VEGF-C在淋巴管生成及乳腺癌淋巴道转移中的作用

目的： 探讨阻断VEGF-C/Flt-4调控系统对淋巴管生成和乳腺癌淋巴道转移的影响。方法： 体外培养胎牛胸导管内皮细胞，观察VEGF-C和抗Flt-4抗体对淋巴管内皮细胞增殖的影响；设计合成VEGF-C反义脱氧寡核苷酸（ASODN），体外实验观察其对VEGF-C基因表达的影响；建立乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型并观察ASODN对肿瘤淋巴管生成及肿瘤生长转移的影响。结果： 加入前列腺癌细胞PC3(高表达VEGF-C)上清后，淋巴管内皮细胞增殖活跃；加入抗Flt-4抗体后各时段细胞计数均明显少于其它各组。体外实验RT-PCR及 Western blotting显示ASODN作用的MCF-7细胞组VEGF-C mRNA及蛋白表达均低于对照组。体内RT-PCR检测表明ASODN组移植瘤VEGF-C mRNA表达明显受抑制；5-Nase-ALPase双重酶组织化学法结果显示ASODN组移植瘤的淋巴管生成明显减少；ASODN组肿瘤生长速度较对照组缓慢，且肿瘤体积、淋巴结转移明显低于对照组。结论： VEGF-C/Flt-4调控系统与乳腺癌组织的淋巴管生成及肿瘤的淋巴道转移密切相关。阻断淋巴管内皮细胞Flt-4表达，可在一定程度上抑制肿瘤细胞诱导的淋巴管内皮细胞增殖；ASODN通过下调乳腺癌VEGF-C的表达，减少肿瘤淋巴管的生成及淋巴结转移。     

KDR反义寡核苷酸对人血管内皮细胞的作用

VEGF及其受体KDR在肿瘤血管生成中起重要作用。我们用KDR特异性反义寡核苷酸作用于人血管内皮细胞，以阻断VEGF的自分泌作用通路，观察对细胞增殖的影响、细胞超微结构的变化及检测细胞DNA含量，测定细胞分泌VEGF的能力，并检测作用后KDR mRNA和KDR蛋白的水平。结果发现未经处理的人血管内皮细胞能分泌一定量的VEGF，KDR ASODN能抑制人血管内皮细胞内KDR基因的表达，并显著抑制细胞的增殖，在一定剂量下还可诱导凋亡。结果说明KDR ASODN能显著抑制血管内皮细胞的增殖，VEGF受体KDR在人血管内皮细胞的增殖和凋亡的凋控中起重要作用。     

脂质体介导的cripto反义寡核苷酸抑制结肠癌细胞端粒酶活性

目的：探讨cripto反义寡核苷酸（ASODN）对结肠癌细胞端粒酶活性的影响。 方法: 应用脂质体瞬时转染法介导cripto 反义寡核苷酸，处理人结肠癌细胞系后，分别采用实时定量PCR检测cripto mRNA表达，用TRAP检测端粒酶活性，采用软琼脂集落培养试验检测结肠癌细胞的生长。 结果: Cripto ASODN可有效抑制结肠癌细胞集落生长，且与浓度相关。结肠癌细胞经Cripto ASODN转染后，端粒酶活性明显受到抑制，呈作用浓度和时间依赖性。并与ASODN的浓度和处理时间有关。 结论: cripto基因可能参与对结肠癌细胞端粒酶活性的调控。     

硫代bFGF寡核苷酸抑制HepG2和Hep2细胞的增殖

目的探讨硫代修饰对bFGF寡核苷酸抑制HepG2和Hep2细胞增殖的影响。方法设计、合成bFGF寡核苷酸,聚乙烯亚胺(jetPEI)介导其转染入HepG2和Hep2细胞,荧光显微镜观察其在细胞中的定位,流式细胞仪分析转染效率,MTT法检测细胞增殖。结果bFGF反/正义硫代寡核苷酸被jetPEI介导高效转染入细胞内,主要位于细胞核。反/正义硫代寡核苷酸均呈剂量时间依赖地抑制细胞增殖,相同剂量时正硫代寡核苷酸的抑制效率高于反义硫代寡核苷酸。相应非修饰反义寡核苷酸较其互补正义链能更有效抑制两种细胞增殖。核苷酸突变明显降低反义硫代寡核苷酸对细胞抑制,并不影响正义硫代寡核苷酸的细胞抑制率。反义硫代寡核苷酸明显降低细胞中bFGF表达。结论硫代修饰bFGF反义寡核苷酸在细胞内特异性结合核酸以反义机制抑制肿瘤细胞增殖,正义寡核苷酸则因硫代修饰于细胞内以非核酸特异性机制抑制肿瘤细胞增殖。     

Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡及对化疗药物的增敏作用

目的观察survivin反义寡核苷酸（ASODN）对胃癌细胞的增殖、凋亡及对化疗药物敏感性影响。方法人工合成survivin硫代ASODN,通过脂质体转染胃癌细胞株MGC803后,用MTT法检测细胞毒作用,流式细胞术检测细胞的凋亡;RT-PCR、Western blot检测survivin mRNA及蛋白的表达。结果survivin ASODN抑制MGC803增殖,呈剂量依赖性;各survivin ASODN处理组MGC803细胞凋亡率显著高于对照组（P〈0.01）;survivin ASODN处理组MGC803细胞survivin蛋白及mRNA的表达水平显著下降（P〈0.01）;200nmol/Lsur-vivin ASODN和顺铂联合处理MGC803细胞株,其细胞抑制率为74.7%,显著高于单用survivin ASODN组的38.4%和单用顺铂组的33.6%（P〈0.01）。结论survivin ASODN能够抑制MGC803细胞增殖、诱导凋亡,并能增加MGC803细胞对化疗药物的敏感性。     

Livin反义寡核苷酸对人HL60细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨Livin mRNA反义寡核苷酸（ASODN）对人白血病细胞（HL60）增殖及凋亡的影响。方法 用免疫组织化学检测Livin蛋白表达,设计合成特异性的Livin硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸（MSODN）,脂质体转染HL60细胞。用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT)检测细胞增殖,反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Livin mRNA的表达,原位末端标记技术（TUNEL）、电镜检测细胞凋亡率和形态学改变。结果Livin ASODN在终浓度为600nmol／L作用HL60细胞48h时,能明显地抑制其增殖,降低Livin mRNA的表达,HL60细胞在形态学上出现明显的凋亡改变,细胞凋亡率显著增加 (P<0.01)。结论Livin ASODN可有效抑制HL60细胞的增殖,下调Livin基因表达,并促进HL60细胞凋亡,在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制增殖中发挥重要作用。     

HLA-G反义寡核苷酸对绒癌细胞免疫逃逸的影响

采用非经典MHCI类免疫耐受分子HLA G反义基因 ,封闭和阻断肿瘤细胞上HLA G分子的释放 ,逆转肿瘤细胞的免疫抑制作用 ,为肿瘤生物治疗提供新的理论和实验依据。利用反义核酸技术 ,合成HLA G反义寡核苷酸 (ASODN ) ,硫代化修饰与脂质体形成复合物 ,转导入表达HLA G的绒毛膜癌细胞系JEG 3。采用RT PCR方法检测HLA GmRNA表达水平的变化。流式细胞术检测细胞表面HLA G蛋白表达水平的变化 ;ASODN处理后 ,对JEG 3诱导外周血单个核细胞凋亡的影响 ;MTT法检测ASODN作用后 ,JEG 3作为第 3种抑制细胞对同种异体混合淋巴细胞反应的影响。结果表明 ,HLA GASODN可显著抑制JEG 3细胞HLA GmRNA和蛋白水平的表达 ,逆转HLA G分子诱导的免疫效应细胞的凋亡作用 ,逆转HLA G分子对同种异体混合淋巴细胞反应的抑制作用     

反义寡核苷酸抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞血管内皮生长因子mRNA表达及其生物效应的研究

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASODN)转染对神经母细胞瘤LA-N-5细胞VEGF mRNA表达的影响以及对肿瘤细胞增殖、分化的影响。方法用LipofectamineTM2000介导的VEGF ASODN和错义寡核苷酸(MSODN)转染LA-N-5细胞,半定量RT-PCR检测各组细胞VEGF165和VEGF121 mRNA转染前后不同时间表达的变化;MTT法测定转染后各组细胞的生长曲线及抑制率。结果半定量RT-PCR检测结果显示,在转染后72 h VEGF165和VEGF121 mRNA的表达:ASODN组为0.346±0.029和0.227±0.036,ASODN+LipofectamineTM2000组为0.275±0.035和0.165±0.017。ASODN组和ASODN+LipofectamineTM2000组均显著抑制VEGF mRNA的表达,ASODN+LipofectamineTM2000组抑制作用较ASODN组更强(P<0.05);转染后ASODN组和ASODN+LipofectamineTM2000组细胞增殖显著受抑,在48 h时抑制率最高,分别为(39.92±2.7...     

VEGF-ASODN抑制裸鼠胃癌移植瘤微血管生长

目的 研究血管内皮细胞生长因子反义寡核苷酸（VEGF-ASODN）对裸鼠荷人胃癌移植瘤微血管的生长抑制作用。方法 人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN,转染胃癌细胞SGC-7901, 实时荧光定量RT-PCR检测细胞RNA起始拷贝数, ELESA法检测VEGF 蛋白含量,MTT检测细胞生存力,细胞生长曲线检测细胞生长。建立裸鼠荷胃癌移植瘤模型。实验分为4组：（1）VEGF-ASODN组,（2）错义寡核苷酸组,（3）生理盐水组,（4）无荷瘤对照组。结果 VEGF-ASODN能降低胃癌细胞VEGFmRNA的水平,显著降低胃癌细胞及培养液VEGF 蛋白含量,降低细胞生存力、抑制细胞生长。VEGF-ASODN还能显著降低荷瘤裸鼠血清VEGF蛋白水平、减小移植瘤的体积和重量、降低移植瘤微血管密度。结论 VEGF-ASODN抑制移植瘤微血管的生长。     

Caveolin-1反义寡核苷酸对SMMC7721细胞增殖和VEGF表达的影响

目的:研究caveolin-1反义寡核苷酸对肝癌细胞增殖和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:脂质体介导caveolin-1反义寡核苷酸瞬时转染SMMC7721细胞,Western blotting检测转染效果;MTT法和ELISA法分别检测转染前后SMMC7721细胞增殖和分泌VEGF的变化。结果:转染48 h后,反义寡核苷酸组caveo-lin-1蛋白表达水平明显低于对照组;MTT检测结果显示,转染后的SMMC7721细胞显著增殖,增殖率为90.9%;ELISA检测结果显示,转染后的SMMC7721细胞分泌的VEGF显著升高(P0.01)。结论:Caveolin-1反义寡核苷酸抑制caveolin-1的表达,而caveolin-1具有抑制SMMC7721细胞的增殖和其分泌VEGF的作用,有望成为肿瘤治疗的新靶点。     

Survivin反义寡核苷酸抑制肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用

目的：研究survivin反义寡核苷酸（ASODN）对人肝癌耐药细胞株移植裸鼠皮下后，移植瘤生长的抑制作用。方法:将人肝癌耐药细胞系SMMC-7721/ADM裸鼠移植瘤模型，随机分为：空白对照组、单纯脂质体转染组、正义链转染组、200 μg/L ASODN组、400 μg/L ASODN组和600 μg/L ASODN组，观察裸鼠移植瘤体积，计算抑瘤率。免疫组化检测Survivin蛋白的表达。结果:A组、B组和C组移植瘤随时间增长而增大，但3组间无显著差异（P>0.05）。D组、E组和F组注射ASODN后，裸小鼠移植瘤的体积随着注射ASODN时间的延长和ASODN浓度的增加，移植瘤生长越来越小，并呈时间-剂量-效应依赖性。实险第20 d D组、E组和F组的肿瘤抑制明显大于A组、B组和C组（P<0.05）。HE染色见对照组移植瘤细胞密集成群，核大深染，而ASODN组见肿瘤细胞少，癌细胞皱缩变圆，胞核固缩深染。免疫组化见对照组肝癌细胞浆Survivin蛋白表达较强，而ASODN组Survivin蛋白表达较弱。结论:Survivin反义寡核苷酸能够抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。     

黄芪、党参提取物增强紫杉醇抑制肿瘤血管生成和转移的实验研究

目的:观察黄芪、党参提取物对紫杉醇抑制Lewis肺癌血管生成和肿瘤转移的增强作用,为中医药抗肿瘤应用提供实验依据.方法:C57BL/6小鼠右肋处皮下接种Lewis肺癌,6 h后随机分为实验组、紫杉醇组和对照组.实验组接受紫杉醇联合参芪注射液治疗,紫杉醇组接受同等剂量的紫杉醇治疗,对照组用等体积的生理盐水代替.观察指标:移植瘤体积,肿瘤组织内微血管度和肺脏转移瘤数量,小鼠存活时间.结果:与紫杉醇治疗相比,紫杉醇联合参芪可以明显减少移植瘤内的微血管密度(10.1±4.4 vs 16.8±7.3,P＜0.05)和肺脏转移瘤个数(13.4±4.3 vs 18.4±3.9,P＜0.05),明显延长小鼠的存活时间(43.3±8.4 d vs 36.3±6.6 d,P＜0.05). 结论:黄芪、党参提取物对紫杉醇抑制肿瘤血管生成和移植肿瘤转移有一定的增强作用.     

参慈胶囊联合顺铂抑制小鼠Lewis肺癌组织血管生成的机制研究

目的:探讨参慈胶囊及顺铂对Lewis肺癌组织生长及血管生成的抑制作用。方法:将40只C57BL/6小鼠自接种Lewis肺癌瘤株细胞建立实体瘤模型,随机分为参慈胶囊组、参慈胶囊+顺铂组、顺铂组、模型组。模型组予等量生理盐水,其余各组荷瘤小鼠均用药21 d,测量肿瘤重量并计算抑瘤率,采用免疫组化技术检测血管内皮生长因子(VEGF)、微血管密度(MVD)表达情况;采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测Lewis肺癌荷瘤小鼠癌细胞表达血管内皮生长因子受体-2(KDR)mRNA的情况。结果:(1)在抑瘤率方面,参慈胶囊+顺铂组抑瘤率明显高于其它3组,差异显著(P0.01)。(2)参慈胶囊+顺铂组能降低Lewis肺癌组织VEGF、KDR的表达及MVD的形成,差异显著(P0.01)。结论:(1)参慈胶囊联合顺铂能抑制Lewis肺癌组织生长及血管生成,二者联用具有相加或者协同效应;(2)下调VEGF及其受体KDR的表达,可能是二者联合抗肿瘤血管生成的机制之一。     

Bcl-2硫代反义寡核苷酸对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究bcl-2硫代反义寡核苷酸(bcl-2ASODN)对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法:采用MTT法、激光共聚焦显微镜、TUNEL法和AnnevinV/PI双染法检测bcl-2ASODN对A375细胞增殖和凋亡的影响。应用RT-PCR方法,观察bcl-2ASODN处理前后bcl-2mRNA在A375细胞表达水平的变化。结果:MTT法检测显示bcl-2ASODN抑制A375细胞增殖,并呈时间和剂量依赖性;经30μmol/LASODN作用48h,激光共聚焦显微镜观察细胞呈现典型凋亡特征;TUNEL染色可见ASODN组多数A375细胞核被标记呈棕褐色,而SODN组和对照组细胞核未被明显标记;AnnexinV/PI检测ASODN组凋亡细胞比例升高,与SODN组和对照组均有显著性差异(P<0.001);RT-PCR结果显示bcl-2mRNA表达水平下降。结论:bcl-2ASODN可抑制A375细胞增殖和诱导A375细胞凋亡,其诱导凋亡的机制是下调bcl-2mRNA的表达。     

血管内皮生长因子,微血管密度与乳腺癌淋巴结转移及预后？…

目的　探讨血管内皮生长因子 (VEGF)、微血管密度 (MVD)与乳腺癌淋巴结转移和预后的关系。方法　应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)与免疫组织化学SP法 ,检测 92例乳腺癌、12例癌旁组织V组织VEGF表达、MVD以及 2 1例乳腺癌、12例癌旁组织VEGFmRNA的表达。结果　乳腺癌组织 ,VEGF12 1(1.16 %± 0 1% )和VEGF165(1.0 1%± 0 .1% )表达高于癌旁组织 (0 .96 %± 0 .14% )、(0 .88%± 0 .1% ) ,P <0 .0 5～ 0 .0 1。此外 ,MVD与VEGF表达具有显著的正相关关系 (r =0 .70 2 ,P <0 .0 1)。VEGF表达和MVD与乳腺癌淋巴结转移、肿瘤复发关系密切 (P <0 .0 5～ 0 .0 1)。VEGF高表达组和高MVD组的无复发存活时间低于VEGF低表达组和低MVD组 ,差异具有非常显著性 (P <0 0 1)。结论　VEGF与乳腺癌血管生成密切相关 ;VEGF和MVD表达的增高对乳腺癌淋巴结转移、肿瘤复发有促进作用 ;VEGF和MVD对乳腺癌患者的无复发存活时间能起到预测作用     

直肠癌的血管生成和血管内皮生长因子表达的实验研究

目的　探讨直肠癌组织微血管密度 (MVD)和血管内皮生成因子 (VEGF)表达与肿瘤浸润和转移的关系 .方法　应用CD31抗体和VEGF抗体 ,采用免疫组化S -P法对 14 1例手术切除的直肠癌患者进行血管标记和染色 ,并取 10例直肠正常组织对照 .结果　有淋巴转移组直肠癌MVD、VEGF表达强度与无淋巴结转移组、正常对照组间比较 ,均有显著性差异 (p<0 .0 1) ,且MVD与VEGF表达两者呈正相关 (r=0 .93) .结论　直肠癌组织内微血管密度和VEGF表达强度与直肠癌的浸润深度及淋巴结转移密切相关 ,两者均可考虑作为预测直肠癌发生转移的指标 .     

hTERT基因反义核酸对顺铂诱导Jurkat细胞凋亡的影响

目的:用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制Jurkat细胞端粒酶活性后, 观察化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)对Jurkat细胞凋亡的影响。方法:采用台盼蓝拒染法观察hTERT ASODN与化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)联合作用对Jurkat细胞系生长的影响;姬姆萨染色法观察凋亡细胞的形态变化;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂情况;通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果: hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙, 对细胞生长的抑制分别与单用柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙及hTERT正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotide, SODN)联合柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙组相比, 无显著差异(P>0.05) 。hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入顺铂, 分别与SODN联合顺铂作用组、单用顺铂作用组相比, 对细胞抑制明显增强(P<0.05)。hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入顺铂作用48 h, 细胞出现典型的凋亡形态学改变, 经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带, 而SODN与顺铂联合作用组及单独应用顺铂均未见到DNA梯形条带。hTERT ASODN与2.5 μmol/L顺铂联合作用于Jurkat细胞48h的凋亡细胞百分率(25.18±3.63)%分别同SODN与顺铂联合作用组(10.07±2.12)%、单用顺铂作用组(9.73±2.43)%进行比较有显著差异(P<0.01)。 结论:hTERT基因反义寡核苷酸能促进顺铂诱导Jurkat细胞凋亡。     

血管内皮生长因子C及其受体3在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

目的　探讨血管内皮生长因子C(VEGF C)和受体 (VEGFR) 3在人非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与微血管、微淋巴管形成、淋巴转移、预后之间的关系。方法　对 76例人NSCLC及相应癌旁组织行VEGF C、VEGFR 3及CD34免疫组织化学染色链霉素抗生物素蛋白 过氧化物酶 (SP)法检测 ,进行淋巴管密度计数、微血管密度 (MVD)计数 ,并结合临床和病理资料进行分析。结果　NSCLC中 ,VEGF C的表达与肺癌分化程度负相关 (P =0 0 0 9)。VEGF C和VEGFR 3的表达水平与淋巴结转移呈正相关 (分别P =0 0 0 8,P =0 0 13) ,与淋巴浸润呈正相关 (分别P =0 0 2 7,P =0 0 2 0 )。VEGF C的表达与VEGFR 3在肺癌细胞中的表达呈正相关 (P =0 0 0 9)。VEGF C与淋巴管密度 (P =0 0 0 6 )、MVD(P =0 0 4 6 )呈正相关。淋巴管密度与淋巴结转移 (P =0 0 10 )、淋巴浸润 (P =0 0 19)、TNM分期 (P =0 0 15 )呈正相关 ,MVD与血行转移 (P <0 0 0 1)、TNM分期 (P <0 0 0 1)呈正相关。VEGF C阳性表达与生存时间、5年生存率呈负相关 (P <0 0 0 1)。结论　NSCLC中 ,VEGF C通过自分泌方式作用于受体VEGFR 3,促进肺癌组织生长 ,抑制分化。VEGF C促使肺癌内淋巴管形成 ,促进肺癌淋巴结转移。VEGF C和VEGFR 3表达增高、淋巴管密度增加     

血管内皮细胞生长因子和血管生成与胃癌发展的关系

目的探讨血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）和血管生成与胃癌发展的关系。方法应用免疫组织化学和原位分子杂交技术,检测５６例人胃癌组织ＶＥＧＦ蛋白表达和微血管密度（ＭＶＤ）及部分胃癌ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达,分析ＶＥＧＦ和ＭＶＤ、及其与胃癌组织学分型、浸润深度、生长方式、淋巴结转移、远处转移和预后的关系。结果ＶＥＧＦ阳性者ＭＶＤ值显著高于阴性者（Ｐ＜００１）,ＶＥＧＦ表达和ＭＶＤ与胃癌浸润深度（Ｐ＜００１）、淋巴结转移（Ｐ＜００５）和远处转移（Ｐ＜０．０５）密切相关,而与组织学分型和生长方式无关（Ｐ＞００５）;ＶＥＧＦ表达阳性或ＭＶＤ≥４３的胃癌患者５年生存率较低;ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达与ＶＥＧＦ蛋白表达具有一致性,但其分布不同。结论ＶＥＧＦ与胃癌的血管生成密切相关,对胃癌的生长和浸润转移有促进作用,ＶＥＧＦ和ＭＶＤ可作为反映胃癌生物学行为的指标之一