骨髓基质细胞对脑神经干细胞分化为神经元的诱导作用

目的：观察成年大鼠骨髓基质细胞诱导的新生大鼠中脑神经干细胞分化为神经元的机制。方法：采用骨髓基质细胞和神经干细胞共培养方法，通过显微镜观察神经干细胞的分化状态，使用免疫组织化学技术，分析神经元在神经细胞后代中所占的比例。结果：（1）骨髓基质细胞可诱导神经干细胞分化为高比例神经元；（2）骨髓基质细胞可促进神经元的存活。结论：骨髓基质细胞可提供神经干细胞分化为神经元和促进神经元存活的信号物质。     

骨髓基质细胞对共培养条件下的脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元的诱导

目的：研究骨髓基质细胞对共培养条件下脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元的情况。方法：从孕龄13 d的胚胎大鼠脊髓组织中分离神经干细胞,采用含EGF及bFGF的无血清限定性培养基培养,并通过与骨髓基质细胞进行共培养,观察脊髓源神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况,用细胞免疫荧光染色鉴定分化结果。结果：从胚胎脊髓中分离得到大量的神经干细胞,通过限定性培养基培养可获得干细胞球,与骨髓基质细胞共培养可被诱导分化,用细胞免疫荧光染色鉴定,可见有胆碱能神经元生成。结论：胚胎大鼠脊髓源神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并保持稳定的性状,在与骨髓基质细胞共培养时,可以被诱导分化为胆碱能神经元。     

转染胶质细胞源性神经营养因子诱导神经干细胞分化

背景：神经干细胞为神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径,解决其定向诱导分化问题仍是目前的研究热点。 目的：探讨转染胶质细胞源性神经营养因子基因诱导大鼠胚胎神经干细胞向神经元和多巴胺能神经元分化的作用。 方法：构建PcDNA3-GDNF-GFP表达质粒,用脂质体介导该质粒转染大鼠胚胎神经干细胞并进行诱导分化,荧光显微镜观察转染情况,免疫荧光染色检测β微管蛋白Ⅲ和酪氨酸羟化酶表达。 结果与结论：胶质细胞源性神经营养因子基因转染后3 d,可观察到细胞呈绿色荧光细胞球状。诱导分化7 d,神经干细胞分化为神经元以及多巴胺神经元的比例明显增高。结果表明胶质细胞源性神经营养因子基因可以促进神经干细胞向神经元以及多巴胺能神经元分化。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

人骨髓间充质干细胞诱导向多巴胺能神经元的分化

背景:体内外研究发现人骨髓间充质干细胞分化为神经元的比率都明显低于胶质细胞,并且这为数不多的神经元会逐渐死亡,而最终存活的细胞中神经元的数量更少。目的:观察人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经元的潜能。方法:分离纯化和扩增人骨髓间充质干细胞,在体外先用碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子进行预诱导后,以胶质细胞源性神经营养因子和血管紧张素Ⅱ联合诱导人骨髓间充质干细胞向神经元和多巴胺能神经元分化。观察分化过程中细胞的形态变化,利用免疫组织化学检测神经元和多巴胺能神经元特异性标志物的表达情况。结果与结论:人骨髓间充质干细胞经诱导后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,明显表达抗人神经巢蛋白[(55.7±4.3)%]和神经元特异性烯醇化酶[(78.2±6.7)%],而且大部分人骨髓间充质干细胞表达酪氨酸羟化酶[(48.5±5.6)%],不表达神经胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白。提示在适宜的条件下,人骨髓间充质干细胞可分化成神经元和多巴胺能神经元样细胞。     

黄连素诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:黄连素体外定向诱导SD大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。方法:用全骨髓细胞悬液体外扩增和纯化骨髓间质干细胞。选用第5代以后骨髓间质干细胞进行诱导分化,用含10 μg/L碱性细胞生长因子(bFGF)的完全培养液预诱导24 h,后更换含黄连素的无血清DMEM诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元烯醇酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间质干细胞体外扩增第5代后细胞形态达到均一,成梭形。加黄连素诱导1h-8 h,间质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,形似神经细胞。免疫组化显示诱导的神经元样细胞NSE、NF表达阳性,GFAP阴性。结论:黄连素可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

SD大鼠骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化的初步实验研究

以 SD大鼠为实验对象 ,从其骨髓分离出骨髓基质细胞 (BMSC) ,利用 L IF、b FGF、RA等增殖及分化诱导因子和神经干细胞培养液进行培养、分化诱导 ,观察 SD大鼠骨髓基质细胞体外培养的生长行为及扩增、分化情况。我们观察到 ,分离得到的骨髓基质细胞在体外培养中能形成细胞克隆团 ,这些具有克隆能力的骨髓基质细胞经传代后 ,其数量明显多于原代培养 ;BMSC经持续培养具有增殖能力以及分化为组织细胞的潜能 ,其分化细胞形态多样 ,包括胶质细胞样细胞和神经元样细胞。实验结果证明 ,骨髓基质细胞具有较强的自我更新的能力和多分化能力 ,也说明本实验所采用的细胞培养方法适用于骨髓基质细胞的体外生存与扩增。骨髓基质细胞较容易取材、体外培养和扩增 ,并具有多向分化潜能 ,在合适的诱导分化条件下 ,可分化出神经细胞 (神经元和神经胶质细胞 ) ,是理想的种子细胞     

血清浓度对雪旺细胞诱导神经上皮干细胞分化的影响

目的:探讨血清对雪旺细胞诱导神经上皮干细胞分化的影响。方法:从新生鼠坐骨神经及臂丛神经分离纯化雪旺细胞,从孕11.5 d大鼠胚胎分离培养神经上皮干细胞,含0%、1%、5%、10%胎牛血清的培养液联合培养雪旺细胞与神经上皮干细胞,收集上清作为条件培养液诱导神经上皮干细胞分化,1周后MAP-2和GFAP细胞免疫化学染色,显微镜下观察统计神经上皮干细胞分化为神经元与星形胶质细胞的比例。结果:条件培养液促进神经上皮干细胞存活和分化,分化形成的神经元大体形态与成熟神经元相似,0%、1%、5%、10%血清条件培养液组神经元与星形胶质细胞比例分别为1.53:1、1.13:1、1.03:1、0.75:1。结论:血清影响雪旺细胞诱导神经上皮干细胞向神经元分化,血清浓度增加,神经上皮干细胞分化形成的神经元减少。     

羊膜上皮细胞条件培养液对大鼠骨髓基质细胞神经分化的影响

目的探讨羊膜上皮细胞条件培养液对大鼠骨髓基质细胞分化为神经细胞的作用。方法体外分离、培养羊膜上皮细胞及大鼠骨髓基质干细胞,流式细胞术检测其表面抗原,免疫组织化学染色技术检测巢蛋白(Nestin)以及增殖细胞相关核抗原(ki67)在细胞中的表达。采用羊膜上皮细胞条件培养液对其进行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态的变化,免疫荧光染色技术检测神经特异烯醇化酶(NSE)以及多巴胺能神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运体(DAT)在诱导后细胞中的表达,并进行定量比较分析。结果羊膜上皮细胞条件培养液能够诱导大鼠骨髓基质细胞向神经细胞方向分化。结论羊膜上皮细胞条件培养液可以诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞和多巴胺能神经元样细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景：研究表明,移植后的骨髓间充质干细胞在新的环境中能够被诱导分化为神经元样细胞,从而替代损伤细胞重建神经环路。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞和神经细胞的体外共培养系统,观察共培养条件下神经细胞对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响。 方法：体外培养Wistar大鼠脑组织神经细胞和股骨骨髓间充质干细胞,采用Transwell小室共培养分化诱导,观察骨髓间充质干细胞的组织形态变化,在共培养第5天免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞中神经细胞的特异标志物;与对照组单纯骨髓间充质干细胞培养结果相比较。 结果与结论：神经细胞共培养系统中的骨髓间充质干细胞生长伸展,呈放射状,互相形成连接,特异性烯醇化酶显示阳性结果,具有神经元样细胞的特性,表达特异性烯醇化酶阳性的神经元比例可达(33.0±10.5)%。而对照组骨髓间充质干细胞未形成神经元样细胞的形态结构,免疫荧光显示特异性烯醇化酶阴性。提示神经细胞提供的微环境对骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞具有诱导分化作用。      

Zfp521在大鼠骨髓间充质干细胞向神经元分化过程中的表达变化及意义

目的: 探讨锌指蛋白521(Zfp521)在大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元过程中的表达变化及意义。方法: 体外培养大鼠MSCs,实验分为未转染组、转染组(转染Rn-Zfp521-siRNA)和阴性对照组(转染negative control siRNA),采用β-巯基乙醇诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元。倒置荧光显微镜下观察MSCs转染后荧光表达情况。采用免疫细胞化学法、RT-PCR法及Western blotting法检测诱导后神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP-2)的表达情况及诱导前、后Zfp521的表达变化。结果: (1)siRNA转染72 h荧光表达最强,转染率可达84.1%±2.3%,转染组骨髓间充质干细胞的Zfp521 mRNA表达下降(P<0.05);(2)β-巯基乙醇可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元,以转染组诱导效果最佳,NSE和MAP-2表达显著高于其它各组(P<0.05);(3)Zfp521在各组细胞中均有表达,诱导后Zfp521表达明显低于诱导前(P<0.01)。结论: Zfp521在大鼠骨髓间充质干细胞神经分化中表达下降,抑制Zfp521表达可促进神经元的分化,提示Zfp521在骨髓间充质干细胞的神经分化中可能发挥重要调控作用。     

骨髓基质细胞促进神经干细胞增殖分化

目的：探讨骨髓基质细胞（BMSCs）对神经干细胞（NSCs）增殖分化的影响。 方法:在体外比较NSCs在单独培养和在BMSCs条件培养液中培养下的分化和增殖情况。 结果:应用BMSCs条件培养液培养NSCs，分化的神经元比例较显著高于NSCs单独培养（41.1%±3.2% vs 23.3%±16.5%，P<0.05），而分化的星形胶质细胞所占比例显著降低（33.8%±4.9% vs 65.0%±10.4%，P<0.01），同时增殖细胞所占比例也显著增高（74.7％±4.7％ vs 51.4％±12.3％，P<0.01）。 结论:BMSCs对NSCs有促进其增殖和向神经元分化的作用。NSCs与BMSCs联合移植可能会增强NSCs移植的抗脑损伤作用。     

骨髓基质细胞促进人胚神经干细胞向神经元的分化

目的:探讨骨髓基质细胞(BMSCs)对人胚神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法:采用机械法分离人胚NSCs,成球法进行传代培养,采用免疫荧光染色检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达鉴定NSCs。按培养方式不同,分为NSCs自然分化组、BMSCs和NSCs直接接触共培养组及Transwell共培养组,采用免疫细胞荧光法及免疫印迹法检测各组神经元和星形胶质细胞标志物的表达。结果:在直接接触共培养组和transwell共培养组中,免疫荧光染色显示神经元标志物NSE阳性细胞率明显高于自然分化组,而星形胶质细胞标志物GFAP阳性细胞率低于自然分化组。免疫印迹检测显示Transwell共培养组中NSE表达量显著高于自然分化组,而GFAP表达量低于自然分化组。结论:BMSCs具有促进NSCs向神经元分化的作用。     

骨髓基质细胞分泌蛋白的蛋白质质谱分析

目的通过Shotgun蛋白质组学分析,初步检测骨髓基质细胞(BMSCs)条件液中可能含有的蛋白质。方法将BMSCs条件液混匀后经超滤浓缩分为大于5kD和小于5kD两部分,并培养神经干细胞(NSCs),观察其后代中神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的比例,鉴定出能调节NSCs分化的部分,并进行Shotgun蛋白质组学分析。结果BMSCs条件液分子量大于5kD的部分可以调节NSCs向神经元和少突胶质细胞方向分化,这部分条件液先经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)发现大部分蛋白集中在14kD以上,将蛋白条带酶解以后,经Shotgun分析共鉴定到456种蛋白质,其中154个相似蛋白质,17个假想蛋白质,56个未知蛋白质,剩余的229个蛋白质中大多为细胞骨架蛋白、分泌蛋白、信号转导蛋白、酶类和转运蛋白等。结论BMSCs分泌的多种蛋白质对NSCs的分化起调节作用,明确了BMSCs条件液中可能含有的成分。     

胚胎海马来源干细胞移植治疗缺血性脑梗死的研究

目的： 对脑梗死大鼠进行胚胎海马来源的干细胞移植治疗,观察其能否在梗死灶部位分化为成熟的神经元而发挥神经替代作用,并最终改善动物的肢体功能。方法: 从绿色荧光蛋白(GFP)转基因SD胚胎大鼠的海马提取细胞进行体外培养,免疫荧光染色观察这些细胞的特征。光化学法制作大脑皮层局灶缺血梗死模型, 即光血栓皮层损伤(PCI)。PCI后1 d将20只SD大鼠随机分为干细胞移植组和对照组,前者在梗死灶附近植入胚胎海马来源的干细胞,而后者不进行干细胞移植。在PCI后1、7、14、21 d,用旋转实验对动物的肢体功能进行测试和评分。在PCI后3周和12周,以抗神经元核抗体(NeuN)染色成熟的神经元,观察移植干细胞的存活及其分化为各种亚型神经细胞的情况。结果: 来自SD大鼠胚胎海马的细胞明显表现出神经干细胞的特征。移植的细胞可以在脑梗死动物模型中至少存活12周,并能分化为成熟神经元、星形胶质细胞等亚型的神经细胞。与移植后3周相比,12周时的NeuN+/GFP+ 密度和移植物体积均有所减少(P<0.05)。旋转实验结果表明,在PCI后7、14、21 d,移植组动物在平衡木上的停留时间均显著长于对照组(P<0.01)。结论: 来源于胚胎海马的细胞具有神经干细胞特征,其被移植入脑梗死灶周围后能存活12周以上,并可以分化为成熟的神经细胞,这可能与动物运动功能的改善有关。该结果提示由移植物分化的神经细胞可能对受损宿主细胞发挥了替代作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经干细胞

为了观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经干细胞(NSCs)的能力,本研究通过贴壁法培养大鼠BMSCs,体外培养扩增纯化后,在细胞传代时用含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、N2、B27的DMEM/F12的培养液制成细胞悬液,并进行诱导,观察诱导后细胞的形态及生长情况,用免疫荧光检测形成的细胞球的巢蛋白(nestin)的表达情况;形成的细胞球在含10%血清的培养液中进一步分化。结果显示:BMSCs在含EGF、bFGF、N2、B27的培养液中,逐渐形成nestin表达阳性的细胞球,在含血清的培养液中能分化为神经元样细胞、星形胶质样细胞及少突胶质样细胞。本研究结果提示经纯化的BMSCs能分化为NSCs,并具有进一步分化的能力。     

EGF培养条件下NGF与BDNF对大鼠海马神经干细胞向神经元分化的差异

目的探讨在表皮生长因子(EGF)培养条件下,相同浓度神经生长因子(NGF)与脑源性神经生长因子(BDNF)对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化比例的差异。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、EGF、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单细胞克隆后行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1周,行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养液中所加营养因子的不同将单细胞克隆传代细胞分为5组培养:EGF组、NGF组、BDNF组、EGF+NGF组、EGF+BDNF组,此5组细胞培养1周,进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果:单细胞克隆培养后克隆球细胞表达Nestin,诱导分化1周,细胞表达NSE、GFAP;与EGF组、NGF组、BDNF组相比,EGF+NGF组和EGF+BDNF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+BDNF组细胞的比例最高。结论在EGF培养条件下,BDNF促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的能力高于NGF。     

髓鞘结合糖蛋白抑制神经干细胞向神经元分化和轴突生长

目的： 观察来源于胚胎大鼠海马神经细胞的特征;观察髓鞘结合糖蛋白(MAG)对神经干细胞的增殖、分化及神经元轴突生长的影响。方法: 从胚胎鼠的海马提取细胞进行体外培养,应用免疫荧光染色法检测神经干细胞(NSCs)标志蛋白nestin和doublecortin的表达。应用BrdU掺入法检测不同剂量的MAG-Fc对NSCs增殖的影响。免疫荧光染色法观察各种亚型神经细胞的比例并比较神经元样细胞的轴突长度。结果: 来自SD大鼠16 d 胚胎海马的细胞明显表现出神经干细胞的特征。神经干细胞分化7 d 后,对照组新生成的β-tubulin Ⅲ阳性细胞的比例为18.17%±2.79%,其轴突长度为(136.27±33.66)μm。MAG-Fc (200 μg/L)处理后,β-tubulin Ⅲ阳性细胞比例和轴突长度分别显著减少为10.05%±3.42% (P<0.01)和(84.87±24.94)μm(P<0.01)。增殖实验表明,不同浓度的MAG-Fc对神经干细胞的BrdU整合比率无明显影响(P>0.05)。结论: MAG-Fc对神经干细胞向神经元样细胞的分化及其轴突的生长均有抑制作用,但对神经干细胞的增殖无明显影响。     

质粒重编程诱导多潜能干细胞及定向分化神经干细胞

目的 　探讨游离质粒载体重编程诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)为非整合型诱导多潜能干细胞,并在体外定向分化为神经干细胞(neural stem cells, NSCs), 为神经干细胞移植治疗神经损伤提供稳定、安全的细胞来源。 方法　使用电转仪将质粒pEP4-EO2S-ET2K转入小鼠MEFs, 经诱导培养重编程为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs), iPSCs在不同诱导培养基中经2次悬浮及贴壁培养分化为NSCs,在体内及体外实验鉴定iPSCs多向分化潜能特性及NSCs特性。 结果　体内外实验显示iPSCs具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)相似的多向分化潜能, 且不整合外源性基因。iPSCs进一步分化的NSCs其相关标志基因表达与野生型NSCs相近,且较iPSCs显著增加,免疫荧光显示NSCs高表达NSC标志物 NESTIN及PAX6,在体外存活能分化为神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞。 结论　游离质粒能重编程诱导非整合型iPSCs, 并定向分化为神经干细胞及神经元, 是神经损伤修复的理想种子细胞。     

不同鼠龄生后大鼠海马神经干细胞的传代和分化

目的研究不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs)的传代增殖和分化情况。方法将生后SD大鼠分为3d、10d、20d 3组,应用胰酶消化法将海马组织制成单细胞悬液,用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、B27的无血清细胞培养技术进行体外培养,单克隆培养后通过Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞、神经元、星形胶质细胞;细胞传3代后,在各组培养基中加入终浓度为10%的血清诱导分化,1周后进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例,进行统计学分析。结果3组SD大鼠海马组织细胞,单克隆培养后表达Nestin,诱导分化后分别表达NSE和GFAP。生后3d大鼠神经干细胞在传1-6代时每代均快于生后10d和20d大鼠,传6代后,3组细胞传代时间间隔几近一致;生后3d组大鼠海马神经干细胞分化为神经元的比例较其它2组高(P<0.05)。结论生后3d大鼠神经干细胞增殖速度和分化为神经元的数量都高于10d和20d大鼠。