大鼠骨髓间充质干细胞体外生长增殖特点的实验研究

目的 了解应用全骨髓贴壁法分离的大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长、增殖特点,以及接种密度、培养时间对细胞增殖的影响,为预防和治疗机体退行性疾病等提供多潜能的种子细胞.方法 通过全骨髓贴壁法分离SD大鼠BMSCs,在体外条件下培养,应用倒置显微镜观察细胞形态学特征及流式细胞仪鉴定、检测大鼠BMSCs表面标志抗原,并通过分析对接种于96孔板不同接种密度(2×103、5×103、1×104个细胞/ml)连续培养10 d细胞生长曲线的特点,研究接种密度和培养时间对BMSCs生长、增殖的影响.结果 流式细胞仪分析CD29细胞阳性率为97.68%(7607/7788),CD34、CD45细胞阳性率分别为7.93%(661/8340)、2.76%(215/7788),符合BMSCs表面标记物表达特征.通过换液及消化传代,3代以上的BMSCs较为均一纯化,呈典型的旋涡或放射状生长,约传代至7～10代时出现细胞衰老并衰老细胞逐渐增多;中等密度(5×103个细胞/ml)接种细胞的生长曲线呈较典型的S形曲线.第1、2天为潜伏期;第3～5天为对数生长期;第6天细胞数目进入平台期;第8～10天细胞数量稍有下降.结论 全骨髓贴壁法是获得BMSCs较为简便有效的方法,且中等量接种密度更有利于细胞增殖,可获得更多的种子细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

[目的]建立分离纯化、培养、扩增骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)鉴定的方法.[方法]采用密度梯度离心及贴壁培养相结合的方法分离、培养、扩增MSCs,并用流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD44、CD105. [结果]培养48 h后即可见呈集落生长的细胞,72 h后可见少量贴壁MSCs细胞,7 d后贴壁细胞明显增多,梭形栅栏样分布,融合度达70%以上.第3代原代培养细胞表面标志CD44+、CD105+在95%左右,CD34的表达率甚低.[结论]联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法,可以获得纯度较高的骨髓MSCs     

AAV介导NGF过表达载体转染BMSCs对高强度聚焦超声致活体SD大鼠坐骨神经损伤模型保护作用

目的干细胞是当前研究的热门领域,利用干细胞定向分化作用可以促进神经损伤修复,但是干细胞具有分化方向不定和易老化的特点。本研究探究腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)介导神经生长因子(nerve growth factor,NGF)过表达载体转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对高强度聚焦超声致活体SD大鼠坐骨神经损伤模型的保护作用。方法分离和培养人源BMSCs,采用流式细胞仪检测BMSCs的CD29,CD45和CD90等表面蛋白表达。采用免疫组织化学染色鉴定BMSCs表面CD34和CD44表达。AAV腺病毒构建NGF过表达质粒,通过高强度聚焦超声制备SD大鼠坐骨神经损伤模型,根据处理方式不同,将SD大鼠分成空白对照组,模型组,BMSCs组和NGF过表达组。利用HE染色,电镜方法观察坐骨神经形态,示踪金染色观察神经接头的聚集,TUNEL染色检测细胞凋亡,RT-qPCR检测NGF和caspase-3mRNA表达。结果流式细胞仪检测第2代BMSCs表面蛋白,CD29阳性率为98.03%,CD90阳性率为96.92%,CD45阴性率为77.2%,共表达CD29、CD90且CD45表达阴性的细胞数占总细胞数的96.89%。BMSCs细胞表面CD34和CD44免疫组织化学染色呈阳性。慢病毒转染效率>90%,转染效率较高。HE染色结果中模型组大鼠坐骨神经有明显断裂,BMSCs组大鼠坐骨神经较模型组裂痕缩小,而NGF过表达组断裂处几乎不可见。电镜结果显示,模型组大鼠坐骨神经密度少,且形态不规则,BMSCs组大鼠坐骨神经较模型组密度大,且周边为纤维组织填充,NGF过表达组大鼠坐骨神经密度大,排列较为规则。示踪金染色显示NGF过表达组神经接头处可见神经聚集。RT-qPCR结果显示空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组NGF mRNA相对表达量分别为1.18±0.05、0.77±0.06、1.75±0.07和3.09±0.08,F=9.082,P=0.019;空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组caspase-3mRNA表达量分别为2.03±0.09、5.05±0.23、3.12±0.09和1.23±0.22,F=9.177,P=0.011。空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组细胞凋亡率分别为(9.34±0.32)%、(31.24±3.43)%、(22.09±2.66)%和(4.97±1.05)%,F=9.664,P=0.014。结论腺病毒介导NGF过表达质粒转染BMSCs可以促进坐骨神经损伤大鼠坐骨神经修复,其机制可能是通过升高NGF mRNA,降低caspase-3mRNA水平实现。     

大鼠脂肪间充质干细胞与壳聚糖支架体外联合培养

目的采用大鼠脂肪间充质干细胞与壳聚糖支架体外联合培养为颅脑损伤大鼠模型神经修复提供种子细胞。方法取SD大鼠附睾周围脂肪组织,分离培养脂肪间充质干细胞,传至第3代流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD44表达;冻干燥法制备壳聚糖支架材料,再取第5代细胞以2×106/m L的密度接种于壳聚糖三维支架上,促进其向神经元和胶质细胞方向分化;免疫荧光染色鉴定细胞分化结果。结果分离培养的脂肪间充质干细胞表面标记CD29、CD90、CD44阳性表达率分别为91.05%、92.76%、96.56%,达到理想的纯度;制备的壳聚糖三维支架具有合适的三维多孔结构;培养基诱导7 d左右可见检测神经细胞特异性标志(巢蛋白和β-tubulinⅢ)的表达,分化后的大部分细胞呈现典型的神经元样改变,细胞伸出细长突起或网状突起,可见较多的细胞形成网络连接。免疫荧光染色鉴定结果证实,神经球高表达巢蛋白(Nestin)阳性率(65.23±0.98)%,分化细胞β-tubulinⅢ阳性率(62.35±5.71)%,微管相关蛋白2(MAP2ab)阳性率(12.87±2.63)%。结论大鼠脂肪间充质干细胞联合壳聚糖支架培养可在体外培养得到较高比例神经细胞特异性标志的Nestin及β-tubulinⅢ阳性细胞,并有一定比例MAP2ab阳性细胞出现,该特异性标志表达的细胞用于大鼠颅脑外伤模型神经修复实验。     

与机械牵张盆底肛提肌卫星细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化抗原和结蛋白表达的影响

目的研究与机械牵张的盆底肛提肌卫星细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成肌分化的影响;探索在体外条件下诱导BMSCs向肌细胞分化的微环境的创建以及成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,MyoD)和结蛋白(des minfilament,Desmin)蛋白的表达。方法选择7 d龄SD大鼠,利用密度梯度离心法体外分离纯化大鼠BMSCs。取大鼠盆底肛提肌组织,自行分离传代,获得大鼠盆底肛提肌卫星细胞。对第3代盆底肛提肌卫星细胞施以10%形变,1 Hz,12 h的周期性单向机械牵张刺激,机械牵张后的盆底肛提肌卫星细胞与纯化培养后的第4代BMSCs间接共培养6d。采用实时定量RT-PCR方法检测共培养后BMSCs中MyoD和Desmin mRNA的表达情况;Western-blot法检测MyoD和Desmin的蛋白含量。结果与对照组相比,共培养组和机械牵张共培养组BMSCs的MyoD和Desmin mRNA和蛋白的表达水平均有显著增高(P0.05);与共培养组相比,机械牵张共培养组BMSCs的MyoD和Desmin mRNA和蛋白的表达量也有显著增高(P0.05)。结论与机械牵张刺激的盆底肛提肌卫星细胞间接共培养可以促进BMSCs合成MyoD和Desmin,诱导BMSCs向肌细胞分化。     

大鼠内皮祖细胞的培养及鉴定

目的 探索大鼠内皮祖细胞的分离培养,为缺血性疾病细胞移植治疗提供实验方法.方法 采集大鼠骨髓,梯度密度离心法分离单核细胞,内皮细胞培养液M199培养基培养(含20%FCS+15 ng/ml VEGF),种植于提前包埋了纤维连接蛋白的六孔板培养,应用免疫荧光和流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133.并通过检测其对FITC标记的UED-1的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定.结果 经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、Flk-1,部分表达CD133.大鼠骨髓单个核细胞经体外诱导分化,培养第5～14天的贴壁细胞不同程度的表达CD34、CD133、Flk-1和CD31.培养第9天流式细胞仪检测其阳性率分别为(40.12±6.28)%、(15.62±4.31)%、(44.05±8.20)%和(76.1±7.20)%,细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL,并且在Matrigel上可以形成毛细血管样.结论 大鼠骨髓可以分离培养内皮祖细胞并能体外扩增,为内皮祖细胞的移植研究奠定了基础.     

辛硫磷对大鼠骨髓间充质干细胞DNA损伤、细胞凋亡及P53蛋白表达的影响

目的研究辛硫磷对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)DNA的损伤作用及其对氧化损伤、细胞凋亡和P53蛋白表达的影响。方法 Percoll离心法分离培养大鼠BMSCs,正常传代。取第3代BMSCs,调整细胞密度为1.0×106/瓶,当细胞至亚融合状态,分别以0(对照)、0.2、2和20μg/L的辛硫磷浓度染毒24h。采用MTT法检测BMSCs的存活率,分光光度比色法检测BMSCs超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,单细胞凝胶电泳检测BMSCs的DNA损伤,流式细胞术检测大鼠骨髓间充质干细胞凋亡率,Western blotting检测BMSCs的P53蛋白表达水平。结果与对照组相比,0.2～20μg/L辛硫磷染毒24h,可诱发大鼠BMSCs的DNA损伤,且具有剂量-效应关系;各染毒组大鼠BMSCs的存活率、SOD和CAT活性均显著下降(P<0.05),细胞凋亡率和MDA含量均显著升高(P<0.05);辛硫磷染毒可以诱导大鼠BMSCs P53蛋白表达水平的增加(P<0.05)。结论辛硫磷可诱导大鼠BMSCs氧化损伤、DNA损伤、细胞凋亡和P53蛋白表达,且具有剂量-效应关系。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养与生物学特性的实验研究

目的建立可行的人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells,h MSCs)的培养方法,并对其生物学特性进行初步研究。方法于2013年1月—2014年6月采用密度梯度离心法和贴壁法分离培养h MSCs,用免疫组织化学(免疫组化)法鉴定表面标志并分析其核型,光镜观察其生长和形态变化。结果本实验分离的h MSCs纯度高、贴壁好,以长梭形为主,至少在传代培养6代内增殖快,性状稳定。免疫组化染色显示h MSCs表达CD29和CD44,不表达CD45及CD34,核型正常。结论密度梯度离心法可获得增殖活跃且纯度较高的h MSCs,有特征性表型,适合体外较长期的培养h MSCs。     

与盆底韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞弹性蛋白、LOX及Fibulin-5mRNA表达的影响

目的:研究与盆底韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化的影响,探索在体外条件下诱导BMSCs向韧带成纤维细胞分化微环境的创建并检测诱导分化细胞内弹性蛋白、LOX、Fibulin-5的表达。方法:选择7天SD大鼠,利用密度梯度离心法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞并对其进行鉴定;取大鼠盆底韧带组织,自行分离传代,获得大鼠盆底韧带成纤维细胞;取纯化的第四代盆底韧带成纤维细胞与纯化培养后的第四代骨髓间充质干细胞间接共培养;实时定量RT-PCR检测弹性蛋白、LOX及Fibulin-5在不同共培养天数BMSCs中mRNA的表达情况。结果:与相应天数阴性对照组相比,3天共培养组弹性蛋白、LOX、Fbulin-5 mRNA的表达量增加,但均无显著变化(P>0.05),6、12天共培养组mRNA的表达量均显著增高(P<0.05);与3天对照组相比,6天对照组和12天对照组的表达量均无显著变化(P>0.05);与3天共培养组相比,6天共培养组的表达量增高,但差异无统计学意义(P>0.05),12天共培养组的表达量均有显著增高(P<0.05)。结论:与盆底韧带成纤维细胞间接共培养可以促进BMSCs弹性蛋白、LOX、Fbulin-5mRNA的表达,这一结果为BMSCs作为韧带组织工程的种子细胞在体外诱导分化条件的探索提供了一条新的研究思路。     

C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养、分化及两种不同品牌血清对其增殖的影响

目的 研究C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)体外分离培养、分化及比较含两种不同品牌血清培养基对其生长的影响,探索体外培养C57BL/6小鼠BMSCs更优方法。方法 差速贴壁法体外分离提取BMSCs,分别用含10%Yeasen胎牛血清和10%Gbico胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养,分别在2 d、4 d、6 d(后)通过倒置显微镜观察两组BMSCs的细胞形态;CCK-8法检测其生长趋势;免疫荧光染色鉴定表型;不同诱导培养基诱导其成骨、成脂分化。结果 成功分离BMSCs,原代培养细胞呈长角形涡状排列生长,第二代BMSCs免疫表型鉴定结果显示CD44、CD90、CD106为阳性表达,CD34为阴性表达;成骨、成脂诱导分化后,细胞茜素红、油红染色均呈阳性;CCK-8检测显示含Gbico血清培养基所培养的BMSCs更容易形成细胞集落且数量更多,生长上升趋势更为明显。结论 两种血清都能促进BMSCs的体外增殖,Yeasen血清有着更高的性价比,Gbico血清则在促进增殖方面表现更加良好。     

骨髓间充质干细胞的三维培养

目的：研究三维培养环境下骨髓间充质干细胞的生长情况,探讨骨髓间充质干细胞复合支架构建组织工程软骨的可行性。方法：全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）,免疫细胞化学测定其细胞表面抗原CD44、CD45,对BMSCs进行鉴定;冻干法制备壳聚糖（Chitosan,CS）支架,扫描电镜观测支架孔径;取BMSCs复合CS支架,通过三维培养观察BMSCs在CS支架上不同时段的生长情况。结果：三维培养环境下骨髓间充质干细胞生长良好,细胞在支架上分泌大量细胞外基质,并与支架黏附良好。结论：骨髓间充质干细胞可作为组织工程的种子细胞,构建组织工程软骨。     

诱导分化骨髓干细胞（MSCs）构建膀胱的实验研究

目的分离提起大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,通过组织工程技术．构建组织构建膀胱,为进一步临床应用奠定基础。方法将sD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后,以生长状态良好的骨髓问充质干细胞接种于制备好的聚乳酸一聚乙醇酸支架上,进行体外联合培养,构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程构建膀胱。结果体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好,传代扩增容易,骨髓间充质干细胞在聚乳酸一聚乙醇酸基质中生长良好,可体外构建组织工程膀胱。结论通过利用体外扩增培养的骨髓问充质干细胞制备的上皮细胞可以体外聚乳酸一聚乙醇酸支架构建组织工程膀胱。     

自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植治疗扩张型心肌病1例报告

目的观察自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植治疗扩张型心肌病的可行性及临床效果。方法原发性扩张型心肌病1例,心功能NYHA Ⅳ级。抽取患者骨髓,用密度梯度法分离骨髓单个核细胞,经左、右冠状动脉分别直接注入经分离自体骨髓单个核细胞,术后观察及随访患者症状,心功能,心血管事件。结果术中和术后未见不良影响,无新发严重心律失常,心功能稳定。术后第三天患者因咽痛干咳伴发热6 小时,第五天出院,运动能力增加。结论自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植治疗扩张型心肌病技术简单, 安全,对患者创伤小,短期观察对患者未见不良影响,而运动能力增加,长期效果有待随访观察。     

强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化的影响

目的观察强肌健力口服液含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)成肌分化的影响。方法用密度梯度离心法分离大鼠MSCs,5-溴脱氧嘧啶(Brdu)和CD44双重免疫组化鉴定,传3代后的MSCs分为强肌健力口服液含药血清组和空白对照组,免疫组化染色鉴定肌凝蛋白(Myosin)、结蛋白(Desmin)的表达。结果诱导后第3d,部分细胞出现Desmin和Myosin。结论强肌健力口服液含药血清诱导MSCs向成肌细胞定向分化。     

自体骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤的疗效

[目的]观察自体骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)的治疗效果。[方法]体外分离纯化大鼠骨髓基质干细胞,取46例Wistar大鼠采用改良的Allen’s装置在T11水平制成大鼠脊髓损伤模型,随机分成基质干细胞(MSCs)移植组(n=23)和对照组(n=23),分别于术后1、4周通过BBB评分观察大鼠SCI后功能的恢复情况。[结果]术前所有大鼠BBB评分均为21分,脊髓损伤后为0分,所有大鼠神经功能缺损症状随着时间的推移都有不同程度的减轻。两组术后4周时BBB评分均较术后1周时高,差异有统计学意义(P﹤0.05)。移植组术后1、4周时BBB评分均高于对照组,差异有统计学意义(P﹤0.05)。[结论]BMSCs移植有助于大鼠脊髓损伤后的修复重建和功能恢复。     

自体骨髓间充质干细胞治疗矽肺的观察

目的 探讨自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗矽肺的安全性和治疗作用.方法 选取我院确诊的10例矽肺患者,经医学伦理委员会批准,患者签署知情同意书后,无菌抽取患者骨髓液100 ml,体外分离、纯化培养BMSCs,收获第3代BMSCs 5×107个,细胞质量检测合格后,用生理盐水50ml稀释,静脉滴注同输,每周1次,连续3次,其中3例患者采用肝细胞生长因子(HGF)基因修饰的自体BMSCs输注.移植后6个月、9个月,观察患者的临床症状、胸部CT、X线胸片、肺功能、T细胞亚群、血清中IgG、铜蓝蛋白(CP)等指标.结果 治疗9个月后,所有患者咳嗽、咳痰、胸闷症状基本消失;肺功能:最大肺活量(FVC)从治疗前平均(71.2％±17.0％)提高到(84.0％±10.9％),第1秒最大呼气量(FEV1.0)从治疗前平均(67.5％±17.7％)提高到(80.6％±14.9％),与治疗前比较,差异有统计学意义(P＜0.01);血清中CP和IgG较治疗前明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01);采用HGF基因修饰的自体BMSCs治疗的患者胸片和肺部CT提示有不同程度好转,肺纹理较治疗前减少、清晰,双肺结节影较治疗前缩小,边缘较治疗前清晰,结节影密集及分布均较治疗前有所减少.结论 自体BMSCs移植治疗矽肺对临床症状改善有一定效果,HGF基因修饰的自体BMSCs可使小结节影缩小,略有变淡,肺纹理较治疗前减少.     

改良的人脐带间充质干细胞培养方法

目的:建立人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法,探讨hUCMSCs的成脂成骨分化潜能。方法:用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞,流式细胞仪检测其免疫表型;用不同的培养体系诱导hUCMSCs向成骨细胞及成脂细胞分化,并对其进行鉴定。结果:改良的hUCMSCs培养方法培养细胞纯度更高,在相同的培养时间内,改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍,是传统组织块法的20～30倍,细胞呈长梭形生长;高表达CD73、CD90、CD44、CD105,不表达CD31、CD45、CD34;茜素红染色及油红O染色证实了hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论:建立了hUCMSCs的培养新方法,证实了hUCMSCs的增殖能力和多向分化潜能,为其治疗应用提供支持。     

骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内定植研究

目的：观察骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内的定植情况。方法：选择健康SD大鼠34只,按随机数字表法分为MSCs干预组（A组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注MSC 1×106个/mL）,肺气肿模型组（B组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注等体积PBS）及MSC对照组（C组,10只,正常大鼠,尾静脉输注MSCs 1×106个/mL）,正常对照组（D组,4只,正常大鼠,尾静脉输注等体积PBS）,采用烟熏法复制大鼠肺气肿模型。全骨髓培养法体外培养扩增雄性SD大鼠来源的MSCs,经GFP标记细胞后将其经尾静脉注入肺气肿模型SD大鼠体内,24 h内处死大鼠,取肺组织迅速冰冻切片,共聚焦激光显微镜下观察观察转染GPF的间充质干细胞在大鼠肺内定植情况。结果：成功培养具有分化潜能的骨髓间充质干细胞,MSCs传至第4代时有99.5%表达CD44、99.6%表达CD29等间充质干细胞表面标志,仅有0.4%表达CD34、1.0%表达CD45单核细胞以及造血干细胞表型;成功复制大鼠肺气肿模型,香烟烟雾暴露组（A、B组）平均肺泡间隔为（119.0±26.2）μm,高于对照组（C、D组）的（89.8±17.3）μm,差异有统计学意义（P〈0.05）;平均肺泡数为（173.9±68.3）个/mm2低于对照组的（280.3±104.0）个/mm2,差异有统计学意义（P〈0.05）;显微共聚焦发现MSCs经尾静脉注入大鼠体内24 h后可见A组大鼠肺组织内转染绿色荧光蛋白质粒的MSCs,而B组、C组及D组均未见转染荧光。结论：骨髓间充质干细胞经尾静脉输注入后可在肺气肿模型大鼠肺内定植,为MSCs治疗慢阻肺可能提供理论依据。