骨组织工程研究中的美学考量

目的：分别以珊瑚羟基磷灰石(CHA)、藻酸钙为成骨细胞载体，观察裸鼠体内的构建特定形态和可注射组织工程骨的可行性。方法：取兔髂骨，获取骨髓基质干细胞，经体外扩增培养诱导后，获得骨髓基质成骨细胞，分别与CHA和藻酸盐复合，植入和注射于裸鼠背部皮下，6、8周后进行大体观察、组织学和X线检查，观察软骨和骨的形成。以单纯CHA和藻酸盐植入作为对照。结果：植入CHA／成骨细胞组和注射藻酸盐/成骨细胞复合物组均有骨样组织形成，具备骨髓腔样结构，而对照组无骨形成。结论：CHA和藻酸盐均是较好的骨组织工程支架材料，复合成骨细胞后可构建特定形态和可注射组织工程骨。     

藻酸钙复合材料构建组织工程化骨软骨的实验研究

目的 :对经体外培养的骨髓基质干细胞与藻酸钙及生长因子复合形成的组织工程性骨软骨进行形态学观察。方法 :以可注射性藻酸钙凝胶作为细胞载体 ,将体外扩增的BMSCs和生长因子IGF Ⅰ、TGF β分为 5种组合 ,注射于自体新西兰白兔皮下 ,分期取材观察。结果 :藻酸钙凝胶复合BMSCs及IGF Ⅰ和TGF β能在皮下形成软骨组织 ,逐渐转化为骨组织并最终被吸收 ,无免疫排斥及毒性反应。结论 :BMSCs 藻酸钙 生长因子复合材料能形成软骨及骨组织。藻酸钙适合BMSCs生长 ,是一种良好的软骨组织工程载体。     

复合成骨细胞藻酸盐凝胶注射植入修复骨缺损的实验研究

目的　探索一种简便易行、成骨可靠的骨组织工程学修复骨缺损的新方法。方法　将酶消化法分离培养的兔骨膜成骨细胞复合于 1 5 %藻酸钠溶液 ,再加入葡萄糖酸钙 ,制备成成骨细胞密度为 1× 10 7/ml、钙离子浓度为 5 0mmol/L的藻酸钙水凝胶。将 2 0只健康成年新西兰大白兔双侧桡骨制作成 10mm骨缺损模型 ,左侧经皮注射成骨细胞—藻酸钙水凝胶复合物 (试验侧A) ,右侧注射单纯细胞悬液 (对照侧B)。于术后 2、 4、 6、 8、 12周分别行X线检查及组织学观察。结果　X线和组织学观察表明 ,在整个试验过程中 ,试验侧均较对照侧成骨活跃 ,骨再生迅速 ,12周内全部骨性愈合 ,而对照侧尚有 2例未愈合。结论　成骨细胞—藻酸钙水凝胶复合物注射植入修复骨缺损效果理想 ,可望应用于临床。该方法有较多优点 :①简便易行 ,创伤小 ,对于软组织条件差的骨缺损、骨不连更有价值 ;②该水凝胶具有适针性、可注射性及理想的可塑性 ,能满足不同的临床及试验需要 ;③具有可靠的成骨效应     

骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶修复全层半月板无血运区缺损

目的 观察骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶注射式修复全层半月板无血运区缺损的效果.方法 2008年6月至2009年2月制造成年山羊半月板前角无血运区全层缺损模型.以自体骨髓基质干细胞复合可注射藻酸钙凝胶修复半月板缺损(Ⅰ组),同时设立单纯载体组(Ⅱ组)和空白对照组(Ⅲ组).术后4、8、16周处死动物,行大体观察,组织学观察、电镜观察和MRI检查并比较修复效果.结果 Ⅰ组缺损完全被修复组织填充,结合紧密,与正常半月板组织相似,在4～16周效果逐渐改善,大体观察优于其他各组.光镜见细胞随凝胶纤维排列分布,载体纤维间隙大多为细胞分泌基质所充填,细胞排列密集,基质分布均匀.透射电镜见Ⅰ组细胞呈软骨细胞样形态,细胞突起较多,细胞器丰富,细胞为不同走向排列的纤维包绕.MRI检查发现Ⅰ组修复效果较好.结论 骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶注射可有效地修复全层半月板无血运区缺损.     

可注射性藻酸钙凝胶载体组织工程性软骨的实验研究

目的 对经体外培养的软骨细胞与藻酸钙凝胶载体复合形成的组织工程性软骨进行组织形态学观察。方法 取 2周龄新西兰白兔的膝关节软骨细胞,经体外培养两次传代后与藻酸钠溶液复合,使细胞密度为 5× 10 6/ml、 NaCl 0.135 mol/L、 K 2HPO 4 0.1 mol/L、藻酸钠的质量分数为 1％,然后注入葡萄糖酸钙使终浓度为 40 mmol/L。在实验组 (A、 B组 )兔的背部皮下注入复合藻酸钙载体的软骨细胞悬液,对照组 (C、 D组 )动物或注入无载体的软骨细胞悬液或注入无细胞的藻酸钙载体,分别于注射后第 2周、第 4周取材,进行 HE和甲苯胺蓝染色。结果 实验组,于注射复合软骨细胞的藻酸钙凝胶载体第 2周时, HE染色结果显示皮下注射点出现大量软骨细胞增殖,第 4周时有软骨组织形成;甲苯胺蓝染色见有软骨细胞和软骨基质形成。在注入无载体的软骨细胞悬液组 (C组 ),部分动物的皮下注射点有少量软骨组织形成,而在注入无细胞的藻酸钙载体组 (D组 )则未见软骨形成。结论 应用可注射性藻酸钙凝胶载体复合软骨细胞可在同种异体动物体内形成新生软骨组织。     

以藻酸钙为载体的可注射组织工程骨行隆鼻术的实验研究

目的：研究可注射组织工程骨做为隆鼻术植入材料的可行性。方法：从兔髂骨中获取骨髓基质成骨细胞，将骨髓基质成骨细胞与25g/L藻酸钠溶胶混合形成藻酸钠/骨髓基质成骨细胞复合物，取其2mL与0.17g硫酸钙粉末混合均匀，注射于新西兰兔鼻背部骨膜下，观察成骨情况。结果：藻酸钙/骨髓基质成骨细胞复合物植入兔鼻背部皮下4周后有类软骨样组织形成，8周时有骨小梁、骨髓腔等骨组织结构。结论：以藻酸钙为载体的可注射性组织工程骨可用于隆鼻术植入材料。     

基于转谷氨酰胺酶交联明胶水凝胶的脂肪干细胞培养研究

目的构建转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,mTG)交联明胶水凝胶的脂肪干细胞(adiposederived stem cells,ADSCs)三维培养体系,观察ADSCs在该水凝胶中生长情况。方法取SD大鼠腹股沟皮下脂肪组织,采用胶原酶消化及离心分离获取ADSCs,并培养传代。定量称取明胶及mTG,分别置于PBS中溶解后,按照一定比例混匀制备mTG交联明胶水凝胶。取P3~P4代ADSCs分别于水凝胶表面二维培养及包埋于水凝胶中进行三维培养。培养期间,采用倒置相差显微镜观察ADSCs的生长形态,并进行HE染色和Masson染色,观察细胞在材料中的分布形态;采用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察ADSCs在材料中存活状况;扫描电镜观察ADSCs在水凝胶表面黏附性;采用Alamar-Blue法检测ADSCs在水凝胶中增殖情况,以培养皿中常规培养细胞作为对照。结果二维培养观察示,ADSCs在水凝胶表面生长良好、细胞功能正常,贴壁良好。三维培养观察示,ADSCs在mTG交联明胶水凝胶中生长良好,呈三维立体形态,细胞向各方向伸展;细胞死活染色显示凋亡细胞非常少。各时间点三维培养的细胞数量显著低于常规培养细胞,比较差异有统计学意义(P0.05);但第8天开始,三维培养的细胞增殖明显加快,但常规培养细胞增殖开始减慢。结论基于mTG交联明胶水凝胶三维培养的ADSCs黏附性强,生长状况良好,成活率高。     

hIGF-I基因增强Mosaicplasty技术重建膝负重区大面积骨软骨复合缺损实验研究

目的研究hIGF-I基因增强组织工程提高Mosaicplasty修复大面积骨软骨缺损的修复质量，改善骨软骨的整合。 方法制造山羊膝关节股骨髁大面积骨软骨缺损模型，使用自制Mosaicplasty器械，植入2 mm直径骨软骨柱镶嵌充填缺损，以hIGF-I基因转染的骨髓基质干细胞复合可注射藻酸钙凝胶填充残余缺损。同时设立未转染hIGF-I基因的骨髓基质干细胞组、Mosaicplasty组和对照组。术后4 w、8 w、16 w处死动物，行大体观察、光镜、电镜观察，磁共振检查比较修复效果。 结果骨软骨缺损在16 w时IGF-I基因增强Mosaicplasty组移植物固定牢固，关节面平滑，移植物间界限消失，新生软骨组织类似于正常软骨，4~16 w修复效果逐渐改善，优于其他各组。光镜观察见移植的骨软骨生长良好，与新生软骨组织紧密相连，新生的软骨细胞排列规整，细胞外基质分布均一。对照组无明显修复。MRI观察类似大体观察结果。 结论使用转染hIGF-I基因的骨髓基质干细胞复合可注射藻酸钙凝胶可促进Mosaicplasty后骨软骨的整合，改善其修复效果。     

可注射型及柱型藻酸钙载体联合运用修复兔膝关节软骨缺损的效果观察

目的：使用软骨细胞、可注射藻酸钙及柱型藻酸钙载体，修复兔股骨髁间非负重区骨软骨缺损，观察同种材料不同形态联合修复的效果。方法：将24只新西兰大白兔随机分成4组，第1组给予注射藻酸钙凝胶修复，第2组放置单纯柱型藻酸钙载体修复，第3组放置柱型藻酸钙载体后于周缘注射凝胶，第4组为空白不用任何支架材料修复。每只动物修复效果以Xij表示，以定量的方法统计出所有动物修复效果，以评分的形式表示，作统计学分析。结果：实验组与对照组一共4组数据，统计每组（i）中每只兔（j）膝关节软骨缺损修复效果评分Xij，然后进行组间比较。根据单向方差分析的思想，用SPSS 12．0软件计算F=69．0，P〈0．05，联合修复组效果好于其他各组。结论：柱型藻酸钙载体具有良好的成型效果且有一定的机械强度，可注射藻酸钙凝胶具有良好的黏附性，用于人工材料与正常结构的整合具有明显优势，两者联合修复软骨缺损，优势互补，符合软骨组织工程的修复与整合的要求。     

聚丙烯酰胺水凝胶毒副作用的实验研究

目的　通过动物实验探讨聚丙烯酰胺水凝胶应用于人体的安全性。方法　应用琼脂覆盖法和MTT法评价其对细胞的毒性作用 ;将聚丙烯酰胺水凝胶注入SD鼠皮下 ,定期取材 ,行大体观察及组织学观察。结果　两种方法测得的细胞毒性均在 2级以上 ;注射局部轻度组织学反应 ,仅形成菲薄的包膜 ,其形态和位置不稳定 ,不能完全回抽 ,质地逐渐变硬 ;对肾脏有明显的毒性反应。结论　聚丙烯酰胺水凝胶对细胞及肾脏有明显的毒性作用 ,填充后形态和手感差 ,不宜于作为软组织填充剂应用于临床     

Tracking intracavernously injected adipose-derived stem cells to bone marrow

The intracavernous (i.c.) injection of stem cells (SCs) has been shown to improve erectile function in various erectile dysfunction (ED) animal models. However, the tissue distribution of the injected cells remains unknown. In this study we tracked i.c.-injected adipose-derived stem cells (ADSCs) in various tissues. Rat paratesticular fat was processed for ADSC isolation and culture. The animals were then subject to cavernous nerve (CN) crush injury or sham operation, followed by i.c. injection of 1 million autologous or allogeneic ADSCs that were labeled with 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU). Another group of rats received i.c. injection of EdU-labeled allogeneic penile smooth muscle cells (PSMCs). At 2 and 7 days post injection, penises and femoral bone marrow were processed for histological analyses. Whole femoral bone marrows were also analyzed for EdU-positive cells by flow cytometry. The results show that ADSCs exited the penis within days of i.c. injection and migrated preferentially to bone marrow. Allogenicity did not affect the bone marrow appearance of ADSCs at either 2 or 7 days, whereas CN injury reduced the number of ADSCs in bone marrow significantly at 7 but not 2 days. The significance of these results in relation to SC therapy for ED is discussed.     

人骨形态发生蛋白-2基因转染人脂肪源性基质细胞的异位成骨作用

目的探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(Adv-hBMP-2)基因转染人脂肪源性基质细胞(ADSCs)的可行性及其成骨作用。方法从人脂肪组织中提取间充质细胞，分别转染β-半乳糖苷酶(β-gal)基因和hBMP-2基因，通过X-gal染色明确转染效率．-免疫沉淀 Western blot法和ELISA法检测BMP-2表达，确定BMP-2表达量、表达时间及其相互关系，流式细胞仪观察基因转染对细胞凋亡的影响，并将转基因细胞注入裸鼠股部肌内行X线及组织学检查。结果X-gal染色显示转染效率达91％。免疫沉淀 Western blot法和ELISA法显示转染hBMP-2的ADSC具有较高且稳定的BMP-2的表达，20d内表达量无明显减退。流式细胞表明腺病毒转染后细胞凋亡率上升，但上升幅度不大。裸鼠肌内注射转基因细胞后2周即显示有异位骨形成，4周明显增多，对照组无骨组织形成。结论ADSC是较好的基因治疗载体细胞，转染hBMP-2后可以诱导裸鼠体内骨形成。．     

牙槽突裂组织工程骨修复的脂肪间充质干细胞体外三维培养促成骨的研究

目的:探讨脂肪间充质干细胞在Matrigel凝胶中三维培养条件下成骨效果,为牙槽突裂组织工程骨修复提供理论依据。方法:2019年6月于广州市妇女儿童医疗中心实验室,取第4代脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cells, ADSC),调整细胞密度为1×10 5/ml,分别用二维普通培...     

Comparison of Osteogenic Potentials of BMP4 Transduced Stem Cells from Autologous Bone Marrow and Fat Tissue in a Rabbit Model of Calvarial Defects

We compared bone marrow stem cells (BMSCs) and adipose-derived stem cells (ADSCs) of adult rabbits under identical conditions in terms of their culture characteristics, proliferation capacity, osteogenic differentiation potentials induced by adenovirus-containing bone morphogenetic protein 4 (Ad-BMP4) in vitro, and capacity to repair calvarial defects in the rabbit model by autologous transplantation ex vivo. According to the results of growth curve, cell cycle, and telomerase activity analysis, ADSCs possess a higher proliferation potential. Both of the Ad-BMP4 transduced MSCs expressed BMP4 mRNA and protein and underwent osteogenic differentiation. Up-regulated mRNA expression of all osteogenic genes was observed in differentiated BMSCs and ADSCs, but with different patterns confirmed by real-time RT-PCR. Deposition of calcified extracellular matrix was significantly greater in differentiated ADSCs compared with differentiated BMSCs. X-ray and histological examination indicated significant bone regeneration in the calvarial defects transplanted with Ad-BMP4 transduced autologous MSCs compared to the control groups. There was no significant difference in new bone formation in Ad-BMP4 transduced MSCs based on quantitative digital analysis of histological sections. The use of ADSCs often resulted in the growth of fat tissue structures in the control groups, and the fat tissue structures were not seen with BMSC cells. Our data demonstrate that BMP4 can be potently osteoinductive in vivo, resulting in bone repair. ADSCs may be an attractive alternative to BMSCs for bone tissue engineering under appropriate stimuli. But the easy adipogenic differentiation needs to be considered when choosing adipose tissue for specific clinical application.     

自体脂肪干细胞复合珊瑚修复犬颅骨标准缺损的初步研究

目的 应用自体脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)复合珊瑚构建组织工程化骨,修复犬颅骨标准缺损.方法 体外扩增培养、成骨诱导Beagle犬ADSCs,将第2代细胞接种在珊瑚支架上共同培养.制造实验犬双侧颅骨全层标准缺损(20 mm×20 mm),一侧以细胞材料复合物修复作为实验组(n=7),另一侧以单纯珊瑚材料修复作为对照组(n=7).术后24周分别通过影像学、大体形态观察、生物力学检测、组织学方法检测颅骨缺损的修复效果.结果 成骨诱导的犬ADSCs体外呈现成骨特性,在珊瑚支架上生长良好.3D-CT重建显示术后12周实验组有新生骨痂形成,对照组材料大部分降解;24周时实验组为骨性愈合,对照组为骨不连.24周时实验组缺损修复百分比为(84.19±6.45)%,显著高于对照组的(25.04 ±18.82)%(P<0.01).大体观察见实验组由新生骨痂修复缺损,对照组缺损边缘可见少量骨痂形成,主要为软组织充填;24周生物力学检测修复组织能耐受的最大压力载荷,实验组为(73.45±17.26)N,为犬顶骨最大压力负荷(104.27±22.71)N的70%,两者比较差异有统计学意义(P<0.01),对照组为软组织无法完成上述检测.HE染色见实验组有较多成熟骨呈骨性愈合,对照组为纤维性愈合.结论 自体成骨诱导的ADSCs复合珊瑚形成的组织工程化骨可修复犬颅骨标准缺损.     

Osteogenic Induction of Adipose-derived Stromal Cells: Not a Requirement for Bone Formation In Vivo

Osteogenic induction was regarded as an indispensable step for adipose-derived stromal cells (ADSCs) to have osteogenic ability. Non-induced ADSCs can also produce bone in vivo and heal skeletal defects. The present study aimed to compare the bone-forming ability of osteogenically induced ADSCs and non-induced ADSCs in vivo. Tissue-engineered constructs were prepared from osteogenically induced or non-induced ADSCs and porous hydroxyapatite/beta-tricalcium phosphate scaffolds. A scaffold without cells and an empty defect group were used as control. All were implanted in rat critical calvarial defects. After implantation for 6 and 12 weeks, bone formation was analyzed using histomorphometry and microcomputed tomography; there were no significant differences in the formation of new bone between osteogenically induced ADSCs and non-induced ADSCs ( P  > 0.05). In conclusion, osteogenic induction of ADSCs is not an indispensable step for bone formation in vivo. Non-induced ADSCs can also be used as seeding cells to construct bone tissue.     

人脂肪组织细胞外基质支架的构建

目的 探讨从人脂肪组织中提取细胞外基质并构建支架的方法,研究其结构特点,分析其作为脂肪组织工程支架的可行性.方法 收集抽脂术患者的脂肪组织,共7例,每例约310 ml,10 ml用来分离培养脂肪来源干细胞,300 ml提取细胞外基质,并制备成粉末状,扫描电镜观察其表面结构.DiI荧光标记脂肪来源干细胞,统计荧光标记后细胞存活率;将荧光标记前、后的细胞与支架粘附,检测其粘附率,所得数据用SPSS 13.0软件两样本t检验进行统计学比较,分析标记前后细胞粘附率有无差异;荧光显微镜下观察细胞在支架表面生长情况.结果 从人脂肪组织中提取得到脂肪来源干细胞和细胞外基质粉末.脂肪来源干细胞具有成脂、成软骨和成骨分化的能力;扫描电镜观察细胞外基质粉末具有多孔、粗糙表面和光滑表面的结构.脂肪来源干细胞与支架粘附较好;DiI标记前、后细胞粘附率分别为(88.81±4.81)％和(86.48±4.58)％,两样本t检验,P=0.371,差异无统计学意义(P＞0.05).荧光显微镜下脂肪来源干细胞在细胞外基质支架上生长状态良好.结论 人脂肪组织细胞外基质粉末容易获取,形状和颗粒体积具有高度的多样性,表面积较大,有利于脂肪干细胞的粘附和增殖,可作为一种较理想的脂肪组织工程支架材料.     

BMP2基因修饰犬脂肪源性基质细胞修复自体大段骨缺损

目的 评价BMP2基因修饰的犬脂肪源性基质细胞(ADSCs)与β-磷酸三钙(β-TCP)复合修复自体大段骨缺损的疗效.方法 从比格犬背部脂肪组织中提取基质细胞,转染腺病毒介导的人BMP2基因(Adv-hBMP2),通过ELISA和裸鼠体内异位成骨实验鉴定BMP2的表达及异位成骨活性;取比格犬11只,制作双侧尺骨2.5 cm骨缺损模型,缺损处旷置(4侧)或随机填充:单纯TCP(6侧),AD-SCs+TCP(6侧),Adv-hBMP2-ADSCs+TCP(6侧).所有动物16周后处死.结果 ELISA显示犬ADSCs被腺病毒转染后可高表达具有成骨活性的BMP2;裸鼠体内异位成骨实验证实所分泌的BMP2具有骨诱导活性.骨缺损修复的X线片显示,单纯TCP和ADSCs+TCP组至16周时,骨缺损均未愈合;BMP2基因修饰ADSCs+TCP组6例中2例愈合,4例部分愈合.显微摄片和组织学观察示:单纯TCP和AD-SCs+TCP组仅在骨缺损断端形成编织骨,缺损中央被纤维组织填充,而Adv-hBMP2-ADSCs+TCP组骨.缺损处皮质连续,新生骨组织主要为编织骨,部分改建形成板层骨.组织形态学分析示BMP2基因修饰ADSCs明显促进了新骨形成.结论 BMP2基因修饰ADSCs可以修复犬尺骨大段骨缺损.     

脂肪干细胞在骨组织工程中的研究进展

脂肪干细胞上一类存在于脂肪组织中,能够自我更新、具有多向分化潜能的成体干细胞,在一定的条件下可以分化成许多具有特定功能的细胞系,具有一般干细胞的特点,可作为组织工程的种子细胞。本文就脂肪干细胞的生物学特性及其在骨组织工程中的研究进展进行综述。