精原干细胞去分化和多能性的研究进展

精原干细胞是具有终身有丝分裂能力进行自我复制同时也可分化成单倍体精子的生殖细胞。最近,一些研究发现精原干细胞可在体外被诱导成多能干细胞。提示精原干细胞可成为再生医学所需多能干细胞的很好来源,尤其是获得没有免疫排斥、患者自身来源的多能干细胞。本综述将重点介绍目前对精原干细胞多能性的认识及其在再生医学中应用的优势。     

梗阻性和非梗阻性无精子症患者低温保存的睾丸精子的质量

睾丸精子提取术获得的精子，采用卵细胞浆内注射进行体外受精，常用于治疗不育症。７３例梗阻性无精症和４２例非梗阻性无精症患者，在诊断性活检的时候，同时进行睾丸精子提取，所有的梗阻性无精症患者和１５例非梗阻性无精症患者提取的精子低温保存。冰冻前测量精子的数量、活动能力、形态和成活率，解冻后复查精子的成活率和活动能力。１７对夫妻共进行了２０个循环的卵细胞浆内注射体外受精，分别测定梗阻性和非梗阻性无精症患者的受精率、细胞分裂率和妊娠率。睾丸活检时发现，与梗阻性无精症相比，非梗阻性无精症精子的数量和形态都比…     

弱精子症患者精核蛋白表达的检测及意义

目的研究不育症患者精核蛋白mRNA表达量的变化及意义。方法提取6例不育症患者及5例健康男性精子的总RNA,应用RT-PCR法扩增得到精核蛋白cDNA片段;提取精子总碱性核蛋白并进行SDS-聚丙酰胺凝胶电泳,检测其中精核蛋白及组蛋白的含量。结果精子中存在精核蛋白基因的mRNA;不育症患者精核蛋白的含量及精核蛋白mRNA相对含量均下降。结论精核蛋白mRNA相对含量的变化与其蛋白含量的变化一致,可能反映了精子发生过程中某些基因的表达情况。     

蛋白酶体REGγ对雄性小鼠生精功能的影响

目的研究蛋白酶体REGγ对雄性小鼠生精功能的影响。方法利用免疫蛋白印迹检测小鼠睾丸中REGγ的表达;通过组合酶消化法分离精原干细胞,流式细胞仪检测精原干细胞中c-kit及α6-integrin的表达;通过小鼠精子分析仪检测REGγ基因敲除雄鼠的精子浓度和精子活力;进行小鼠合笼实验检测正常雌鼠和REGγ基因敲除雄鼠合笼后的生育力。结果 REGγ在小鼠睾丸中高表达;应用组合酶消化法得到了纯度70%的精原干细胞;REGγ基因敲除雄鼠精原干细胞的c-kit及α6-integrin表达量均显著低于野生型组(P0.05);REGγ基因敲除型雄鼠的平均精子浓度(37.1×106/ml)和精子活力(54%)均显著低于野生型雄鼠(75.4×106/ml、74%)(P0.05);REGγ基因敲除型雄鼠与野生型雌鼠合笼后的产仔数均低于野生型雄鼠(P0.05)。结论蛋白酶体REGγ参与调节雄鼠的生精功能。     

精子发生相关基因VASA在正常和少精子症患者精子中的表达及意义

目的探讨生殖细胞高度特异性基因VASA和信号分子BMP-4在精子发生中的作用和相关机制。方法正常和少精子症患者精液通过Percoll梯度分离获得精子和未成熟生精细胞,采用RT-PCR、real-time PCR、Western Blot和免疫荧光方法分析基因转录产物表达。结果少精子症精子VASA基因转录产物是正常精子的1/5；两种样本精子中均检测到荧光信号,正常组信号强,与Western blot结果相一致；两种样本精子RT-PCR均未检测到BMP-4及其Ⅰ型受体Alk-3表达,但在分离的未成熟生精细胞中均表达。人正常睾丸组织可检测到BMP- 4及其Alk-3表达。结论少精子症患者精子发生过程中VASA基因及其产物发生变化；BMP-4及其受体Alk- 3并不直接上调VASA表达；睾丸组织包括精子所存在的部分转录产物,而精子转录产物并不完全等同于睾丸组织；睾丸组织内表达BMP-4和Alk-3的可能主要是精原和精母细胞。     

不同生精功能和取精方式对无精子症ICSI妊娠结局的影响

目的 分析采用经皮附睾精子抽吸术(PESA)或经皮睾丸精子抽吸术(TESA)获得精子对不同生精功能无精子症进行卵泡浆内单精子注射(ICSI)治疗的妊娠结局.方法 经PESA获得附睾精子,经TESA获得睾丸精子,女方进行常规超排卵.两种取精方法获得的精子进行ICSI,比较其妊娠率.结果 216次采用PESA获得附睾精子,87次采用TESA获得睾丸精子,PESA和TESA组的妊娠率分别为41.7%和43.7%,(P>0.05).随着生精功能状态从正常到重度生精功能障碍的变化,其妊娠率依次为:46.8%,41.6%,36.7%和16.7%.其中生精功能正常组与轻度和中度生精功能障碍组差异无统计学意义,但与重度生精功能障碍组差异均有统计学意义.结论 采用PESA或TESA结合ICSI是治疗男性无精子症的有效方法,而且认为生精功能正常组和轻度及中度生精功能障碍三组无精子症患者均可试行ICSI.     

尿毒症患者精子参数变化和睾丸活检病理学研究

目的 探讨男性尿毒症患者精子主要参数的变化和睾丸组织结构病理改变。方法 对8例尿毒症患者的精液检测的同时进行睾丸活检,并进行分析。结果 尿毒症患者的精子活动力(a+b)、存活率和精子密度平均分别为12.2%、30.6%和31.2×106/ml;睾丸活检病变主要表现为生精上皮脱落、管腔阻塞、界膜结缔组织增生、间质水肿等。结论 尿毒症患者精子主要参数(活动力、存活率、密度)均显著降低,睾丸病理改变主要特征为生精功能低下和生精阻滞。     

唯支持细胞综合征患者的睾丸病理和性激素分析

目的 分析唯支持细胞综合征不育患者曲细精管的不同病理改变及其血清性激素水平,探讨是否可以为睾丸活检取精子或生精细胞提供参考。方法 测定107例唯支持细胞综合征患者的睾丸容积和血清性激素水平,做睾丸活组织检查,按活检结果分为完全无生精细胞与有生精细胞两组,并比较两组间差异有无显著性意义。结果 96例唯支持细胞综合征患者完全无生精细胞,11例患者有生精细胞或精子,完全无生精细胞患者与有生精细胞患者睾丸容积及性激素水平无差异(P>0.05)。结论 唯支持细胞综合征不育患者少数有精子或生精细胞发生,但缺乏明确的性激素指标反映曲细精管是否有精子或生精细胞存在。     

精原干细胞移植现状和应用前景

精原干细胞是雄性生殖干细胞,它的自我增殖能力为男性生殖细胞永久产生所必需。随着体外培养、冷冻保存、卵细胞胞质内单精子注射(ICSI)技术的发展,精原干细胞移植技术在医学基础研究和临床应用方面越来越显示出重要的应用前景。本文对精原干细胞的起源、分化、移植现状和移植技术在医学领域的应用前景进行综述。     

生精片对男性少弱精子症患者精液参数的影响及作用机制研究

目的:观察生精片治疗男性少弱精子症患者的临床有效性,并对其作用机制进行探讨。方法:选取少弱精子症患者120例,采取随机对照研究的方法,治疗组口服生精片,对照组服用维生素E,服用12周后,观察治疗前后两组精子浓度、精子活力及正常形态精子百分率,血清FSH、T、LH水平,DNA碎片指数,低渗肿胀精子百分率,精浆弹性蛋白酶、α-葡糖苷酶、精子顶体酶、果糖及精浆锌等指标变化。结果:生精片能显著改善精子浓度、活力和形态(P<0.01),血清FSH水平明显降低,T明显升高(P<0.01),DNA碎片指数明显降低,低渗肿胀精子百分率显著升高,弹性蛋白酶明显降低,α-葡糖苷酶、精子顶体酶、果糖、精浆锌等水平明显升高。结论:生精片通过多层次、多环节、多途径改善少弱精子症患者的精液参数,具有良好的临床疗效。     

睾酮对体外培养小鼠精原干细胞增殖与分化的影响

目的：探讨睾酮对体外培养小鼠精原干细胞增殖与分化的影响。方法：采用Percoll密度梯度分离及差速贴壁法纯化精原干细胞,用免疫荧光染色及流式细胞检测对小鼠精原干细胞进行鉴定。设置实验组和对照组,两组均以支持细胞作为饲养层培养精原干细胞,在实验组DMEM／F12完全培养液中添加睾酮。用酶联仪检测细胞的生长情况;用流式细胞仪对细胞生长周期进行判断;采用ICSI技术让精子细胞与卵母细胞结合,观察卵裂细胞数,体外培养3天后进行染色体形态与数量分析。结果：在添加睾酮的培养基中培养的精原干细胞,其OD值增长较快（P〈0．05）;精原干细胞DNA合成期（S期）的含量增多（P〈0．05）;精子细胞与卵子结合以后可得到二倍体配子。结论：睾酮能促进精原干细胞的体外增殖与分化。     

精原细胞体外培养的研究进展

精原细胞包括未分化型精原细胞和分化型精原细胞。通过体外培养精原细胞,重现精子发生过程,在发育生物学、生命起源和生育控制等领域具有重要意义;通过精原干细胞的体外培养,利用其多能性,诱导其产生多种组织类型的细胞,将是再生医学研究领域的热点,本文拟就精原细胞体外培养的影响因素作一综述,旨在为精原细胞体外培养体系的建立提供借鉴。     

胶质细胞源性神经营养因子对体外培养小鼠精原干细胞增殖分化作用的影响

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对体外培养小鼠精原干细胞(SSC)增殖与分化的影响.方法 雄性昆明小鼠80只.采用Percoll密度梯度分离及差速贴壁法纯化SSC,免疫荧光染色及流式细胞检测方法鉴定.将获取的SSC随机分为实验组和对照组,以支持细胞作为饲养层培养SSC,实验组每5 ml DMEM/F12完全培养液中添加0.02 μg GDNF.酶联仪检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞生长周期;采用卵泡浆内显微注射(ICSI)技术将精子细胞与卵母细胞结合,观察卵裂细胞数,体外培养3 d后行染色体数量分析.结果 添加GDNF培养的SSC第6、9、12、15天吸光度(A)值分别为0.448±0.028、0.502±0.062、0.556±0.045、0.621±0.072,与对照组0.377±0.053、0.402±0.071、0.432±0.019、0.461±0.037比较差异有统计学意义(P＜0.05);第3、6、9、12、15天SSC DNA合成期(S期)含量分别为20.86、26.34、31.23、37.54、28.02,与对照组1.69、1.73、2.56,4.85,1.82比较差异均有统计学意义(P＜0.05);精子细胞与卵母细胞结合后可得到含有20对染色体的配子.结论 ICSI技术可为鉴定SSC体外分化为精子细胞提供较充分的依据;GDNF能促进SSC的体外增殖与分化.     

Stemness of spermatogonial stem cells encapsulated in alginate hydrogel during cryopreservation

This study investigated the effect of spermatogonial stem cell encapsulated in alginate hydrogel during cryopreservation, as cells were protected against damage during cryopreservation within the hydrogel. Spermatogonial stem cells were isolated from the testes of Balb/c mice pups (6 days old), purified in laminin‐coated dishes and CD90.1 microbeads, encapsulated in alginate hydrogel and then cryopreserved. After thawing, cell viability and Spermatogonial stem cell (SSC) colony diameter were evaluated. After RNA was isolated and cDNA was synthesised, the expression of stemness genes was considered using RT real‐time PCR. Finally, spermatogonial stem cells labelled with BrdU were transplanted to busulfan azoospermic mouse models. Lin28a and Sall4 genes were significantly upregulated after cryopreservation in alginate hydrogel. However, cell viability was significantly decreased. The diameter of colonies consisting of spermatogonial stem cells freeze‐thawed in alginate microbeads showed no significant difference with fresh spermatogonial stem cells and the control group. The injection of freeze‐thawed spermatogonial stem cells encapsulated in alginate hydrogel resulted in spermatogenesis recovery. Alginate mimics the extracellular matrices (ECM) for spermatogonial stem cells; therefore, it can support stemness potential during the cell cryopreservation process and restart spermatogenesis after transplantation.     

Enrichment and transplantation of spermatogonial stem cells

Spermatogenesis is a complex, highly organized process originated from stem cell spermatogonia. Because there are very few stem cells and they can only be defined by their function, the identification and isolation of these cells has been very difficult. By using a spermatogonial transplantation assay system, we have identified α₆-and β₁-integrin expression on stem cells, and cells isolated with these antigens were significantly enriched in stem cells. This is the first demonstration of spermatogonial stem cell-associated antigens. Analysis of two infertile mouse models, Steel/Steel^Dickie (Sl/Sl^d) and experimental cryptorchidism, showed that the number of stem cells is reduced in Sl/Sl^d testis. Whereas cryptorchid testes are greatly enriched for stem cells, and one in 200 cells is a stem cell. These techniques will provide an important starting point for further purification and characterization of spermatogonial stem cells.     

Renal differentiation from adult spermatogonial stem cells

Abstract

There is considerable interest in the use of multi-potent stem cells in kidney tissue regeneration. We studied if spermatogonial stem cells have the ability to undergo kidney differentiation. Spermatogonial stem cell differentiation was induced using in vitro and ex vivo co-culture techniques. Conditioned media from human kidney fibroblasts induced the expression of epithelial and endothelial lineages in spermatogonial stem cells, consistent with nephrogenesis. Furthermore, we showed that these cells up-regulated renal tubular-specific markers alkaline phosphatase, mineralocorticoid receptor, renal epithelial sodium channel and sodium-glucose transporter-2 (p?<?0.05). GFP-labeled spermatogonial stem cells were engrafted into metanephric kidney organ cultures harvested from E12.5 mouse embryos. After 5 days of organ culture, focal anti-GFP staining was detectable in all inoculated kidneys demonstrating integration of spermatogonial stem cells into the developing kidney (p?<?0.01). Histological assessment showed early nephron-like architecture. In summary, we show that spermatogonial stem cells have the potential to generate renal tissue and lay the foundations for further investigations into a novel therapeutic approach for renal insufficiency.     

移植大鼠生精干细胞到裸鼠生精小管实验系统的建立

目的 建立移植大鼠生精干细胞到裸鼠生精小管的实验系统.方法 采用一次腹腔注射busulfan 30mg/kg以消除裸鼠生精小管内源性生精细胞,制备生精干细胞移植受体小鼠;采用laminin粘附的方法分离大鼠生精干细胞;应用生精小管直接注射和输出管注射的方法移植分离到的大鼠生精干细胞进入受体裸鼠的生精小管内.结果 busulfan腹腔注射4周后受体裸鼠生精小管中的精子发生明显得到抑制.大鼠生精干细胞移植2～3个月后在受体裸鼠的生精小管中发现了大鼠的长型精子细胞.结论 成功建立了移植大鼠生精干细胞到受体裸鼠生精小管的试验系统.     

精原干细胞龛境研究进展

精原干细胞是一群能够自我更新并具有多向分化潜能的永生细胞。"干细胞龛"理论最初是在造血系统中提出来的,龛同样也存在于睾丸组织中。精原干细胞龛在睾丸中是半开放的隔离体系,具有特定的数量调控及随年龄变化的特征。两种内源性因子nanos2和Plzf调控精原干细胞自我更新。龛细胞分泌因子胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)也调节精原细胞的更新。     

小鼠精原干细胞分选

目的:寻求富集小鼠精原干细胞的有效方法。方法:取6周龄雄性昆明白小鼠20只,手术制作成双侧隐睾模型,继续饲养2~3个月后,切取睾丸,用酶两步消化法制成单细胞悬液,加入FITC标记的抗α6-integrin抗体和PE标记的抗c-k it抗体冰浴20 m in后,利用流式细胞仪筛选出具有side scatterlo、α6-integrin+、c-k it-特征的细胞,苔盼兰染色监测细胞活性。另取20只小鼠作为对照组,相同条件下饲养相同时间。结果:隐睾小鼠筛选出的精原干细胞占睾丸细胞总数的2.8%,95%以上的细胞具有活性。结论:利用免疫荧光激活细胞分选术能分离出大量有活性的精原干细胞。