小骨髓间充质干细胞的培养及多向分化潜能的研究

目的研究小儿骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特性及多向分化能力,为小儿MSCs的临床应用提供实验依据。方法经Percoll梯度分离接种获得小儿MSCs,观察其形态、排列分布情况,用MTT法检测细胞增殖情况,并绘制生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期,诱导剂干预细胞,观察细胞的成骨、成脂肪、成神经等多向分化能力。结果小儿MSCs贴壁容易,呈细长梭形,增殖能力强,融合后旋涡状分布。MSCs分别经各诱导剂诱导后,细胞形态均发生相应的变化,用化学染色、PCR、免疫细胞染色等方法检测成骨标志物（碱性磷酸酶、骨钙素mRNA、钙结节）、脂肪标志物（脂滴、PPARγ-2mRNA）、以及类神经标志物（尼克氏体、NSE、NF-200）有明显的阳性。结论小儿MSCs能稳定增殖、传代,具有成骨、成脂肪、成神经等多方向的定向分化潜能,可以作为多方面组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞具有自我更新，分化增殖和多向分化潜能的特点，在体外通过化学物质5－氮胞苷的诱导作用，可分化为心肌样细胞；在体内通过干细胞因子和粒细胞集落刺激因子等作用，也可动员骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞，能有效改善心功能，具有广阔的临床应用前景。     

MiR-124-1促进大鼠骨髓间充质干细胞神经分化的实验研究

目的：探讨miR-124-1在大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）神经分化中的作用。方法：构建大鼠miR-124-1慢病毒载体及Anti-rno-miR-124* Inhibitor载体,体外感染大鼠MSCs,筛选最适感染复数（MOI）。实验分为对照组（未行感/转染组）、miR-124-1+组（感染miR-124-1慢病毒）及miR-124-1-组（转染Anti-rno-miR-124* Inhibitor）。采用β-巯基乙醇诱导MSCs分化为神经细胞。倒置荧光显微镜下观察感染后荧光表达情况,MTT法检测感/转染后各组细胞存活率;免疫细胞化学法、RT-PCR法、Western blot法检测各组诱导6 d后神经细胞标记物β3微管蛋白（β3 tubulin）、神经微管结合蛋白（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达变化。结果：倒置荧光显微镜下观察大鼠miR-124-1慢病毒感染成功,MOI值为30。miR-124-1+组慢病毒载体感染MSCs 2 d后,实时定量PCR显示miR-124-1的表达显著上调（P<0.01）;Anti-rno-miR-124* Inhibitor载体转染24 h后,细胞存活率下降,实时荧光定量PCR显示转染后miR-124-1的表达显著下降（P<0.01）。β-巯基乙醇可诱导MSCs分化为神经细胞,miR-124-1+组诱导6 d后细胞的β3 tubulin、MAP-2表达率显著高于其他两组（P<0.01）,miR-124-1-组β3 tubulin、MAP-2的表达率显著低于对照组（P<0.01）;各组GFAP表达率均较低（<1%）。结论：miR-124可能促进大鼠MSCs的神经分化。     

骨髓间充质干细胞与肿瘤耐药

在儿童血液系统恶性疾病及实体瘤中,肿瘤细胞和骨髓微环境之间存在动态作用。在骨髓微环境中特殊的龛为肿瘤细胞提供一个逃避化疗诱导细胞凋亡的居所并获得耐药表型。骨髓龛中的间充质干细胞(mesenchy-mal stem cells,MSCs)诱导肿瘤细胞生长和存活,并促成一个促进溶骨、肿瘤生长、存活和耐药的微环境。本文重点对骨髓MSCs的生物学特性及其与肿瘤相互作用的研究进展进行综述。     

人脐带血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性

目的探讨人脐带血来源间充质干细胞(MSCs)在体外诱导分化为神经元样细胞的可行性及条件。方法采用Fi- coll-Paque(1.077 g/mL)分离液密度梯度分离人脐带血中MSCs,体外扩增纯化后,二甲基亚砜、巯基乙醇及丁羟茴醚等试剂诱导其向神经细胞分化,显微镜下观察,细胞免疫化学法鉴定。结果诱导后脐血MSCs具有典型神经元形态细胞,免疫细胞化学显示神经丝蛋白(NF-M)染色呈强阳性,占(81．86±4．06)％;Nestin染色呈阳性细胞占(39．99±4．60)％;GFAP染色阴性。结论人脐带血MSCs在体外培养及诱导条件下可定向分化为神经元样细胞。     

儿童骨髓间充质干细胞体外培养与富集效率的研究

目的比较密度梯度离心法和全骨髓培养法分离培养儿童骨髓间充质干细胞(BMSCs)获得的细胞纯度与克隆形成效率。方法取等量抗凝的儿童骨髓分别以密度梯度离心法和全骨髓培养法分离培养BMSCs,传代至第3代分别计数2种方法所得BMSCs的细胞总数,流式细胞仪检测表面标记物及其纯度,对第5代BMSCs分别绘制生长曲线,全骨髓培养法培养至第6代流式细胞仪再检测表面标记物及其纯度。结果2种方法均能有效培养出BMSCs,BMSCs强表达CD105及CD13,低表达CD34;3mL骨髓样本用全骨髓培养法扩增至第3代平均可获得3.15×107个细胞,而密度梯度离心法3mL骨髓只获得1.08×107个细胞,二者有显著性差异(P<0.05);密度梯度离心法第3代BMSCs纯度达95%以上,全骨髓培养法第3代BMSCs纯度约85%,多次换液传至第6代纯度可达到95%以上;2种方法第5代BMSCs生长曲线近似,接种后0～3d为生长潜伏期,3～6d为对数生长期,之后进入平台期,无显著性差异(P>0.05)。结论密度梯度离心法分离培养BMSCs,可在短时间内获取纯度较高的BMSCs;全骨髓培养法分离培养BMSCs,可从少量标本获得最大数量的BMSCs,多次换液传代也可获得纯度较高的BMSCs。     

骨髓间充质干细胞的旁分泌作用研究进展

随着近些年来对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)研究的不断深入,其在多种组织损伤中的修复作用也逐步被揭示。而近几年来发现,BMSCs 除了能通过直接分化为靶细胞而发挥修复作用,其旁分泌作用也在对组织的修复过程中发挥重要作用,BMSCs 分泌的多种细胞因子对损伤组织的修复有重要意义。     

再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞分离及培养

目的 分离再生障碍性贫血(再障)患儿骨髓间充质干细胞,进行体外培养,为进一步研究打下实验基础.方法 从再障患儿及正常志愿者骨髓中分离骨髓间充质干细胞,进行体外培养,诱导向成骨细胞、成脂细胞分化和流式细胞仪检测表面标志CD34、CD45、CD73和CD90.绘制生长曲线描述原代和传代细胞生长情况.结果 分离的贴壁细胞经向成骨细胞和脂肪细胞分化诱导培养,分别显示茜素红染色和油红染色阳性;CD73和CD90阳性.生长曲线显示,与正常志愿者相比再障患儿体外培养的骨髓间充质干细胞传代培养中生长能力减低.结论 再障患儿骨髓间充质干细胞存在异常,可能在再障发病机制中起着重要作用.     

骨髓间充质干细胞移植治疗巨结肠的实验研究

目的在体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）的神经细胞分化基础上，探讨移植治疗实验性巨结肠的可能性。方法8～9周龄SD大鼠用1％苯扎氯铵（BAC）制作巨结肠模型。贴壁筛选法进行MSCs原代培养、扩增后用碱性全反式视黄酸（ATRA）和碱性成纤维生长因子（FGF2）诱导法收获Nestin、NF表达阳性的MSCs细胞，显微注射法将来源于雄性大鼠，Nestin、NF阳性表达的MSCs植入雌性实验性巨结肠模型鼠病变肠段。实验分对照组（PBS组）及实验组（MSCs组），分别于术后1、2、4周进行大体观察，钡灌肠X线检查，病理学检查、平滑肌收缩功能以及采用短路电流技术检测上皮离子转运的变化。结果BAC处理后1周，实验组大鼠出现腹胀，BAC处理段出现狭窄。MSCs被纯化并被诱导为神经细胞。MSCs组免疫组化结果显示移植后1、2、4周Nestin及NF呈阳性表达，但在PBS组未观察到阳性表达。MSCs组腹胀较轻，梗阻近端少量大便，MSCs移植组大鼠结肠上皮第一周跨膜电压升高，但第四周其基础电流下降，钠离子吸收减少；MSCs移植后第一、四周Forskolin所引起的氯离子分泌电流均较PBS组高。结论MSCs可在实验性巨结肠模型鼠结肠壁内分化为神经细胞，部分恢复结肠神经调节作用。     

骨髓间充质干细胞与支气管肺发育不良的研究进展

支气管肺发育不良是一种发生于新生儿的慢性肺疾病,近年来发病率不断上升.骨髓间充质干细胞具有多向分化功能,可分离、纯化、扩增和运用于临床实验.该文对支气管肺发育不良的病理、发病机制、骨髓间充质干细胞的生物学特性等进行阐述,提出循环中的骨髓间充质干细胞可在肺组织定植,并对肺损伤有修复功能.     

牵张应力对儿童骨髓间充质干细胞体外增殖与向成骨分化的影响

目的观察周期性牵张应力对儿童骨髓间充质干细胞（MSCs）体外增殖活性与向成骨分化的影响。方法分离并培养儿童骨髓间充质干细胞，利用体外装置对3～6代细胞加载不同大小的牵张应力，相差显微镜观察细胞形态分布的变化，分别用细胞计数法、四甲基偶氮唑（MTT）和流式细胞仪检测细胞增殖、细胞周期及凋亡情况，同时检测碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）的活性。结果牵张应力干预MSCs后，细胞形态变长，沿受力环切线方向规则排列，细胞增殖能力增强，细胞周期比例改变，增殖指数增大，细胞凋亡则没有明显差别，ALP、OC的活性显著增强。结论适当的周期性牵张应力可以提高MSCs的增殖能力并促使细胞向成骨分化。     

牵张应力对小儿体外骨髓间充质干细胞向成骨、成脂肪分化的相关性研究

目的 探讨周期性机械应力对小儿骨髓问充质干细胞(MSCs)分化方向的影响.方法 利用自行建立的机械牵张应力装置,对体外MSCs加载力学信号,并复合成脂肪诱导剂,选用化学染色、RT-PRC、免疫组化、Western Blot的方法检测MSCs干预后成骨指标(OC、BMP-2、I型胶原)和成脂肪分化的指标(PPART-2、脂滴).结果 MSCS受力后,细胞OC mRNA表达较对照组明显增高,而且与干预时间相关;干预7 d后,细胞内BMP-2、I型胶原蛋白表达较对照组明显增强;MSCs在成脂肪诱导过程中,接受应力后细胞脂滴的出现和PPARy-2 mRNA的表达均明显下降.结论 适当的应力促进MSCs向成骨方向分化,抑制其向脂肪方向分化.     

人间充质干细胞体外扩增及生物学特性的研究

目的探讨成人骨髓、胎儿骨髓和人脐血3种不同来源的人类间充质干细胞(MSC)体外扩增及其生物学特性.方法观察3种来源的MSC的生长、增殖和表面标志的表达,从而评价MSC的纯化、增殖能力及其免疫学特性.结果 (1)3种不同来源的人MSC的细胞形态、集落数、集落大小均无差异;但成人骨髓MSC在集落形成及集落交错融合时间上均早于胎儿骨髓和脐血MSC; (2) 3种来源的人MSC传代培养增殖速度无差异,但脐血和胎儿MSC融合后无接触抑制,而成人骨髓MSC存在接触抑制; (3) 来源于骨髓单个核细胞(MNC)8×106或脐血MSC 25×106的MSC,经体外扩增3代、5代和10代后,细胞数分别为107、108和1010个; (4)MSC易纯化,P2代细胞均一性为90%,P3代细胞均一性为95%,P5代细胞均一性达到99%;(5) 不同来源的MSC表面重要标志CD29、CD44、CD59、CD90、CD105、CD166表达均为阳性,其造血细胞表面标志CD11a、CD14、CD33、CD34、CD28、CD45、CD117表达均为阴性,与移植免疫排斥发生密切相关的表面标志HLA-DR、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40和CD40L均为阴性.3种不同来源的人MSC表面标志,差异无显著性.(6) 两种不同培养体系对人MSC的纯化扩增及生物学特性无影响.结论 (1)不同来源的人MSC生物学特性无明显差异;(2) 人MSC在体外易扩增纯化,增殖能力强,符合临床组织工程的需要;(3) 人MSC不表达造血细胞及与移植免疫排斥发生密切相关的表面标志,有可能突破HLA屏障,广泛应用于临床.     

体外扩增脐血间充质干细胞的生物学特性和

目的从脐血中分离单个核细胞(MNCs),体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和诱导分化潜能.方法取35份足月顺产新生儿脐血,密度梯度离心法分离出其中的MNCs,采用含胎牛血清的DMEM培养基体外培养扩增MSCs.显微镜下观察MSCs的形态、细胞化学染色,流式细胞仪测定MSCs的细胞免疫表型,体外诱导分化实验检测MSCs分化成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞的能力.结果从12份脐血中可培养出MSCs,形态上与从其他来源的MSCs类似,可传至20代而无形态上的变化.细胞化学染色示碱性磷酸酶(ALP)阴性,非特异性酯酶--α-丁酸萘酚酯酶(alpha-naphthol butyric acid esterase,NBE)阳性.其表达CD29、CD44和CD105,特别是人类MSCs标记SH-2 和 SH-3 阳性,而CD3、CD14、CD19、CD34和CD45阴性,说明它们并非来自造血细胞.这些MSCs在适当诱导分化剂的作用下,2周左右可以诱导分化形成骨细胞, 20天左右可以诱导分化形成脂肪细胞.脐血MSCs预诱导12 h后,胞体发生收缩,细胞边缘有细的突起.正式诱导5 h后大多数细胞呈现典型的神经元样.结论胎儿脐血MNCs可分离培养出MSCs.这些MSCs具有与其他来源MSCs类似的表型及分化潜能.     

体外诱导儿童骨髓间质干细胞分化为神经细胞

目的探讨儿童骨髓间质干细胞诱导分化为神经干细胞及神经细胞的方法及生物学特征，为将来进一步研究及利用其实验治疗小儿脊髓栓系综合征及其他神经系统疾病动物模型奠定基础。方法取健康儿童骨髓离心初步分离骨髓间质干细胞，在α-MEM培养基中进行无分化培养12代进一步纯化扩增，加入预诱导液、诱导液进行定向诱导分化，逐日观察细胞形态变化，采用免疫组织化学技术对诱导后的细胞进行神经干细胞特异性抗原nestin、神经丝蛋白β-tublinⅢ和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的定性检测，观察其表达情况；并采用RT-PCR技术对不同时段神经干细胞特异性抗原nestin和神经生长因子受体Trk B（neurotrophic receptor tyrosine kinase B，Trk B）mRNA的表达进行检测，用上述两种技术手段，从不同角度和层面验证和初步探索BSMCs定向诱导分化为神经组织样细胞的细胞生物学和分子生物学特征。结果骨髓间质干细胞经过7d体外诱导，大约有35％的细胞发生形态学变化。免疫组化结果显示，细胞形态逐步发生变化并最终形成神经样的细胞，在诱导后30min表达神经干细胞特异性标志nestin抗原、7d时分别表达神经元特异性标志β-tublinⅢ抗原和星形胶质细胞特异性标志GFAP抗原。RT-PCR检测结果也表明，被诱导后5．5h在mRNA水平表达nestin，在6d时消失；而神经生长因子受体TrkB mRNA在诱导5．5h、6d时均表达。结论经离心及12代传代初步分离纯化的儿童骨髓间质干细胞在合适的诱导剂作用下体外可定向分化成神经元和神经胶质细胞。为进一步研究其生物学特性或探索治疗小儿脊髓栓系综合征及其他神经系统疾病动物模型提供基础和种子细胞。     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及向神经样细胞分化的研究

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞（MSCs）的特性及向神经细胞分化的可能性,为神经移植寻找新的细胞来源。方法 检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记;丹参和B巯基乙醇诱导人脐带来源的MSCs向神经细胞分化,用免疫细胞化学方法对分化和未分化的细胞进行鉴定;半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞的神经相关基因表达。结果 从人脐带分离、培养的贴壁细胞,体外生长形态类似于成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,体外增殖超过10代。这类细胞MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59、CD105仿呈现高表达,造血细胞表面标记CD14、CD33、CD34、CD27、CD45、CD117和与移植免疫排斥相关的表面标记CD80（137—1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L不表达或低表达。丹参和β巯基乙醇均可诱导人脐带MSCs向神经样细胞分化,分化的细胞表达神经干细胞的标记巢蛋白（Nestin）,神经元的标记类神经微管（β-TubulinⅢ）和神经微丝（NF）,以及神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。RT-PCR检测证实,经丹参诱导后的MSCs表达神经干细胞相关基因Nestin,诱导前和诱导后的MSCs均表达神经细胞基因Pleiotrophin,诱导后的表达明显增强。结论 人脐带华尔通胶含有丰富的MSCs,易于培养扩增,其表达MSCs的表面标记。不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞标记。人脐带来源的MSCs能分化为神经细胞,表达神经细胞的相关标记和基因,这种细胞可能成为中枢神经系统细胞移植的一个干细胞来源。     

In vitro models of pancreatic differentiation using embryonic stem or induced pluripotent stem cells

Embryonic stem (ES) cells or induced pluripotent stem (iPS) cells are expected as a surrogate cell source for regenerative medicine. Many researchers have reported the differentiation method of insulin-expressing pancreatic β cells from ES or iPS cells. However, the detailed molecular mechanisms underlying the differentiation of ES or iPS cells into pancreatic lineages are still unclear. We have established a feeder cell-based differentiation system into pancreatic progenitor cells, and revealed the signaling pathways that are involved in the differentiation of ES cells into mesendoderm, endoderm and pancreatic progenitor cells. Recently, we demonstrated that the extracellular environment, particularly the laminin-integrin signaling and heparan sulfate proteoglycan, is important for the regionalization of definitive endoderm cells into pancreatic lineages. These results provide new insights for the differentiation mechanism of pancreatic cell lineages.     

In vitro hepatic differentiation of human umbilical cord blood and bone marrow cells

The purpose of the present study was to investigate whether human umbilical cord blood (UCB) as well as bone marrow (BM) can generate hepatocyte lineage cells in a simple culture condition. Mononuclear cells (MNCs) separated from UCB and BM were cultured in the presence of fibroblast growth factor (FGF)-1, FGF-2, stem cell factor (SCF), and hepatocyte growth factor (HGF). The cultured cells were analyzed for morphology and for the expression of mRNAs and/or proteins of hepatocyte lineage markers. Both the UCB and BM MNCs grown in the given culture condition yielded large, round cells that were adherent to the culture dishes. RT-PCR analysis showed that mRNAs of albumin (ALB), cytokeratin (CK)-18, and alpha-fetoprotein were expressed from day 7 in both the UCB- and BM-derived cells. Immunofluorescent staining showed that the large, round cells expressed not only ALB and CK-19 but also proliferating cell nuclear antigen, implying the proliferative potential of hepatocyte lineage cells. Therefore, UCB as well as BM can give rise to hepatocyte lineage cells in the simple culture condition with HGF, SCF, FGF-1, and FGF-2. These cells may be one of the potential candidates of cell sources for the cytotherapy of hepatic disease, although it remains to be determined if the hepatocyte lineage cells are derived from plastic hematopoietic stem cells or from liver stem cells that reside in UCB or BM.     

13-顺维甲酸体外诱导神经母细胞瘤干细胞分化的体外实验

目的 体外观察并鉴定13-顺维甲酸诱导神经母细胞瘤（NB）干细胞的分化作用,为临床用维甲酸治疗NB微小残留病灶提供实验依据。方法 取14例伴骨髓转移的Ⅳ期NB患儿的骨髓液标本,分离出NB细胞,将原代肿瘤细胞接种于无血清干细胞培养基中悬浮培养;在含5 μmol·L-1 13-顺维甲酸的分化培养基中培养神经球细胞,观察细胞的形态变化;RT-PCR法检测神经球细胞诱导前、诱导3和9 d Oct-4表达水平的改变;利用细胞免疫荧光技术比较诱导前及诱导9 d神经球细胞nestin表达的差异。结果 14例骨髓标本中,4例分离到原代NB细胞。无血清培养基中培养4~6 d后,可见原代悬浮神经球形成,传代后成球细胞能再次分裂增殖为神经球。神经球细胞在血清培养基中呈贴壁生长,呈三角形或星形,添加5 μmol·L-1 13-顺维甲酸后,细胞生长速度降低,形态发生明显改变。RT-PCR法检测结果显示,13-顺维甲酸诱导9 d后,神经球细胞Oct-4表达水平逐渐降低;细胞免疫荧光显示诱导9 d后神经球细胞nestin表达减弱。结论 13-顺维甲酸能有效诱导NB干细胞分化。