宫颈癌C-33A细胞RASSF1A基因启动子CG位点甲基化及其临床意义

目的检测宫颈癌C-33A细胞RASSF1A基因启动子CG位点甲基化状态及mRNA,并探讨其临床意义。方法提取正常健康人宫颈上皮细胞和宫颈癌C-33A细胞总DNA和RNA,分别进行重亚硫酸氢盐测序（BSP）和RT-PCR扩增,检测RASSF1A基因启动子CG位点甲基化状态和RASSF1A基因mRNA。结果 C-33A细胞RASSF1A基因启动子CG位点呈现高甲基化状态,显著高于正常宫颈上皮细胞（P〈0.01）;C-33A细胞RASSF1A mRNA表达量明显低于正常宫颈上皮组织（P〈0.01）。结论宫颈癌C-33A细胞RASSF1A基因启动子CG位点呈高度甲基化状态,其RASSF1A mRNA表达明显受到抑制。RASSF1A基因启动子CG位点甲基化在宫颈癌发生过程中发挥重要作用。     

睾丸组织中ACRBP的表达及启动子CpG位点的甲基化分析

目的了解人睾丸组织中ACRBP的表达及其启动子CpG位点的甲基化状态,为探讨该基因表达机制奠定基础。方法运用免疫组化法研究睾丸组织中目的蛋白定位;结合生物信息学分析该基因启动子CpG位点序列;通过Bisulfite PCR测序法（BSP）分析目的基因CpG位点的甲基化状态。结果免疫组化显示精子与精子细胞及部分的精原细胞和精母细胞表达目的蛋白。对ACRBP启动子序列（转录起始点-127～＋110 bp）进行BSP扩增测序,发现该区域共有24个CpG位点,其中仅有3个出现甲基化,其甲基化频率为1.67%。结论生精小管中ACRBP蛋白呈区域性的阳性反应,可能与生精小管内精子发生的不同步性有关;ACRBP启动子CpG位点低甲基化可能与该基因表达的机制有关。     

MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态对脑胶质瘤预后的影响

目的探讨脑胶质瘤DNA修复基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）和错配修复基因（MMR）（hMLH1、hMSH2）启动子甲基化状态及其对患者预后和烷化剂化疗敏感性的影响。方法采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测39例脑胶质瘤和6例正常脑组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态,免疫组化方法测定其蛋白表达。绘制Kaplan-merier生存曲线。结果脑胶质瘤组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化发生率分别为46.2%、10.3%和20.5%,而正常脑组织相应基因启动子区未发生甲基化;三种基因启动子未甲基化模式与其对应蛋白表达模式相似。MGMT基因甲基化的脑胶质瘤患者存活率显著高于未甲基化者（P〈0.05）;MMR基因甲基化患者中MGMT基因甲基化与未甲基化者的生存期无统计学差异（P〉0.05）。结论hMLH1、hMSH2及MGMT甲基化是脑胶质瘤发生过程中常见的分子事件;联合检测MGMT、hMLH1和hM-SH2基因启动子甲基化状态可判断脑胶质瘤患者的预后及其对烷化剂化疗的敏感性。     

卵巢癌组织中肺癌抑癌基因1基因启动子甲基化状态及其临床意义

目的探讨肺癌抑癌基因1(TSLC1)在卵巢癌中基因启动子甲基化状态及临床意义。方法应用甲基化特异性PCR检测TSLC1基因启动子在50例卵巢癌组织和10例正常卵巢组织中的甲基化状态并结合临床病理资料进行分析。结果在卵巢癌组织中TSLC1甲基化阳性率(36%,18/50),正常卵巢组织未出现TSLC1甲基化。TSLC1甲基化与肿瘤淋巴结转移与Silverberg分期密切相关(P0.05)。结论 TSLC1甲基化可能是参与卵巢癌发展的重要分子事件。     

慢性粒细胞白血病ZO-1基因启动子区甲基化状态分析及临床意义探讨

目的通过对慢性期及急变期慢性粒细胞白血病（CML）患者骨髓标本中人紧密连接蛋白1（ZO-1）基因启动子区甲基化状态的分析,初步探讨其在CML病情发展变化中的临床意义。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）检测5例CML慢性期和10例CML急变期患者骨髓标本中ZO-1基因启动子区的甲基化状态。结果在5例CML-CP患者中ZO-1基因启动子区呈非甲基化状态;在7例CML-BP患者中ZO-1基因启动子区呈高甲基化状态,甲基化阳性率为70%（7/10）;1例CML患者其慢性期骨髓标本ZO-1基因启动子区呈非甲基化状态,而急变期则呈甲基化状态,经治疗恢复到慢性期时,则又表现为非甲基化状态。结论 ZO-1基因启动子区甲基化状态可能与CML病情发展变化密切相关,可能是一个提示CML急变的分子标志物。     

急性白血病ZO-1基因表达与甲基化调控关系的研究

目的探讨人急性白血病细胞系与正常骨髓细胞中ZO-1基因启动子区甲基化状态的差异及其与基因表达的关系。方法应用反转录聚合酶链反应的方法观察3种人白血病细胞株HL60、NK92、Molt4及正常人骨髓有核细胞中ZO-1基因的表达情况;应用甲基化特异性聚合酶链反应的方法分别检测其ZO-1基因启动子区的甲基化状态;应用去甲基化药物处理HL-60细胞,观察处理后ZO-1基因甲基化状态及基因表达的变化。结果在10例正常骨髓细胞均可发现ZO-1基因表达,而在3种白血病细胞系中未见其表达;正常骨髓细胞中ZO-1基因启动子区无甲基化。而在3种白血病细胞中呈完全甲基化;应用去甲基化药物处理HL-60细胞使其ZO-1基因启动子区去甲基化,可重新诱导ZO-1基因的表达。结论ZO-1基因的表达受甲基化状态调控,ZO-1基因可能与白血病发生相关。     

新疆汉族2型糖尿病患者miR-375基因启动子区甲基化的初步研究

目的探讨新疆汉族T2DM及糖耐量正常(NGT)人群miR-375启动子区部分CpG位点的甲基化状态。方法采用基质辅助激光解析电离时间飞行质谱仪检测100例T2DM患者(T2DM组)和100名NGT者(NGT组)外周血白细胞中miR-375基因启动子区5个CpG位点的甲基化状态,并对结果进行分析。结果 (1)T2DM组平均甲基化水平高于NGT组(10.27%vs 7.24%,P0.01);(2)T2DM组miR-375基因5个CpG位点的甲基化率均高于NGT组,如CpG_22、CpG_24.25、CpG_26.27,仅CpG_26.27在两组中比较,差异有统计学意义(P0.01)。结论汉族T2DM患者外周血白细胞中miR-375基因部分启动子区异常甲基化水平可能与T2DM的发生有一定的关系。     

粪便DNA中MGMT、XAF1基因启动子甲基化联合检测在结直肠癌筛查中的应用研究

目的使用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测粪便DNA中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)、X染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)基因启动子甲基化情况,并探讨其在结直肠肿瘤诊断中的意义。方法收集40例结直肠腺癌、40例腺瘤性息肉、52例正常对照住院患者粪便标本,使用试剂盒提取其粪便中肠道脱离细胞DNA,通过MSP方法检测其MGMT、XAF1基因启动子甲基化情况。结果 MGMT、XAF1基因启动子甲基化在结直肠腺癌中的阳性率分别为50.0%、55.9%;在腺瘤性息肉中的阳性率分别为42.1%、52.6%;二者联合检测在结直肠腺癌及腺瘤性息肉中的阳性率分别为73.5%、68.4%;特异性为52.0%。结直肠腺癌患者粪便中粪便潜血阳性率为35.3%,CEA阳性率为35.3%。结论通过试剂盒提取粪便DNA具有较高成功率;粪便DNA中MGMT、XAF1基因启动子甲基化状态用于检测结直肠腺癌及腺瘤性息肉具有较高的敏感性。检测粪便基因甲基化有望成为CRC高风险人群筛查的一个重要途径。     

同型半胱氨酸对强直性脊柱炎患者MTHFR基因启动子甲基化状态的影响

目的探讨同型半胱氨酸（Hcy）对强直性脊柱炎（AS）患者亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因启动子甲基化状态的影响。方法运用酶联免疫吸附法测定36例AS患者及30例对照组血浆Hcy水平,采用MS—PCR法分析MTHFR基因启动子甲基化水平。结果AS患者血浆Hcy水平明显高于对照组,两组间比较差异具有统计学意义（P〈0．05）;AS组中有29例患者其MTHFR基因启动子出现非甲基化特异PCR条带,与对照组比较有显著性差异（P〈0．05）;AS组中血浆Hcy〉20μmol／L的患者其MTHFR基因启动子甲基化状态与对照组比较,存在显著性差异（P〈0．05）。结论部分AS患者MTHFR基因启动子区出现去甲基化,高Hcy血症影响了AS患者MTHFR基因启动子区的去甲基化过程。     

IRX1在胰腺癌中的表达及其启动子区甲基化状态

目的 检测胰腺癌的易洛魁族同源盒基因(IRX1)的表达及其启动子区的甲基化状态,探讨两者间的相关性.方法 采用实时PCR法检测12例胰腺癌组织及6株胰腺癌细胞株的IRX1 mRNA 表达.基因序列分析IRX1基因启动子区结构.应用甲基化抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理胰腺癌细胞,采用甲基化特异性PCR(MSP)、非甲基化特异性PCR (USP)及实时PCR检测处理前后IRX1启动子甲基化状态和IRX1 mRNA表达.结果 胰腺癌组织IRX1 mRNA的表达量为0.31±0.11,显著低于癌旁正常胰腺组织的1.05±0.32(P ＜0.01).胰腺癌细胞AsPCl、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990的IRX1 mRNA表达量分别为0.36±0.08、0.34±0.16、0.37±0.11、0.25±0.06、0.31±0.04、0.36±0.02,均显著低于人肾上皮293细胞的1.03±0.28(P＜0.05或＜0.01).IRX1基因启动子区富含CpG岛.各胰腺癌细胞株IRX1基因启动子CpG岛对应位点均有甲基化,经5-Aza-dC处理后甲基化状态得以逆转,IRX mRNA的表达也得以恢复.结论 胰腺癌的IRX1 mRNA表达下降,与其IRX1基因启动子区CpG岛高甲基化状态相关.     

5-Aza-CdR对肝癌细胞DAPK基因甲基化的影响

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肝癌细胞株SMMC-7721中死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子CpG岛甲基化的影响。方法不同浓度(0.5μmol/L、5.0μmol/L、50.0μmol/L)5-Aza-CdR处理人肝癌细胞株SMMC-772172小时后,用焦磷酸测序法检测处理前后DAPK基因启动子CpG岛甲基化水平。以未经处理的人肝癌细胞株SMMC-7721作为对照组。结果未经5-Aza-CdR处理的肝癌细胞SMMC-7721细胞株DAPK基因启动子高度甲基化,平均水平为76.71%。经3种不同浓度药物处理72小时后,各组间甲基化平均水平分别为78.29%、77.57%和66.00%,各组间甲基化水平差异均有统计学意义(F=39.71,P<0.01)。其中,50.0μmol/L处理组细胞甲基化水平最低,与其他各组差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 SMMC-7721细胞株DAPK基因启动子区呈高度甲基化状态;5-Aza-CdR能够逆转人肝癌细胞SMMC-7721DAPK基因启动子区域的甲基化状态。     

Influence of DNA methyltransferase 3b on FHIT expression and DNA methylation of the FHIT promoter region in hepatoma SMMC-7721 cells

BACKGROUND:Alterations in DNA methylation occur during the pathogenesis of human tumors.In this study, we investigated the influence of DNA methyltransferase 3b(DNMT3b)on fragile histidine trial(FHIT)expression and on DNA methylation of the FHIT promoter region in the hepatoma cell line SMMC-7721. METHODS:DNMT3b siRNA was used to down-regulate DNMT3b expression.DNMT3b and FHIT proteins were determined by Western blotting.Methylation-specific PCR was used to analyze the methylation status of the FHIT gene. R...     

Extensive methylation of hMLH1 promoter region predominates in proximal colon cancer with microsatellite instability.

BACKGROUND & AIMS: Methylation of the hMLH1 promoter region has been suggested to cause microsatellite instability (MSI) in sporadic colorectal carcinoma (CRC). We studied the methylation profile in a wide region of the hMLH1 promoter and compared with the hMLH1 protein expression and MSI status in 88 cases of sporadic CRC. METHODS: Na-bisulfite treatment and polymerase chain reaction single-strand conformation polymorphism analysis was performed using 5 sets of polymerase chain reaction primers spanning the promoter region of the hMLH1 to examine methylation status. Results were compared with immunostaining using anti-hMLH1 monoclonal antibody and MSI status of the tumor samples. RESULTS: Methylation status was classified as full or partial methylation. Full methylation indicates the methylation of all CpG sites in the examined regions. Methylation of the hMLH1 promoter was observed in 88.9% (16 of 18) of CRCs showing high frequency MSI (MSI-H), among which 89% (14 of 16) had full methylation with reduced hMLH1 protein expression. All cases showing full methylation were proximal colon tumors with MSI-H. In cases with partial methylation, only the upstream region of the hMLH1 promoter was methylated. Partial methylation was also shown in 33.3% (6 of 18) of the normal mucosa of MSI-H cases. Frequencies of methylation were significantly correlated with female gender (P = 0.0009) and aging (P = 0.007). CONCLUSIONS: Full methylation of the hMLH1 promoter region and subsequent gene inactivation may play a crucial role in the carcinogenesis of MSI-H CRCs in the proximal colon. Methylation upstream of the hMLH1 promoter appears to be an early event in the carcinogenesis of MSI-H tumors.     

黑色素瘤相关抗原A1在肝癌细胞株中的表达与基因甲基化程度的相关性

目的 探讨人肝癌细胞株中黑色素瘤相关抗原A1(MAGE-A1)表达状况与肝癌细胞基因甲基化的关系。方法 提取10种人肝癌细胞株的总RNA,用逆转录聚合酶链反应对细胞株的MAGE-A1基因的表达进行检测;提取10种人肝癌细胞株的基因组DNA,用限制性酶切和Southern印迹杂交对每种细胞的基因组甲基化程度进行定量分析。另外对基因组DNA行HpaⅡ酶切后,用引物CDS21、EDP4和CDS20、EDP4进行聚合酶链反应扩增,然后用特异性探针杂交来检测肝癌细胞株MAGE-A1启动子的甲基化状态。用特异性序列聚合酶链反应方法检测每一种细胞株的人白细胞抗原-A位点型别。结果 QGY-7703、SMMC-7721、HLE、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405肝癌细胞株的MAGE-A1基因表达阳性,且细胞分化程度均为中低分化;HepG2 2．2．15、HepG2、QGY-7701和Huh7肝癌细胞株的MAGE-A1基因表达阴性,且细胞分化程度均为高中分化。通过定量分析表明,MAGE-A1表达的肝癌细胞株与MAGE-A1不表达的肝癌细胞株比较,前者基因组甲基化程度较低(t=2．896,P=0．02)。肝癌细胞株MAGE-A1基因启动子区甲基化分析结果表明HepG2 2．2．15、HepG2、QGY-7701和Huh7为高甲基化,SMMC-7721、HLE、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405为低甲基化。结论 肝癌细胞株MAGE-A1 mRNA表达与其基因甲基化程度有关。     

骨髓增生异常综合征患者p15^INK4B基因甲基化状态的研究

目的：检测骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes,MDS）患者抑癌基因p15^INK4B启动子区异常甲基化情况及其mRNA表达水平,探讨p15^INK4B基因异常甲基化在MDS发生、发展中的作用。方法：应用甲基化特异性PCR检测32例MDS患者骨髓p15^INK4B基因启动子区甲基化状态,逆转录PCR（RT-PCR）检测p15mRNA表达情况。结果：32例MDS患者骨髓有14例检测到p15^INK4B基因启动子甲基化（甲基化阳性率为43.8%）,且多为高危型患者。MDS患者骨髓p15mRNA表达水平明显降低。MDS患者p15^INK4B基因启动子甲基化与p15mRNA表达缺失具有明显的相关性。结论：MDS中p15^INK4B基因启动子高甲基化与基因表达失活密切相关,并在MDS的发生、发展中有重要作用。     

急性白血病ZO-1基因启动子区甲基化状态分析及其临床意义

目的 探讨紧密连接蛋白-1(Zonula occludens-1,ZO-1)基因启动子区甲基化状态在人急性白血病(AL)发生、发展中的作用及作为通用性基因标志物的临床意义.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测白血病细胞系HL60、Molt4、NK92和40例非恶性血液病以及81例AL骨髓ZO-1基因启动子区的甲基化状态.结果 ZO-1基因启动子区在白血病细胞系中呈完全甲基化状态;而在40例非恶性血液病标本中均为非甲基化;81例AL标本中甲基化阳性率为60.49%(49/81),其中难治复发组为92.86%(13/14),高于初诊未治疗组65.85%(27/41)及完全缓解组34.62%(9/26);急性髓细胞白血病组61.54%(32/52)与急性淋巴细胞白血病组58.62%(17/29)比较差异无统计学意义.结论 首次证明ZO-1基因启动子区高甲基化状态在人AL中具有较高的特异性,与疾病发生、发展密切相关,可作为一个新的白血病通用分子标志.