CD28-B7共刺激通路对外周血单个核细胞移植治疗重症肌无力的作用

背景:有研究表明,CD28-B7共刺激通路与重症肌无力的发生密切相关,但在干细胞移植治疗重症肌无力过程中的作用机制至今少有报道。目的:观察CD28-B7共刺激通路在重症肌无力大鼠模型中的表达情况。方法:40只雌性Lewis大鼠等分为正常组、模型组、佐剂组和移植组。后3组大鼠腹腔注射重症肌无力患者血清制备重症肌无力模型。移植组大鼠连续5d皮下注射粒细胞集落刺激因子10μg/(kg?d)动员骨髓中造血干细胞进入外周血,颈动脉采血10mL,分离获得单个核细胞,加入适量生理盐水调节核细胞浓度至2×109L-1;环磷酰胺50mg/kg于移植前第4,3,2天从尾静脉注入,1次/d,移植当天用胰岛素注射针吸取单个核细胞自尾静脉注入,移植成功。佐剂组给予等量生理盐水和环磷酰胺。结果与结论:移植组大鼠血清抗乙酰胆碱受体滴度、CD28、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、B7.1及B7.2的表达均显著低于模型组(P<0.01);模型组和移植组大鼠血清抗乙酰胆碱受体滴度滴度与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4呈正相关(r=0.236,P=0.001和r=0.215,P=0.013);移植组大鼠Lennon评分显著低于模型组(P<0.01)。提示干细胞移植可以通过抑制CD28-B7共刺激信号通路以调节机体的免疫系统。     

静脉移植骨髓间充质干细胞改善心肌病心力衰竭大鼠的心功能

目的：经静脉移植骨髓间充质干细胞至阿霉素诱导的心力衰竭大鼠体内，观察骨髓间充质干细胞对心功能的影响及其在体内的存活情况。 方法：实验于2004—03／2005—11在福建省高血压研究所完成。①分离纯化近交系F344大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养，采用流式细胞仪检测其表面标记CD34，CD44和CD90。②10只正常大鼠作为正常对照组。32只大鼠腹腔注射阿霉素（15mg／kg）建立心肌病心力衰竭模型，然后随机分为细胞移植组16只，以5-溴-2’脱氧尿苷标记第2代骨髓间充质干细胞，经股静脉移植；移植对照组16只，移植等量DMEM培养基。③细胞移植后4周，多导生理记录仪测量3组大鼠的心功能，心脏组织切片行免疫组织化学染色，观察移植细胞在受体大鼠体内的存活情况。 结果：实验中细胞移植组有4只大鼠，移植对照组有7只死亡，进入结果分析31只。①体外培养的第2代骨髓间充质干细胞均一表达CD44和CD90，不表达CD34。②心功能测定显示：细胞移植组大鼠的左室收缩压、左室内压最大上升速率和下降速率均比移植对照组明显升高[（101&;#177;7）比（76&;#177;6）mmHg，（4875&;#177;309）比（3644&;#177;380）mmHg／s，（5075&;#177;336），（3544&;#177;354）mmHg／s，P〈0．05]，而左室舒张末压明显降低[（15&;#177;1），（20&;#177;2）mmHg／s，P〈0．05]；移植对照组左室收缩压、左室内压最大上升速率和下降速率均比正常对照组明显下降（P〈0．05），而左室舒张末压明显升高（P〈0．05）。③免疫组织化学显示：细胞移植组大鼠的心脏组织切片上有5-溴-2’脱氧尿苷标记的移植细胞存活，并且表达心肌特异性抗原β-肌球蛋白重链；细胞移植组室间隔和左心室处血管数量均明显多于移植对照组[（9．0&;#177;1．3）比（6．5&;#177;1．9）血管数／高倍镜，（9．9&;#177;1．5）比（7．8&;#177;1．4）血管数／高倍镜，P〈0．05]。 结论①经静脉移植骨髓间充质干细胞可有效改善阿霉素诱导的心力衰竭大鼠心功能。②骨髓间充质干细胞可归巢至心脏，分化为心肌样细胞。     

CD4＋与T淋巴细胞干扰素Y／诱导型一氧化氮合酶／一氧化氮通路在脐带间充质干细胞移植治疗重症肌无力中的作用

背景：有研究表明,CD4＋、干扰素γ/诱导型一氧化氮合酶/一氧化氮通路与重症肌无力的发生密切相关。 目的：探讨CD4＋ T细胞与干扰素γ/诱导型一氧化氮合酶/一氧化氮通路在脐带间充质干细胞移植治疗重症肌无力中的作用机制。方法：建立重症肌无力大鼠模型,并进行脐带间充质干细胞经静脉移植治疗,同时设立对照组。流式细胞术检测移植后大鼠腋窝淋巴结细胞CD4＋的表达,ELISA法检测其干扰素γ的表达,Griess试剂和比色法检测一氧化氮和一氧化氮合酶水平。结果与结论：移植1周后,移植组大鼠腋窝淋巴结的淋巴细胞CD4＋的表达显著高于模型组（P 〈 0.01）,干扰素γ、一氧化氮及诱导型一氧化氮合酶水平显著低于模型组（P 〈 0.01）。证实,脐带间充质干细胞移植可上调重症肌无力模型大鼠淋巴细胞CD4＋的表达,并调节干扰素γ/诱导型一氧化氮合酶/一氧化氮通路,下调一氧化氮水平,以减轻机体的免疫损伤。     

针刺血清对脑源性神经干细胞分化的影响

目的：探讨针刺血清对脑源性神经干细胞分化的调控机制。方法：将实验大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、模型针刺血清组，制备各组血清培养脑源性神经干细胞，然后用免疫荧光显微镜观察其分化情况，计数各类分化细胞的百分率。结果：模型对照组神经元分化率较正常对照组显著下降（P〈0．05），模型针刺血清组神经元分化率较模型对照组显著提高（P〈0．05），与正常对照组比较，差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：针刺处理可上调脑源性神经干细胞向神经元的分化，促进脑损伤组织的康复。     

骨髓间充质干细胞对大鼠肝脏缺血-再灌注损伤的修复作用

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法，建立大鼠肝脏缺血．再灌注损伤动物模型，观察骨髓间充质干细胞对大鼠肝脏缺血．再灌注损伤的修复作用。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，建立大鼠肝脏缺血．再灌注损伤的模型。动物模型制备后，将30只大鼠随机分为实验组（即尾静脉注入骨髓间充质干细胞0．5ml，约10^6个）10只，阴性对照组（尾静脉注入生理盐水0．5ml）10只。以正常大鼠作为空白对照组10只。结果各组大鼠于1周，2周，4周进行采血，取脏器进行各项指标检测。肝脏缺血．再灌注损伤大鼠在第1周实验组和阴性对照组的丙氨酸转移酶（ALT）、门冬氨酸转移酶（AST）和丙二醛（MDA）均明显高于空白对照组，差异显著，P〈0．05。第2周时，实验组大鼠ALT、AST和MDA与阴性对照组比较，明显低于阴性对照组P〈0．05，但SOD明显高于阴性对照组P〈0．05。第4周时，实验组大鼠ALT、AST和MDA与阴性对照组比较，明显低于阴性对照组P〈0．05。但实验组与空白对照组MDA和SOD有差异P〈0．05。结论大鼠骨髓间充质干细胞对大鼠肝脏缺血-再灌注损伤的修复可起促进作用。     

移植骨髓间充质干细胞预防野百合碱诱导的肺动脉高压

背景：干细胞移植治疗肺动脉高压有一定疗效。目的：观察骨髓间充质干细胞移植治疗肺动脉高压的效果及并探讨其作用机制。方法：采用密度梯度离心法体外培养、纯化、扩增获得大鼠骨髓间充质干细胞,经荧光染料标记后备用。大鼠皮下注射野百合碱建立肺动脉高压模型,建模后1周将大鼠随机分为3组,干细胞移植组和肺动脉高压组大鼠皮下注射野百合碱建立肺动脉高压模型,1周后干细胞组大鼠经舌下静脉注射骨髓间充质干细胞悬液,肺动脉高压组注射等量不含干细胞的培养液,对照组皮下注射等量生理盐水。结果与结论：移植后2周,与野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠相比干细胞移植组血流动力学参数及右心室与体质量之比明显改善（P〈0．05）;肺血管重构程度减轻（P〈0．05）。荧光显微镜下发现干细胞组移植的骨髓间充质干细胞在大鼠体内能存活至少2周,部分干细胞能转化为血管平滑肌细胞。说明静脉移植骨髓间充质干细胞能明显改善野百合碱造成的肺动脉高压大鼠肺血管和右心室结构的损伤。     

人胚胎骨髓间质干细胞移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑病的实验

目的：在制作新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型基础上，研究间质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑病的应用前景。 方法：实验于2002-09／2004-03在深圳宝安血站干细胞研究实验室内完成。实验中采用L-DMEM分离培养骨髓中间质干细胞。7窝SD 1d龄新生大鼠共81只同窝随机分为4组：①正常组，不干预。②模型组：结扎左颈动脉，吸氧3h制成缺氧缺血性模型。③生理盐水组：造模后24h定位注射生理盐水8μL。④间质干细胞组：处理同生理盐水组，注射间质干细胞（1．0～2．0）&;#215;10^6／μL。Morris水迷宫试验评估移植后第42天大鼠学习和记忆能力；第10周麻醉状态下处死实验鼠，制作病理切片，苏木精-伊红染色和间接免疫荧光检测间质干细胞在脑内存活和分化情况。 结果：①第1周内成活率：第7天，81只实验鼠存活42只，间质干细胞组与正常对照组大鼠存活率分别为75．0％和82．4％，差异不显著；明显高于生理盐水组（35.3％）和模型组（50．0％）（P〈0．01）。②水迷宫试验显示间质干细胞组大鼠的空间识别和记忆能力明显优于生理盐水组和模型组（P〈0．01）；培训后第5天，间质干细胞组识别平台的平均时间为7．5s，与正常组7．0s不存在差异。③病理切片、苏木精-伊红染色和间接免疫实验结果显示：间质干细胞移植组中，进针注射部位存在大量移植细胞，并向周围迁移，皮质层、海马等部位检测到移植细胞；所植入的细胞约6％表达胶质纤维酸性蛋白，约8％表达神经元特异性烯醇化酶。结论：移植人间质干细胞组能有效修复缺氧缺血导致的神经受损，改善其功能，明显提高缺氧缺血性脑损伤大鼠1周内成活率。     

人间质干细胞移植治疗缺氧缺血性脑病的实验

目的：观察人胚间质干细胞移植至缺氧缺血性脑病新生大鼠后对其学习记忆能力的改善效果。 方法：7窝SD新生1d大鼠共81只，同窝随机分为正常对照组、间质千细胞组、生理盐水组和未治疗组4组。①后3组大鼠左颈动脉结扎，吸入体积分数为0．08的氧制作缺氧缺血性脑病模型；间质干细胞组脑定位注射分离培养的中期引产人胚胎（获供者知情）骨髓间质干细胞，每点注射2μL（细胞浓度为2&;#215;10^11L^-1）；生理盐水组同法注射等量生理盐水。观察各组新生大鼠1周内成活率。②移植后第6周对同窝4组大鼠进行Morris水迷宫训练，4d后进行测试，以找到平台的时间代表大鼠学习和记忆能力。③移植后第10周麻醉后处死实验鼠，苏木精-伊红染色和间接免疫荧光检测骨髓间质干细胞在大鼠脑内存活和分化情况。 结果：①组新生大鼠1周内成活率比较：间质干细胞组明显高于生理盐水组和未治疗组[75．0％（15／20），35．3％（6／17）50．0％（7／14），P〈0．01]，而与正常对照组比较差异不显著（P〉0．05）。②4组新生大鼠水迷宫实验结果：间质干细胞组大鼠找到平台的时间明显短于生理盐水组和未治疗组（P〈0．01）；训练3d后与正常对照组差异不显著。（3）4组新生大鼠免疫荧光检测结果：间质千细胞组中，进针注射部位存在大量移植细胞，并向周围迁移，皮质层、海马等部位检测到移植细胞；所植入的细胞约6％表达胶质纤维酸性蛋白，约8％表达神经特异性烯醇化酶。 结论：移植人胚胎骨髓间质干细胞能提高缺氧缺血性脑病新生大鼠存活率，改善其学习记忆能力。间质干细胞在鼠脑内最少可以存活10周。     

静脉注射同种异体骨髓间充质干细胞对血管性痴呆大鼠海马区脑组织形态及微管相关蛋A2表达的影响

目的：骨髓间充质干细胞移植进入脑组织后，能否影响脑组织的形态及微管相关蛋白2的表达从而改善痴呆状态下的认知功能？观察静脉注射同种异体骨髓间充质干细胞后，血管性痴呆模型大鼠脑海马CAl区脑组织形态及微管相关蛋白2的变化。方法：实验于2004-08／2005-05在解放军第二军医大学完成。①实验动物：健康雄性SD大鼠60只，随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组、假手术组，20只，组。②实验方法：另取20只大鼠用于体外分离、培养扩增骨髓间充质干细胞，传至第2代时加入BrdU进行标记，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为3x109L～。细胞移植组、模型对照组采用双侧颈总动脉结扎法建立血管性痴呆动物模型，假手术组仅暴露双侧颈总动脉但不结扎。造模后4周，细胞移植组尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬液1mL，模型对照组注射等量磷酸盐缓冲液，假手术组不进行尾静脉注射。③实验评估：细胞移植后4周，苏木精一伊红染色检测各组大鼠脑海马CAl区脑组织形态变化，免疫荧光染色观察经BrdU标记的骨髓间充质干细胞示踪情况，免疫组织化学染色检测脑海马CAl区微管相关蛋白2的表达。结果：细胞移植组5只大鼠死亡，模型对照组3只大鼠死亡，假手术组均进入结果分析。①脑海马CAl区锥体细胞形态变化：细胞移植组和模型对照组CAl区锥体细胞较假手术组排列稀疏、紊乱，细胞肿胀、脱失，核固缩，但细胞移植组细胞排列较模型对照组规则，且细胞肿胀、脱失及核固缩较模型对照组减轻。②脑海马内骨髓间充质干细胞的示踪：细胞移植后4周，大鼠脑海马内可见被绿色荧光标记的骨髓间充质干细胞。③脑海马CAl区微管相关蛋白2的表达：与假手术组比较，细胞移植组及模型对照组脑海马CAl区锥体细胞层微管相关蛋白2阳性产物的吸光度值均明显降低（P〈0．05）；细胞移植组明显高于模型对照组（P〈0．05）。结论：静脉注射骨髓间充质干细胞能够使血管性痴呆大鼠脑海马CAl区神经元损伤及脱失减轻，并使微管相关蛋白2表达增加。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠急性心肌梗死后心功能及bcl-2和caspase-3mRNA表达水平的影响

目的观察急性心肌梗死大鼠应用骨髓间充质干细胞（MSCs）移植前后心功能及凋亡相关蛋白bcl-2和caspase-3 mRNA的变化,以期了解骨髓间充质干细胞移植治疗心梗的机制。方法40只SD大鼠,雌雄各半,随机分为对照组、假手术组、心梗组、移植组,每组各10只。心梗组和移植组大鼠分别结扎前降支造成心梗模型。取大鼠骨髓,体外分离扩增培养MSCs。术前4组大鼠进行超声心动图检测心功能,结扎后移植组立即予MSCs多点注射到大鼠心肌梗死区周边,而梗死组和假手术组注射同剂量培养液,对照组不注射。饲养8周后,分别予超声心动图心功能检测。取梗死周边区心肌行RT-PCR检测bck2和caspase-3mRNA的表达。结果术前4组大鼠心功能指数无显著差异（P〉0．05）;而MSCs移植后,梗死组大鼠心肌LVESD、LVEDD较其它3组明显增高,差异具有显著性（P〈0．05）;而移植组又较对照组和假手术组明显增高（P〈0．05）;而对照组和假手术组在上述指标中无显著差异（P〉0．05）;梗死组大鼠EF较其它3组明显降低（P〈0．05）;而移植组又较对照组、假手术组明显降低（P〈0．05）;而对照组与假手术组之间无显著差异（P〉0．05）。bd-2mRNA在对照组和假手术组表达较少,而在梗死组表达增加,差异有显著性（P〈0．05）;在移植组表达更多,与梗死组相比有显著性（P〈0．05）;caspase-3在对照组和假手术组表达较少,在梗死组表达增加,有显著差异（P〈0,05）;在移植组表达又较梗死组表达减少,有显著差异（P〈0．05）;但与对照组和假手术组相比,表达增加（P〈0．05）。结论急性心肌梗死移植MSCs后,心功能得到改善,心肌凋亡得到抑制。