IL—3体外促进脐血造血细胞增殖分化的效应

采用连续２次Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ分离，初步纯化脐血造血细胞，将其单妆种于经γ射线预处理的成人骨髓基质细胞层上，加入适量ＩＬ－３，并设不加ＩＬ－３的对照组，持续培养６周，定期检测非粘附细胞和集落形成细胞。     

外源性IL-3 cDNA导入骨髓基质细胞及对造血的调控作用

目的 探索将外源性IL－3cDNA导入骨髓基质细胞的可能性。方法 将小鼠IL－3cDNA克隆到逆转录病毒载体（pLX－SN)上,然后将重组的IL－3cDNA用脂质体转染到包装细胞PA317上,G418筛选后得到抗性克隆,将含病毒的上清液转染骨髓基质细胞。用自行设计的引物,检测p LXSN上的NeoR基因及转入的IL－3基因。同时观察了转染pLXSN/IL-3的基质细胞培养上清液对小鼠骨髓CFU－GM形成的影响,并测定其对造血因子依赖株NFS－60细胞增殖活性的影响。结果 将重组子pLXSN－IL－3和空载体pLXSN的病毒培养上清感染BMS,前者用PCR扩增出500bp和170bp（NeoR）的条带,后者仅扩增出170bp。转染pLXSN／IL－3的基质细胞上清液有促进小鼠骨髓CFU－GM增殖的作用,与空载体组及未转染组比较,有非常显著性差异（P＜0．01）。结论 外源性的IL－3基因及pLXSN上的NeoR已整合到骨髓基质细胞基因组DNA中,并促进造血细胞增殖。     

rhIL—1α对小鼠骨髓细胞长周期培养中造血细胞增殖的影响

应用小鼠骨髓细胞长周期培养（ＬＴＢＭＣ）体系，观察重组人白细胞介素－１α（ｒｈＩＬ－１α）对造血细胞增殖的影响。结果显示，经ｒｈＩＬ－１α作用后，小鼠ＬＴＢＭＣ中悬浮细胞数增多，其中粒单系祖细胞（ＣＦＵ－ＧＭ）数量也明显增加，维持时间延长。表明ｒｈＩＬ－１α能促进小鼠造血细胞在体外ＬＴＢＭＣ中增殖并分化，而且与剂量有关系。ｒｈＩＬ－１α加入的时间，以骨髓细胞２次接种时同时加入为好，延迟加入则作用减     

造血生长因子对长期培养中骨髓造血细胞增殖和分化的影响

应用骨髓长期培养法研究了ＨＧＦｓ联合应用对ＬＴＢＭＣ中造血干／祖细胞的增殖、分化的影响，结果显示，在ＬＴＢＭＣ中，含有ＨＧＦｓ（ＩＬ－２＋ＩＬ－６＋Ｇ－ＣＳＦ＋ＧＭ－ＣＳＦ＋Ｅｐｏ）的扩增组与对照组相比，ＨＧＦｓ能显著地扩增ＨＳＣｓ，在第一周，ＣＦＵ－ＧＭ，ＣＦＵ－Ｅ和ＢＦＵ－Ｅ总数分别扩增１８．０９－１６．５９倍、１０．２６－８．４８和１４．９９－１２．７８倍，而累积扩增倍数分别达３６．１９－６     

骨髓基质细胞上清对脐血造血细胞体外增殖的作用

目的:探讨骨髓基质细胞培养上清(SN)对人脐血造血细胞体外扩增的作用.方法:使用rIL-3,rIL-1β.rIL-6和SCF等细胞因子或SN或者两者联用长期培养人脐血造血细胞,进行细胞增殖和造血祖细胞集落测定.结果:脐血造血细胞培养至2周时,细胞总数在细胞因子组增加了134.5倍和SN组增加8.15倍,两者联用增加了171.3倍.培养至第6周时,细胞增加减少,以SN组最明显,为培养前的26.65倍,细胞因子组为54.15倍,两者联用仍有92.25倍.对脐血造血祖细胞增殖的影响,在扩增2周后,CFU产率细胞因子组和SN组比扩增前增殖了250%和217%,两者联用为279%.扩增至第3周,CFU产率下降,以前两组最明显,比扩增前分别增殖151%和145%,两者联用仍增殖了240%.结论:骨髓基质细胞培养上清可促进脐血造血细胞的增殖,但比细胞因子作用弱,两者联用时作用明显强于两者分别使用,提示骨髓基质细胞还可产生其它物质刺激造血细胞增殖并延长培养时间.     

IL-11基因修饰的基质细胞对造血细胞体外扩增的影响

目的　研究造血因子白介素 11(IL 11)基因修饰的基质细胞对造血细胞体外扩增的影响。方法　采用逆转录病毒载体将IL 11基因转入基质细胞HFCL ,用Northernblot检测基质细胞HFCLIL 11基因的表达 ,用流式细胞仪检测IL 11基因修饰的HFCL支持的脐血CD3 4 + 造血细胞体外扩增中表型为CD3 4 + CD3 8- 早期祖细胞和表型为CD3 4 + CD41+ 巨核系定向祖细胞的比例。结果　基质细胞HFCL能够表达逆转录病毒介导的IL 11基因 ,并且在这种IL 11基因修饰的基质细胞支持下 ,脐血CD3 4 + 造血细胞经过7d扩增 ,扩增细胞中表型为CD3 4 + CD3 8- 的早期祖细胞和表型为CD3 4 + CD41+ 巨核系祖细胞的比例分别为 (1.62± 0 .2 3 ) %、(9.9±1.1) % ,高于未转基因HFCL的 (0 .8± 0 .2 3 ) %、(6.5± 1.8) % ,而在相同条件下细胞因子支持的扩增细胞中则分别为 (0 .19±0 .14 ) %、(6.0± 1.1) %。结论　基质细胞能够表达经逆转录病毒载体介导的IL 11基因 ,而且经IL 11基因修饰的基质细胞能显著促进CD3 4 + CD3 8- 的早期祖细胞和CD3 4 + CD41+ 巨核系祖细胞扩增。     

rhIL－1α对小鼠骨髓细胞长周期培养中造血细胞增殖的影响

应用小鼠骨髓细胞长周期培养（ＬＴＢＭＣ）体系，观察重组人白细胞介素－１α（ｒｈＩＬ－１α）对造血细胞增殖的影响。结果显示，经ｒｈｌＬ－１α作用后，小鼠ＬＴＢＭＣ中悬浮细胞数增多，其中粒单系祖细胞（ＣＦＵ－ＧＭ）数量也明显增加，维持时间延长。表明ｒｈＩＬ－１α能促进小鼠造血细胞在体外ＬＴＢＭＣ中增殖并分化，而且与剂量有关系。ｒｈＩＬ－１α加入的时间，以骨髓细胞２次接种时同时加入为好，延迟加入则作用减弱。本实验对骨髓干、祖细胞体外扩增和自体骨髓移植等方面的研究有一定意义。     

骨髓基质细胞体外培养及成骨特性研究

目的 建立兔骨髓基质细胞(BMSC)向成骨细胞转化的体外培养方法，并观察其体外的成骨特性。方法 利用静置贴壁原理进行BMSC的体外培养，汇合后传代，部分细胞改用条件培养液继续培养。对培养的细胞进行形态学观察和组织学检测，并观察条件培养液对BMSC的功能影响。结果 条件培养液组细胞碱性磷酸酶(ALP)染色阳性，细胞重叠生长形成多层结构，伴有散在的矿化结节形成。条件培养液组细胞ALP染色率及活性较完全培养液组高，但增殖率相对降低。结论 培养的BMSC经诱导具有体外成骨能力。地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C可促使BMSC转化为成骨细胞，但抑制BMSC的增殖速度。     

脐血细胞成份及造血干/祖细胞的定量研究

目的:探讨脐全血细胞组成特点,对脐血造血干／祖细胞进行定量测定。方法:采用自动血细胞分析仪检测血细胞成份,以流式细胞术为基础.应用双荧光标记单克隆抗体方法,测定造血于／祖细胞的含量。结果:脐血组成细胞的大多数检测指标高于成人外用血。CD34＋细胞占1.14±1.12％;CD34＋CD38-细胞占CD34＋细胞的16％。结论:脐血具有丰富的血细胞及造血于／祖细胞,有造血重建的临床应用潜能。     

兔骨髓基质细胞的体外培养

目的 :比较用全骨髓法和离心法培养兔原代骨髓基质细胞 (BMSC)的差异 ,同时观察BMSC在体外培养时的生长特征及体外诱导为成骨细胞的可能性。方法 :抽取新西兰大白兔骨髓 ,分别用全骨髓法和密度梯度离心法进行原代培养 ,比较第 12d收获细胞的数量。传代后观察 1～ 6代细胞的生长特征 ,绘制生长曲线 ,测定分裂指数和贴壁率 ;同时将部分第 3代细胞进行诱导培养 ,第 16d计算碱性磷酸酶 (ALP)阳性细胞率。结果 :全骨髓法较离心法收获细胞数量少 (P <0 .0 5 ) ,1～ 6代细胞的生长特征相似 ,增殖能力强。第 3代细胞被成功地诱导为成骨细胞 ,第 16dALP阳性细胞率为 80 %。结论 :离心法较全骨髓法培养BMSC可得到较多的细胞 ,两种方法得到的细胞前 6代细胞均有较强的增殖能力 ,并可以诱导为成骨细胞 ,可作为骨组织工程用的种子细胞     

脐血造血干细胞分离方法的比较

目的：探讨分离脐血造血干细胞的最佳方法。方法：采用Ｆｉｃｏｌ分层法、３％明胶自然沉降法及６％羟乙基淀粉自然沉降法。结果：３％明胶自然沉降法所获有核细胞（ＮＣ）密度高达９４．６０（±２３．８０）×１０５／ｍｌ,ＣＦＵＧＭ数为６４．３０（±１２．１８）／１０５ＮＣ,ＣＤ３４＋细胞数为１．２１（±０．３７）×１０５／ｍｌ,均较其它两种方法为高（Ｐ＜０．０５）。结论：３％明胶自然沉降法是一种较理想的分离脐血造血干细胞的方法。     

SCF和IL—3对脐血造血细胞长期液体培养的影响

考察了干细胞因子（ＳＣＦ）和白介素３（ＩＬ－３）的不同浓度（５～１００ｍｇ／Ｌ）组合对不同接种密度（分别为３×１０５、６×１０５、１０×１０５ｃｅｌｓ／ｍＬ）的脐血（ＣＢ）细胞扩增和分化的影响。在５种组合下,ＣＦＵ－ＧＭ的扩增倍数都是在ＣＢ单个核细胞培养１２ｄ后达到最高（（１６．４３±２．０８）～（３７．０２±４．６９）,平均为（２５．７５±３．２６））,各组合之间相差较小;而细胞总数的扩增倍数在培养２４ｄ后达到最高（（１４．３８±２．７２）～（３５５．２６±３５．５３）倍,平均为（１０３．４５±３８．７５））,各组合之间相差很大。结果表明,在静态细胞培养过程中细胞密度较高,不利于ＣＦＵ－ＧＭ和总细胞的扩增,如保持在较低细胞密度有利于总细胞数的扩增;细胞因子的浓度对ＣＦＵ－ＧＭ的峰值影响不大,但低浓度能使总细胞数的扩增明显减少。     

骨髓基质细胞体外诱导分化为内皮细胞的超微结构研究

目的采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导骨髓基质细胞(BMSC)的方法,探讨BMSC向内皮细胞分化的可行性。方法在无菌条件下采集SD大鼠(雄性,体质量150~160g,10只)的长骨骨髓,获得骨髓细胞。实验组细胞以高质量浓度rhGM-CSF(400μg/L)为诱导剂,进行体外诱导分化;对照组培养基为常规1640培养液。培养至第8天,收集细胞后分别应用扫描电镜和透射电镜观察实验组分化后细胞的超微结构,并对分化后的细胞进行内皮细胞的鉴定。结果实验组细胞在透射电镜下可见内皮细胞结构特征及特征性的W-P小体结构,扫描电镜下可见细胞呈多边形,细胞膜表面有大量的细长丝状伪足及短小的微绒毛,符合内皮细胞的特点。结论BMSC在高浓度的rhGM-CSF诱导作用下分化的细胞具有内皮细胞的形态学特征。     

阿托伐他汀对骨髓基质细胞增殖及向成骨细胞分化的影响

目的比较不同浓度的阿托伐他汀对小鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化、矿化成骨的影响。方法分别将10^-8、10^-7、10^-6mol／L的阿托伐他汀和空白药物加入传代培养的小鼠骨髓基质细胞，通过细胞形态学观察、细胞增殖率检测、碱性磷酸酶（ALP）检测和钙结节染色，比较药物在成骨细胞分化过程中对细胞增殖和分化的影响。结果阿托伐他汀可以剂量依赖性方式抑制骨髓基质细胞的增殖，10^-7mol／L组和10^-6mol／L组较明显（均P〈0．05）。阿托伐他汀可以提高骨髓基质细胞ALP活性，培养10～22d，10^-7mol／L组和10^-6mol／L组ALP活性高于对照组和10^-8mol／L组（均P〈0．05）。矿化成骨染色显示在培养26d后，10^-6mol／L组染色明显深于其它各组。结论阿托伐他汀可促进骨髓基质细胞来源的成骨细胞的分化，抑制了细胞增殖，促进骨结节钙化。     

体外培养及成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞生长的影响

目的　研究体外培养及成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞生长的影响。方法　抽取兔骨髓基质细胞体外培养 ,倒置显微镜动态观察 ,从原代培养 (P0 )中观察到细胞集落的形态有明显差异 ,提示骨髓基质细胞是一个由多种细胞组成的混合体。在培养液中加入碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF ,5ng/ml)。 结果　第一代细胞(P1)的生长速度增至对照组的 1.5倍。而未经bFGF处理的细胞活跃增殖能力只能保持 4～ 5代 ,随后即发生退化 ;而经bFGF处理的细胞 ,传 10代以上仍能保持活跃的增殖能力。结论　bFGF能促进骨髓基质细胞增殖并长期保持其生物活性。     

不同血型脐血造血祖细胞混含培养的研究

采用单层琼脂法对脐血造血祖细胞培养进行了研究。结果：２０份新生儿脐血粒单祖细胞集落（ＣＦＵ－ＧＭ）为９５．６±３６．５／１０￣６ＭＮＣ；两份不同血型的新生儿脐血细胞混合培养与单个新生儿脐血细胞培养比较，两者在祖细胞生成数量和生长特征方面无明显差别。本研究为临床混合不同血型的脐血造血祖细胞移植提供了一定的理论依据。     

碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞增殖与成骨活性的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对骨髓基质细胞的增殖及成骨活性的影响。方法：传代骨髓基质细胞的培养中加入不同浓度的bFGF，行细胞增殖和蛋白含量测定以及碱性磷酸酶的活性检测与钙结节的形成观察。结果：bFGF浓度在0～10ng／ml，蛋白含量及细胞数量随浓度的增高而增多，10ng／ml达到最大，浓度为100ng／ml反有下降。各组ALP活性没有降低，Von Kossa染色均为阳性。结论：bFGF可促进骨髓基质细胞的增殖，并保持骨髓基质细胞成骨的特性。