骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤是中枢神经系统的一类严重创伤,其所造成的运动及感觉功能障碍,显著降低了患者的生存和生活质量。现行的修复方法和药物治疗效果欠佳,以致于给个人、家庭和社会造成了沉重的负担。随着生物学及分子生物学研究的不断深入,以骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植为代表的生物治疗为脊髓损伤的修复带来了曙光。本文将就脊髓损伤修复的现状、BMSCs的生物学特性和作用机制、以及其应用于脊髓损伤修复的潜在价值等方面进行综述。     

骨髓间充质干细胞研究进展

骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展,但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。     

骨髓间充质干细胞生物学特性及其在血液学的应用

近年来，随着细胞生物学和分子生物学技术的快速发展，干细胞的研究和应用成为生命科学的热点。干细胞（stemcell，sc）是一种具有自我更新（self-renew）能力和多向分化（muhilneage differentiation）潜能的未分化细胞，根据其分化潜能的大小，可分为：①全能干细胞（totipotent stem cells，TSCs），即受精卵；②胚胎干细胞（plurlpotent stem cells or rembryonic stem cells，ESCs），可生成除胎盘外机体所有的组织细胞；     

兔骨髓间充质干细胞获取与特性的实验研究

目的：完善兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）体外扩增培养体系并观测其特性。方法：兔骨髓经密度梯度离心获得单核细胞后贴壁培养，光镜、透射电镜观察所获细胞形态，流式细胞术检测细胞周期，体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果：原代及传代MSCs为漩涡状贴壁生长的长梭形成纤维细胞样细胞，传代细胞具有类似的生长规律；透射电镜示所获细胞具有较强的自我更新能力；细胞周期分析显示87％以上细胞处于G0／G1期；MSCs经体外诱导可向成骨细胞、成脂肪细胞分化。结论：利用密度梯度离心联合贴壁培养法可分离、纯化MSCs，所获细胞具备成体干细胞特性，于体外可大量扩增，做为种子细胞和载体细胞满足实验需要。     

人脐带源和胎盘源间充质干细胞的生物学特性比较

目的：探讨人脐带和胎盘来源间充质干细胞（ MSCs）的分离培养和生物学性状的差异,为MSCs的临床应用提供选择依据。方法利用组织贴壁法分离培养脐带MSCs,酶消化法分离培养胎盘MSCs。传代培养后于倒置显微镜下观察两种不同来源的MSCs的细胞形态,流式细胞仪检测两者表面标志物表达的差异,通过细胞周期和群体倍增时间测定比较两者生长增殖能力,体外成骨和成脂诱导比较其分化能力。结果胎盘MSCs和脐带MSCs为贴壁生长、形态均一的成纤维样或长梭形外观,两种细胞均高表达CD90、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR。胎盘MSCs的群体倍增时间为40．8 h,52．12％处于G0／G1期,脐带MSCs的群体倍增时间为39．5 h,57．50％处于G0／G1期,表明两者增殖能力旺盛,且无明显差异;两者在体外均可诱导分化成骨细胞和脂肪细胞。结论胎盘源MSCs具有与脐带源MSCs相似的生物学特性,两者均可作为临床治疗用细胞或组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞的应用研究进展

间充质干细胞 (ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＭＳＣ)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞 ,主要存在于全身结缔组织和器官间质中 ,以骨髓组织中含量最为丰富 ,胎儿脐血中亦可分离得到[1 ] 。在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力 ;同时 ,ＭＳＣ还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆性细胞分化[2 5] 。这似乎突破了ＭＳＣ仅为中胚层干细胞的概念 ,展示了ＭＳＣ具有更为重要的理论研究意义和更为广阔的应用前景。笔者就近年来骨髓间充质干细…     

骨髓间充质干细胞治疗脑梗死的研究进展

目前,溶栓和神经保护治疗的进展将脑梗死的治疗推进到一个新时代。但是大部分患者在治疗后仍遗留有瘫痪、失语等严重残疾。近年来应用间充质干细胞（MSC）治疗脑梗死越来越被人们所关注。本文就间充质干细胞在治疗脑梗死方面的研究现状作如下综述。     

骨髓间充质干细胞的活体标记示踪技术及其研究进展

骨髓基质干细胞因具有不断自我更新和向多种细胞分化的能力而备受关注.通过干细胞移植并诱导其向各种受损组织细胞分化,可促进受损组织的再生和修复,为疾病的治疗开辟了新途径.为更深入认识移植细胞实现其修复功能的机制,需要有效的标记方法追踪移植细胞在受者体内的分布、迁移、增殖和分化情况.     

骨髓间充质干细胞对大鼠肺组织胶原的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞(MSCs)对博来霉素(BLM)引起的肺损伤大鼠肺组织胶原的影响,初步探讨其作用机制。方法:将SD大鼠MSCs异体注入受体大鼠体内,2周后观察肺组织病理学变化,同时检测肺组织羟脯氨酸含量及转化生长因子β1(TGFβ1)、血小板源性生长因子-A、B(PDGF-A,B)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)mRNA的变化。结果:MSCs的植入可使增生的大鼠肺泡间隔、基质胶原及Ⅰ、Ⅲ型胶原明显降低,使升高的肺组织羟脯氨酸及TGFβ1、PDGF-A,B、及IGF-ⅠmRNA的表达显著降低。结论:MSCs可减少肺损伤大鼠肺组织中的胶原含量,此作用与MSCs降低了多种促纤维化细胞因子的表达有关。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及示踪优化

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)的标记和示踪方法,优化示踪技术。方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过流式细胞仪鉴定细胞表面抗原(CD29、CD34、CD45、CD90),分别用BrdU、DAPI以及GFP 3种方法标记干细胞,DAPI和GFP标记率直接通过荧光显微镜进行鉴定,BrdU标记率通过细胞免疫化学法鉴定,比较3种示踪技术的优缺点。结果流式细胞仪鉴定结果显示MSCs CD29、CD90表达阳性,CD34、CD45表达阴性。3种标记方法对细胞均未显示明显毒性。终浓度10μmol/L BrdU标记48h、终浓度1μg/ml DAPI标记12h分别为其最佳标记浓度及时间。感染复数MOI=8时,GFP慢病毒感染MSCs 12h,感染率可达90%以上。结论 GFP基因转染是一种稳定、可靠、安全的标记方法,对成体干细胞的示踪有重要价值。     

人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化

为建立分离纯化、大鼠扩增人骨髓间充质MSC,改进其冰冻保存的方法,并初步探索其体内向软骨细胞分化的最佳方法,以Percoll(1.073g/ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞,用含经筛选的10％的胎牛血清的低糖DMEM体外培养扩增骨髓干细胞（MSC）,FCM鉴定细胞纯度,传代2次以后的细胞吸附于明胶海绵内,以TGF－β为主要刺激因子体外诱导1周,植入裸鼠皮下。在不同的时间取出组织块,甲苯胺蓝染色显示细胞外基质。结果发现,体外培养扩增的人间充质MSC表达CD166、CD29、CD44等表面抗原,不表达CD34、CD45、HLA－DR等抗原;MSC可以不经消化,直接在原培养瓶内冻存在－70℃低温冰箱,3个月后复苏的细胞生物学特性没有明显改变;体外诱导的细胞植入裸鼠皮下4周后即出现软骨细胞特有的结构。说明骨髓MSC具有独特的生物学特征,体外培养的MSC具有体内成软骨能力,应用MSC构建软骨组织具有一定的可行性。     

成人骨髓源性神经干细胞诱导分化实验研究

为探讨成人骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性 ,无菌条件下行骨穿 ,梯度密度离心分离获取成人骨髓源细胞 ,以“CYTOKINE·神经干细胞培养液”培养 ,确定神经干细胞的最佳体外生存环境。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖情况 ;以NESTIN、NSE及GFAP免疫细胞化学方法分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。细胞培养所涉及的细胞因子主要有GDNF(2 0ng/ml)、LIF(10ng/ml)和RA(0 5 μg/ml)等。结果发现 ,成人骨髓源细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的神经干细胞 ,后者形成细胞球 (或称“神经球”) ,该细胞球表达特殊的神经干细胞NESTIN抗原 ;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养 ,单个的细胞又很快形成新的神经球。神经干细胞球进一步分化 ,可见到有的细胞胞体增大并出芽 ,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞 ,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系 ,表达NSE或GFAP抗原。说明成年人骨髓在一定条件诱导下可以生成神经干细胞 ;用人骨髓组织诱导神经干细胞作为种子细胞具有可行性和有效性     

狗骨髓基质干细胞体外分化为肌源性细胞的初步观察

用贴壁法体外分离骨髓基质干细胞,实验组5—氮胞苷诱导,对照组加入等量培养基,用相差显微镜和免疫组织化学方法观察、鉴定培养细胞。探讨成年狗骨髓基质干细胞体外诱导分化为肌细胞的可行性,为心肌梗死和心力衰竭的细胞移植治疗提供新的细胞系。结果表明,实验组诱导后4周,多数培养细胞由梭形变为杆状,免疫组织化学检查结蛋白、平滑肌肌动蛋白和肌钙蛋白I染色阳性;对照组多数培养细胞为梭形,免疫组织化学检查结蛋白染色弱阳性,平滑肌肌动蛋白染色弱阳性,肌钙蛋白I染色阴性。结果提示,成年狗骨髓基质干细胞体外可诱导分化为肌源性细胞。     

体外诱导骨髓基质细胞向神经干细胞和成熟神经细胞分化的实验研究

探索骨髓基质细胞（BMSCs）分化为神经干细胞和成熟神经细胞的可行性,为BMSCs在神经科学领域的应用提供依据。以犬的BMSCs为实验对象,利用bFGF、RA、GDNF等作为增殖或分化诱导因子,对各阶段细胞进行免疫细胞化学鉴定。结果发现,增殖培养24－72h见细胞分裂像和克隆单位;诱导培养3天,部分细胞开始表达NSE或GFAP,继续增殖培养仍可见细胞克隆（干细胞特性）;诱导培养第10天有成熟神经细胞形成（成分鉴定证实）。说明BMSCs在体外培养条件下,经过多种因子的“程序性”作用,可以向神经干细胞、成熟神经元及胶质细胞方向分化。提示BMSCs可作为“种子细胞”在神经科学领域加以利用。     

逆转录病毒介导hBMP7基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达

采用粘－粘端连接方法构建hBMP7逆转录病毒载体,重组质粒转染包装细胞PT67后,制备含目的基因的重 逆转录病毒液感染兔骨髓间充质干细胞。限制性内切酶切分析筛选插入方向正确的重组质粒并进行基因测序。结果显示,hBMP7逆转录病毒载体中外源基因插入方向正确、无碱基错误和缺失。原位杂交和免疫组织化学检测表明,感染后2天经基因转染的BMSc原位杂交和免疫组化检测结果呈阳性,未经转染的细胞检测结果呈阴性。转染的BMSc经G418筛选至4周仍有外源BMP蛋白的表达。提示采用逆转录病毒介导方法转染的BMSc中可有源性BMP7mRNA和蛋白的表达。     

hBMP7基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖及胶原合成的影响

使用含hBMP7基因的重组逆转录病毒液感染兔骨髓间充质干细胞（BMSc）,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期,^3H脯氨酸掺故法检测I型胶原合成和表达情况。结果显示,经hBMP7基因转染的BMSc与空载体转染及未转染的BMSc在细胞增殖、细胞周期表现方面无显著性差异,经转染的BMSc合成胶原显著高于空载体转染和未转染者。提示采用逆转录病毒介导转染BMSc后能促进细胞的胶原合成,对BMSc增殖和细胞周期无显著影响,有利于进一步 应用于构建组织工程化骨组织。     

培养人骨髓基质细胞接种多孔陶瓷再造骨组织

为探讨人骨髓基质细胞作为骨组织工程种子细胞的可行性,作者观察了体外培养的人骨髓基质细胞复合多孔珊瑚羟基磷灰石在体内的成骨能力。穿刺抽吸入髂骨区骨髓基质细胞,体外培养扩增、诱导后,与多孔珊瑚羟基磷灰石复合,植入裸鼠皮下。术后4、8周取材,通过组织学检查了解植入物体内成骨情况。结果显示,复合物在体内成骨活跃,说明人骨髓基质细胞可以作为骨组织工程的种子细胞,珊瑚羟基磷灰石可作为一种细胞种植基质材料。     

多药耐药基因的人骨髓细胞转染及其对抗癌药的抗性增强作用

为探讨mdrl基因转染增强人骨髓细胞对抗癌药的抵御能力的可能性.通过脂质体介导,用含人mdrlcDNA表达质粒pHaMDR1/A,将mdrl基因转染人骨髓细胞,分别采用流式细胞术和免疫组化检测转染细胞mdrl基因的表达产物--P糖蛋白(Pgp),并用罗丹明试验证实其生物活性.同时,采用集落培养及抗性试验检测mdrl基因转染的人骨髓细胞对阿霉素、秋水仙碱、长春新碱和Vp16的抵御能力.结果mdrl基因被成功地导入了人骨髓细胞并获得了表达,罗丹明试验证实了Pgp具有完整的生物功能.mdrl基因转染的人骨髓细胞对上述抗癌药的抵御能力明显增强.     

骨形成蛋白-2和地塞米松对骨髓基质细胞的联合生物学效应

探讨重组人骨形成蛋白－2（rhBMP-2）的地塞米松（Dex）单独和联合作用对骨髓基质细胞（BMSC）增殖和分化的影响。利用四唑盐比色法（MTT）、细胞总蛋白考马斯亮蓝测定法及碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒分别测定不同浓度的rhBMP-2和Dex单独和联合作用后BMSC的增殖和分化情况。结果显示,rhBMP-2对BMSC的增殖和ALP的表达均有促进作用,Dex促进ALP的表达,但高浓度的Dex对BMSC有增殖抑制,rhBMP-2和Dex联合作用后BMSC的增殖和ALP活性较单独作用有更明显的作用。提示 rhBMP-2和Dex联合作用对于促进BMSC的增殖和向成骨细胞分化有协同作用。     

人、犬和小鼠骨髓基质细胞的细胞骨架观察

本文观察了人、犬和小鼠体外培养骨髓基质细胞细胞骨架之异同.实验结果表明,应用Coomassie blue染色可清晰显示细胞骨架结构.人和犬的骨髓基质细胞以成纤维样细胞为多.胞体呈梭形,胞浆内有粗大的细胞骨架.其纤维丝走向与细胞长轴一致.小鼠的骨髓基质细胞由成纤维样细胞、类巨噬细胞和类网状细胞混杂组成.后两类细胞中缺乏明显的细胞骨架结构.