,以免疫沉淀和Western blolt方法检测粘着斑激酶(FAK)及其磷酸化的表达量。将FAK反义寡核苷酸(ODNs)经脂质体转染细胞,观察对FAK磷酸化、细胞粘附铺展和迁移的影响。结果:FN在显著诱导平滑肌细胞粘附和迁移时,FAK也呈明显表达,20 mg/L FN可使其磷酸化处于较高表达量。脂质体可有效地介导ODNs转染,转染效率为(86.7±4.5)%,FAK磷酸化表达量明显减少,5-60 mg/L不同浓度FN组,细胞铺展率减少17.89%-27.67%,10、20、40和60 mg/L FN组迁移细胞数也分别显著少23.26%、21.63%、19.31%、17.88%(P＜0.05)。结论:活化的FAK是细胞外基质诱导SMCs粘附和迁移的重要信号分子,由其介导的信号转导促进了这一过程,反义FAK ODNs可有效地对此进行抑制。     

嵌合性硫代磷酸修饰的反义c—myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑？…

探讨ｃ－ｍｙｃ基因表达在血管平滑肌细胞增殖信号传导通路中的作用和采用反义ｃ－ｍｙｃ寡脱氧核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖的作用。方法采用对大鼠ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ包括ＡＵＧ在内的释译起始区的前５个密码子的嵌事性硫代修饰的反义ｃ－ｍｙｃ寡脱核氧苷酸,     

bcl—2基因反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响

目的：探讨ｂｃｌ－２基因反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响。方法：应用细胞培养，免疫标记及流式细胞仪技术，检测了ｂｃ１－２基因反义寡脱氧核糖核苷酸（ＡＳＯＤＮ）和阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）对白血病Ｋ５６２和ＨＬ－６０细胞作用和ｂｃｌ－２基因表达。结果：Ａｒａ－Ｃ（１０μｍｏｌ／Ｌ）与ｂｃｌ－２ＡＳＯＤＮ同时作用比单独用Ａｒａ－Ｃ或Ａｒａ－Ｃ与正义寡脱氧核糖核苷酸（ＳＯＤＮ）细胞存活率显著减少（Ｐ＜０００１），并且流式细胞仪检测显示ｂｃｌ－２ＡＳＯＤＮ使ｂｃｌ－２蛋白阳性率降低。结论：ｂｃｌ－２基因反义寡核苷酸能抑制该基因表达，提高白血病细胞对Ａｒａ－Ｃ的敏感性     

c-sis反义寡核苷酸对肺血管平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响

目的:探讨从血小板源生长因子-B链(PDGF-B)的基因水平阻断对肺血管平滑肌细胞增殖的影响。方法:给肺动脉平滑肌细胞(VSMC)分别施加不同剂量的c-sis癌基因反义寡核苷酸(ASON), 通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察细胞不同时相的增殖曲线;采用流式细胞术观察不同干预条件下VSMC细胞周期的变化。结果:中、大浓度ASON对细胞增殖有明显抑制作用。在中浓度的ASON作用下, 加入PDGF-BB能促进VSMC的增殖。ASON干预前后, VSMC增殖周期中各期细胞构成发生显著的变化, 以G₀＋G₁期细胞增多、S+G₂＋M期细胞减少为特征。各组的G₀＋G₁期细胞均显著多于对照组(P＜0.05)。小剂量与中剂量、中剂量与大剂量间G₀＋G₁期细胞有显著差异(P＜0.05)。结论:中、大剂量ASON能明显抑制肺VSMC的增殖, 可使G₀＋G₁期细胞数明显增多, 且与ASON有剂量依赖关系。     

嵌合性硫代磷酸修饰的反义c—myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑？…

目的：血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）迁移在血管成形术后再狭窄的发生中起着关键作用。ｃ－ｍｙｃ是对多种刺激ＳＭＣ迁移的生长因子作出迅速早期反应的基因。推测采用与ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ互补的寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）的反义战略可达到抑制ＳＭＣ迁移的目的。方法：将嵌合性硫代磷酸修饰的反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ通过ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ导入ＳＭＣ后,采用改良的Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ方法检测ＳＭＣ的迁移率。结果：反义ｃ－     

肿瘤坏死因子α与反义寡脱氧核苷酸联合作用对人胰腺癌细胞生长的影响

目的探讨肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）与反义寡脱氧核苷酸的联合应用对胰腺癌细胞生长的影响。方法用ＴＮＦα和硫代正磷酸修饰的反义寡脱氧核苷酸对本室自建的胰腺癌细胞系（ＰＣ－２）进行处理，并与单独用药和未用药组进行对比。用细胞计数和噻唑蓝（ＭＴＴ）法分析细胞生长速度和增殖率，用ＲＴ－ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ检测药物对靶基因表达的影响，并对细胞的凋亡状况进行原位检测。结果联合用药组较单独用药组使细胞生长速度减慢的作用明显加强；针对Ｋｉ－ｒａｓ和ｃ－ｍｙｃ帽区的反义硫代正磷酸修饰的寡脱氧核苷酸（简称反义Ｋｉ－ｒａｓ和反义ｃ－ｍｙｃ）可以明显抑制内源性靶基因Ｋｉ－ｒａｓ和ｃ－ｍｙｃ的表达；ＴＮＦα与反义Ｋｉ－ｒａｓ、反义ｃ－ｍｙｃ联合应用凋亡细胞发生率为８．０％和８．４％，高于其分别单独应用的５．２％、４．８％和５．４％。结论ＴＮＦα与反义寡脱氧核苷酸的联合应用对细胞生长的影响大于单独作用。     

肿瘤坏死因子α与反义寡脱氧核苷酸联合作用对人胰腺癌细胞生…

目的探讨肿瘤坏死因子α与反义寡脱氧核苷酸的联合应对胰腺癌细胞生长的影响。     

反义c-myc真核表达载体的构建及其对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:观察反义c-myc真核表达载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用。方法:构建反义和正义c-myc真核表达载体pcDNA3-myc-antisense和pcDNA3-myc-sense,利用lipofectin将正义及反义c-myc真核表达载体导入大鼠气道平滑肌细胞,MTT法观察正义和反义c-myc真核表达载体对大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用,流式细胞技术检测细胞周期变化,免疫组织化学染色检测c-Myc蛋白的表达。结果:反义c-myc真核表达载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖,延长细胞S期,反义c-myc真核表达载体可降低气道平滑肌细胞c-Myc蛋白的表达。结论:反义c-myc真核表达载体可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖。     

反义c-myc寡核苷酸抑制大鼠胸腺淋巴细胞增殖

目的:观察反义c-myc寡核苷酸对大鼠胸腺淋巴细胞增殖的抑制作用。方法:Ficoll密度梯度离心法分离大鼠胸腺淋巴细胞。利用Iipofectin将正义、反义及错配c-myc寡核苷酸导入大鼠胸腺淋巴细胞,-TdR掺入法及MTS法检测淋巴细胞增殖,RT-PCR检测c-mycmRNA的表达。结果:反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠胸腺淋巴细胞的增殖,但此抑制作用无浓度依赖性,反义c-myc寡核苷酸可降低胸腺淋巴细胞c-mycmRNA的表达。结论:反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠胸腺淋巴细胞的增殖。     

反义c-myc寡核苷酸诱导骨肉瘤细胞MG-63凋亡的实验研究

目的： 研究反义c-myc寡核苷酸诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用。方法： 设计反义c-myc寡核苷酸片段,转染入人骨肉瘤MG-63细胞，通过MTT法、流式细胞仪、HE染色及透射电镜方法，观察和分析其对人骨肉瘤MG-63细胞作用的效果。结果： MTT法示反义c-myc寡核苷酸可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖，10.0 μmol/L、作用48 h效果最明显；流式细胞仪检测证实反义c-myc寡核苷酸（终浓度10.0 μmol/L）诱导瘤细胞的凋亡率达37.92%，出现明显的凋亡峰，并可抑制c-myc基因蛋白的表达；细胞呈典型凋亡特征。结论： 反义c-myc寡核苷酸能有效诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡。     

牛磺酸减轻β-甘油磷酸诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化氧化应激在反流物所致食管粘膜损伤中的作用

目的：观察牛磺酸对钙化的形成及逆转作用的影响，探讨牛磺酸在血管钙化发生中的作用。方法：利用β-甘油磷酸制备钙化血管平滑肌细胞（VSMCs），测定细胞钙含量、碱性磷酸酶活性、[⁴⁵Ca]沉积及[³H]-胸腺嘧啶。结果：与对照组相比，钙化细胞的钙含量、ALP活性和[⁴⁵Ca]沉积均明显升高（P<0.05），而牛磺酸与β-甘油磷酸同时孵育呈剂量依赖性地抑制钙化发生。在牛磺酸逆转实验中，钙化细胞的钙含量、ALP活性和[⁴⁵Ca]沉积均较换液前明显降低（P<0.01）；且牛磺酸呈剂量依赖性地逆转已钙化细胞。与对照组相比，钙化细胞的细胞数量和[³H]-TdR掺入量增加（P<0.01），牛磺酸早期干预组显著抑制钙化细胞的增殖，但牛磺酸对已钙化的细胞,增殖抑制效应不明显。结论：牛磺酸可抑制细胞钙化形成且能逆转已形成钙化。     

hTERT基因反义核酸对Jurkat细胞端粒酶活性影响

目的:检测hTERT基因反义核酸对Jurkat细胞端粒酶活性的影响及其机制。方法:TRAP法检测端粒酶活性,流式细胞仪检测hTERT蛋白表达,逆转录-多聚酶链式反应检测hTERTmRNA表达。结果:检测端粒酶活性,Jurkat细胞吸光度A值为0.492±0.051,hTERT反义核酸作用48hA值降为0.351±0.051,hTERT反义核酸作用72hA值降为0.238±0.024;检测hTERT蛋白表达,Jurkat细胞hTERT蛋白阳性率89.513%±3.389%,hTERT反义核酸作用48hhTERT蛋白阳性率低至77.237%±2.872%,hTERT反义核酸作用72hhTERT蛋白阳性率低至47.767%±1.326%。而hTERT正义核酸无上述作用。hTERT反义核酸作用Jurkat细胞48h、72h对hTERTmRNA表达无影响。结论:hTERT反义核酸降低Jurkat细胞端粒酶活性,机制可能是降低hTERT蛋白表达量,对hTERTmRNA无影响。     

不同方法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞的性状

高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压等疾病均以血管平滑肌细胞的异常增生和迁移为特征。为此 ,近几年来 ,血管平滑肌细胞的培养已经成为研究工作的基础。目前 ,仍然多采用贴块片[1 ] 。因其方便经济、技术难度低 ,但贴块片确有不足之处 ,如细胞容易出现“去分化”或“调整”现象。故我们采用单纯胶原酶法 (Ａ)和复合胶原酶法 (Ｂ ,包括胶原酶弹性蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂 )培养肺动脉平滑肌细胞 (ｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ,ＰＡＳＭＣ) ,并初步观察两种方法培养的ＰＡＳＭＣ生长状况。材　料　和　…     

氟伐他汀抑制大鼠血管平滑肌细胞迁移的机制

目的:研究氟伐他汀抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移的可能机制。方法:采用体外培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞;用特异性单克隆磷酸化热休克蛋白27(phospho-HSP27)抗体的Western blotting检测HSP27的活性;用FITC-鬼笔环肽标记F-actin并在激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架的形态变化;采用改良的Boyden微孔膜双槽法进行细胞迁移实验。结果:AngⅡ和PDGF-BB呈浓度依赖性诱导VSMCs的HSP27磷酸化,使VSMCs内F-actin数量明显增加,纵向平行排列,形成应力纤维丝,并促进细胞迁移。100μmol/L HSP27阻断剂槲皮素可阻抑AngⅡ、PDGF-BB刺激VSMCs后产生的应力纤维丝形成,对AngⅡ、PDGF-BB诱导的VSMCs迁移的抑制率分别为55.3%和53.6%,P0.01。氟伐他汀抑制AngⅡ和PDGF-BB诱导的HSP27磷酸化,并有量效关系,抑制作用在10-5mol/L时最显著,最大抑制率分别为42.1%和58.5%,P0.01。结论:氟伐他汀可能通过抑制HSP27磷酸化影响VSMCs的迁移。