碱性成纤维细胞生长因子对犬隐静脉间质细胞体外培养抗钙化作用

目的观察作为组织工程瓣间质种子细胞的犬隐静脉间质细胞体外培养钙化机制,探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对犬隐静脉间质细胞体外培养钙化的抑制作用。方法分离培养犬隐静脉间质细胞,分为正常培养对照、促钙化培养和bFGF培养3组。2周后行von kossa染色,检测细胞层钙沉积、碱性磷酸酶(ALP)活性及上清液中骨钙素(OC)含量,细胞ALP、OC mR- NA表达。结果培养2周后,促钙化组及对照组均有细胞结节形成,bFGF组细胞呈极性密集生长,无结节形成。von kossa染色促钙化组呈强阳性,bFGF组及对照组呈弱阳性。促钙化组钙沉积及ALP活性比对照组均明显增高(5．384±0．443比2．198±0.173,P＜0.01),ALP高2．13倍(9．611±0．639比4.819±0．334,P＜0．01),bFGF使两者均显著降低(0．192±0．024比5．384±0.443,P＜0．01,3．069±0．178比9．611±0．639,P＜0．01)。促钙化组上清液OC含量于第6天始升高,至第12天到达高峰,然后有轻度下降。bFGF组及对照组均维持较低水平。结论体外培养的犬隐静脉间质细胞在促钙化条件下具有成骨细胞的表型,有明显的钙化现象发生,bFGF具有抑制其钙化的作用。     

人骨髓基质干细胞与支架材料纳米羟基磷灰石／聚酰胺66的生物相容性研究北大核心CSCD

目的研究人骨髓基质干细胞（hBMSCs）与纳米羟基磷灰石／聚酰胺66（nHA／PA66）复合后的生物学特性。方法体外分离培养hBMSCs后将其分为A、B、C3组：A组为未经骨向诱导的hBMSCs,B组为经骨向诱导的hBMSCs,C组为与nHA／PA66复合并骨向诱导的hBMSCs。通过噻唑蓝（MTT）检测B、c组细胞在第1、2、3周的增殖情况;电镜扫描观察C组细胞在支架上的黏附情况;碱性磷酸酶（ALP）活性检测以及矿化结节染色验证hBMSCs的体外成骨分化能力,并通过检测第6、12天ALP的活性研究其与nHA／PA66复合后的骨生成作用。结果c组细胞在nHA／PA66上黏附良好;B组与C组细胞生长增殖活性差异无统计学意义（P〉0．05）,说明骨向诱导后的hBMSCs增殖活性不受支架材料nHA／PA66影响;B组矿化结节数量明显多于A组,第6、12天A组ALP活性值均低于B、c组,差异有统计学意义（P〈0．05）,而B、c组问差异无统计学意义（P〉0．05）,说明hBMSCs体外骨向诱导后ALP表达增强并骨向分化,nHA／PA66并没有影响hBMSCs的成骨潜能。B、c组细胞在第12天的ALP活性值显著高于第6天,差异均有统计学意义（P〈0．05）,说明AKP活性随骨向诱导时间增长而逐渐增强。结论hBMSCs适于在nHA／PA66上黏附、增殖与骨向分化,nHA／PA66可以作为hBMSCs的载体应用于骨组织工程。     

富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖及成骨活性的作用

目的　观察富血小板血浆 (platelet- rich plasma,PRP)在体外培养骨髓间充质干细胞 (marrowmesenchymal stem cells,MSCs)的增殖及成骨作用 ,探讨 PRP促进骨修复的细胞和分子机制。　方法　体外培养人MSCs,分为实验组 (n=9)与对照组 (n=9) ,实验组进行 PRP干预 (10μl/ ml培养液 )。于不同时间点收集两组细胞 ,以流式细胞仪检测 S期比例 ,MTT法检测细胞增殖活性 ,碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,AL P)测定和四环素荧光法检测细胞成骨活性 ,逆转录 PCR检测成骨启动基因 cbfa1的表达。　结果　 PRP作用于 MSCs,可刺激细胞增殖 ,流式细胞仪检测 PRP加入后 2 4 h S期比例由对照组 7.2± 0 .5至 14 .5± 0 .4具有统计学意义 (P<0 .0 1) ,MTT法显示 PRP作用后细胞增殖加速 ,第 4天达到平台期。而 AL P活性在作用后 3、6和 9d达到 7.79± 1.98、9.5 1± 2 .31和 14 .0 3± 3.0 2 ,与对照组 2 .0 6± 0 .77、2 .84± 0 .82和 2 .5 8± 0 .84组间比较差异有统计学意义 (P<0 .0 5 )。矿化结节形成增多 ,逆转录 PCR显示 cbfa1的表达在 PRP加入 2、4和 8h逐渐加强。　结论　 PRP对骨修复的促进作用与其促进 MSCs增殖、加强成骨启动基因的表达、增强成骨活性的作用有关。     

多肽K237对PC-3M细胞增殖及bax、bcl-2 mRNA表达的影响

目的:研究多肽K237对体外培养的雄激素非依赖性前列腺癌PC-3M细胞的抑制作用,及其可能的作用机制。方法:将培养的PC-3M细胞分为4组:实验组(分别以50、100、200μmol/L的多肽K237处理48h)和对照组(K237浓度为0μmol/L),采用MTT法观察多肽K237对前列腺癌PC-3M细胞增殖的影响,用RT-PCR法检测bax、bcl-2mRNA表达的变化。结果:不同浓度的多肽K237处理48h后,PC-3M细胞形状变圆,体积变小,胞质透亮度下降,部分细胞脱落悬浮于培养液中。在50、100、200μmol/L的多肽K237作用48h后,MTT法检测的细胞生长抑制率分别为(12.6±0.95)%、(17.8±0.99)%、(27.2±1.12)%。RT-PCR结果显示:50、100、200μmol/L实验组和对照组的bax/β-actin值分别为0.919±0.071、0.971±0.083、0.992±0.102,(0.889±0.06),bcl-2/β-actin值分别为0.896±0.085、0.791±0.084、0.764±0.702,0.922±0.097,3组中上述两项指标均较对照组有明显变化(P均<0.01),其中,baxmRNA表达水平上调,而bcl-2mRNA表达水平下调,上述作用呈现剂量效应关系。结论:多肽K237可能通过影响bax、bcl-2mRNA的表达来诱导PC-3M细胞凋亡,从而抑制前列腺癌细胞的增殖。     

长春新碱对体外培养成骨细胞的影响

目的　观察抗癌药物长春新碱对体外培养成骨细胞的作用。方法　在新生SD大鼠头颅骨次代成骨细胞 (OB2 )培养液中分别加入不同浓度 (10 -1～ 10 -9g/L)长春新碱 ,分别观察OB2 的增殖功能 (用波长 5 70nm处OD值表示 )、分化功能 [用碱性磷酸酶 (ALP)活性表示 ]和矿化功能 (用矿化结节数 /视野表示 )。结果　OD值实验组为 0 0 91± 0 0 0 5～ 0 2 97± 0 0 44 ,对照组为 0 34 7± 0 0 35 ;ALP(U/g蛋白质 )活性实验组为 77± 12 ,对照组为 81± 4;矿化结节数 /视野 (个 )实验组为 1 0±0 816,对照组为 1 5± 1 0。结论　从绝对数来看 ,各浓度长春新碱对OB2 的增殖、分化和矿化功能均具抑制作用。与对照组比较 ,长春新碱对OB2 增殖功能的抑制作用具有极显著性意义 (P <0 0 1)。     

不同血清对成人骨髓基质干细胞成骨诱导分化的影响

[目的]探讨三种不同来源血清对体外培养成人骨髓基质干细胞(hBMSCs)向成骨诱导分化的作用.[方法]将体外第3代hBMSCs向成骨诱导分化培养,分为胎牛血清组(对照组)、AB 血清组和自体血清组.对比观察细胞碱性磷酸酶(ALP)染色、钙结节染色.诱导培养后4、7、14 d 和 21 d,各血清组分别进行钙黄绿素法荧光显微镜动态观察矿盐沉积,检测 ALP 活性,实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)法检测成骨基因(ALP)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的表达.[结果]ALP 染色和钙结节染色结果显示,与自体血清(AS)组、胎牛血清(FBS)组相比,AB 血清(ABS)组明显提高了 hBMSCs 的染色阳性率.荧光显微镜下观察诱导 21 d 的 hBMSCs,ABS 组较 FBS 组、AS 组呈现更多的钙盐沉积.ALP 活性结果显示,同一时间点 ABS 组的 ALP 活性均明显高于 FBS 组和 AS 组,差异有统计意义(P<0.05).RT-qPCR 结果显示,在7、14 d 和 21 d,ABS 组 ALP、OPN 和 OCN 成骨基因表达均明显高于 FBS 组、AS 组,其中,ALP 基因表达在 7 d 出现峰值,OPN 基因表达在 14 d 出现峰值,OCN 基因表达在 21 d 出现峰值,差异均有统计学意义(P<0.05).[结论]ABS 对 hBMSCs 成骨分化作用较 FBS、AS 明显增强.ABS 有望替代 FBS 建立符合骨组织工程临床应用要求的体外 hBMSCs 培养体系.     

成骨细胞特异性钙黏蛋白基因转染对人骨髓基质干细胞成骨分化影响的研究

目的 观测成骨细胞特异性钙黏蛋白(Cad-Ⅱ)基因转染对人骨髓基质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响. 方法把脂质体介导的Cad-Ⅱ cDNA转染体外分离培养的hBMSCs,检测Cad-Ⅱ蛋白表达变化,并对比观测转染组和单纯成骨诱导组在培养3,7、14、21 d时,hBMSCs碱性磷酸酶(ALP)和骨钙索的表达变化. 结果 转染组和成骨诱导组3 d后开始有ALP的阳性染色,呈棕黑色,7 d开始有骨钙索的阳性染色并随培养时间延长逐渐增多,但各时间点转染组ALP浓度(P=0.008)和骨钙素染色阳性数(P=0.023)均显著高于单纯成骨诱导组.转染组和成骨诱导组从14 d后开始有红色的刚件染色矿化结节出现,结节数目随时间推移而增多. 结论 Cad-Ⅱ基因转染可促进hBMSCs向成骨细胞的分化.     

骨折愈合刺激素对体外培养成骨细胞的影响

目的　观察骨折愈合刺激素对体外培养成骨细胞的作用。方法　在新生SD大鼠头颅骨次代成骨细胞 (OB2 )培养液中分别加入不同浓度 (2× 10 2 U/L～ 2× 10 4U/L)骨折愈合刺激素 ,观察OB2的增殖功能 (用波长 5 70nm处OD值表示 ) ,取药物敏感浓度 (2× 10 2 U/L)分别观察分化功能〔用碱性磷酸酶 (ALP)活性表示〕和矿化功能 (用矿化结节数量 /视野表示 )。结果　OB2 增殖功能 (OD值 )实验组为 0 336± 0 0 73～ 0 35 9± 0 0 5 1,对照组为 0 347± 0 0 35 ;OB2 分化功能〔ALP(U/g蛋白质 )活性〕实验组为 83± 9,对照组为 81± 4 ;OB2 矿化结节数量 /视野 (个 )实验组为 6 0± 1 82 6 ,对照组为1 5± 1 0。结论　骨折愈合刺激素各浓度对OB2 的增殖和分化功能均无明显作用 (P >0 0 5 ) ,而对其矿化功能具有明显的刺激作用 (P <0 0 1)。     

瘦素对hBMSCs成骨分化的作用及机制研究

目的 探讨瘦素(leptin,LEP)对hBMSCs成骨分化的作用及机制. 方法 采用全骨髓法培养hBMSCs,取第3代hBMSCs分为A、B、C、D、E、F组,待细胞贴壁后各组分别加入400、200、100、50 ng/mL LEP、100 ng/mL BMP和普通培养基2 mL进行培养.于培养后7 d行ALP染色、21 d行矿化结节染色,倒置相差显微镜观察染色结果 ;并于培养后7、14、21 d,检测各组ALP活性、骨钙素(osteocalcin,OCN)水平,筛选LEP的最佳诱导浓度;B、E、F组细胞培养7 d后,采用RT-PCR检测成骨相关基因:核心结合因子(core-binding factor α1,Cbfα1)、ALP、Col Ⅰ、OCN mRNA的表达. 结果 诱导培养7 d,ALP染色结果 显示,A、B、C、D、E组细胞胞浆均呈蓝色阳性着色,F组呈弱阳性;诱导培养21 d,矿化结节染色结果 显示,A、B、C、D、E组细胞染色呈阳性,F组呈阴性.B组培养后7、14、21 d,ALP、OCN活性低于E组,但显著高于其余各组,差异均有统计学意义(P<0.05),200 ng/mL LEP为最佳浓度.B、E、F组细胞培养7d,F组Cbfα1、ALP、Col Ⅰ、OCNmRNA均不表达;B、E组各产物mRNA均有表达,但B组低于E组. 结论 LEP可促进hBMSCs成骨分化,其机制可能为LEP促进了成骨相关基因的表达.     

内皮素A受体拮抗剂BQ123对前列腺癌PC-3M细胞增殖与凋亡的影响

目的:观察内皮素A受体拮抗剂BQ123对转移性前列腺癌(PCa)PC-3M细胞株增殖与凋亡的影响,初步探讨内皮素A受体拮抗剂对转移性PCa细胞的体外抗肿瘤效应。方法:实验分为两组,对照组为PC-3M细胞及含灭活小牛血清的F12/RMPI1640培养液;实验组为PC-3M细胞加入等量的1μmol/LBQ123。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、划痕损伤实验、细胞迁移实验观察BQ123对人PCaPC-3M细胞株增殖的抑制效应,利用Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术检测BQ123诱导PC-3M细胞凋亡的作用及其与细胞周期的关系。结果:MTT比色法结果显示BQ123随着作用时间的增加,对PC-3M的抑制率分别为24h22.32%、48h44.88%和72h64.47%,表现出良好的时效关系(P<0.05),划痕损伤实验结果提示:实验组PC-3M细胞的迁移距离分别为12h(103.42±75.63)μm、24h(243.75±121.53)μm和48h(422.07±36.01)μm,均低于对照组的12h(162.93±19.87)μm、24h(317.19±43.19)μm和48h(692.74±40.84)μm(P<0.05)。细胞迁移实验中实验组穿入下室的PC-3M细胞为(79.2±9.58)个,亦明显少于对照组的(92.6±5.94)个(P<0.05);Annexin V-FITC/PI双染色法的结果显示对照组PC-3M细胞凋亡率为(9.38±1.37)%,实验组PC-3M细胞凋亡率为(15.03±0.93)%,差异有统计学意义(P<0.05),细胞周期实验的结果显示实验组各期细胞比例与对照组相比差异不显著(P>0.05)。结论:BQ123对PCaPC-3M细胞株的生长、迁移和侵袭能力均有明显的抑制作用,且可以诱导PC-3M细胞凋亡,可为PCa治疗的研究提供一种新的思路。     

兔脂肪干细胞体外成骨诱导培养及成骨活性鉴定的实验研究

目的体外分离培养兔脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）,在成骨诱导条件下鉴定其成骨活性。方法取4月龄新西兰大白兔腹股沟区脂肪,Ⅰ型胶原酶消化,分离、培养及传代原细胞,将第3代ADSCs消化后,加入成骨培养液中诱导分化,分别行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、VonKoss（a钙结节）染色,以鉴定分化结果。结果体外分离培养的细胞增殖活跃,成骨诱导后碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Von Kossa染色均呈阳性表达。结论脂肪干细胞具有成骨分化能力,是一种理想的骨组织工程种子细胞。     

骨形态发生蛋白-2对人脐带间充质干细胞增殖和分化的影响

目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)增殖和分化的影响.方法 体外培养hUCMSCs,在培养基中加入20 mg/L BMP-2,噻唑蓝(MTT)比色法观察BMP-2对hUCMSCs的增殖效果,流式细胞术检测BMP-2作用后细胞表面STRO-1的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测量BMP-2作用后hUCMSCs骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原蛋白(COL1)的mRNA表达变化,碱性磷酸酶染色观察hUCMSCs在BMP-2培养基作用下ALP染色变化,Von kossa染色实验观察BMP-2对hUCMSCs钙结节的形成.结果 细胞在未加BMP-2和加BMP-2培养基中培养1、3、5、7 d,虽然细胞的增殖率上升,但各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05),同时发现在2%血清的培养基中培养7 d后,hUCMSCs的增殖促进约10%左右.BMP-2培养7 d后细胞表面STRO-1阳性细胞比例上升明显,由25.1±4.0上升至51.1±6.4,差异有统计学意义(P＜0.01).BMP-2培养条件下COL1 mRNA的表达增强,差异有统计学意义(P＜0.05),OPN mRNA出现表达,ALP mRNA比无BMP-2培养明显增强,差异有统计学意义(P＜0.05).在BMP-2培养条件下ALP染色出现大片细胞阳性染色.在培养28 d,Von kossa染色出现明显的钙结节.结论 BMP-2对hUCMSCs成骨诱导分化作用明显,而增殖作用很弱.     

脂肪组织来源干细胞的成骨诱导和外源性基因转染表达研究

目的：探讨脂肪组织来源的干细胞（ADSCs）表达外源性基因的可能性。方法：取小香猪腹部皮下脂肪组织，通过Ⅰ型胶原酶消化、离心等方法分离培养ADSCs，再经原代培养和传代培养。利用成骨诱导剂（10^-7mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/L左旋抗坏血酸）诱导ADSCs向成骨方向分化，观察其生长形态，并通过Gomori改良钙钴法和von Kossa染色对其成骨表型进行鉴定。另设一对照组，培养基中不加入成骨诱导剂。脂质体介导人内皮细胞生长因子（hVEGF）和骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）转染ADSCs细胞，观察转染后细胞形态和生长情况，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学方法分别检测hVEGF mRNA、BMP-2 mRNA及其蛋白质表达。结果：成骨诱导剂能显著诱导体外培养的ADSCs向成骨细胞分化，诱导19d的ADSCs体积增大，细胞由梭形变为多边形，Gomori改良钙钴法染色显示其胞浆内富含碱性磷酸酶颗粒，诱导15d和19d，碱性磷酸酶阳性细胞分别为（25.0±7.5）%和（49.7±6.9）%。von Kossa染色表明聚集的细胞团中央有钙化结节形成。RT-PCR检测证实，经质粒转染的ADSCs中hVEGF和hBMP-2基因表达明显增强，对照组呈弱表达。免疫组织化学检测证实转染ADSCs内有棕色的阳性颗粒出现，未转染细胞则呈现阴性。结论：ADSCs能被成功诱导为成骨细胞，hVEGF和hBMP-2基因能成功地转入ADSCs并表达，这为促进骨组织工程的血管化和成骨活性奠定了基础。     

Choukroun’SPRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化的影响

目的：观察自体富血小板纤维蛋白Choukroun＇s PRF（Choukroun＇s platelct-rich fibrin）对体外培养人脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）增殖及成骨分化能力的影响。方法：取吸脂术者自愿捐献的脂肪组织分离培养ADSCs,采用Choukroun法制备自体PRF备用,观察细胞生长情况。取第3代ADSCs分别向骨细胞、脂肪细胞、神经球细胞定向诱导分化鉴定,并行细胞表面抗原CD29、CD45、CD90流式检测鉴定。将第3代ADSCs分别采用含PRF的普通培养基（PRF组Ⅰ）和不含PRF的普通培养基（对照组Ⅰ）进行培养,观察细胞生长情况,培养1天、3天、5天、7天后采用CCK-8试剂检测细胞增殖活性。另外分别采用含PRF的成骨诱导培养基（PRF组Ⅱ）、不含PRF的成骨诱导培养基（对照组Ⅱ）及不合PRF的普通培养基（空白组）进行培养,第7天、14天、21天、28天行碱性磷酸酶活性（ALP活性）检测;诱导细胞培养后第7天、14天天各组分别行von Kossa染色观察钙结节形成情况。结果：第3代ADSCs倒置显微镜下观察大多呈梭形,向骨细胞、脂肪细胞、神经干细胞定向诱导鉴定均为阳性,流式检测鉴定CD29、CD90为阳性,CD45为阴性。CCK-8法示PRF组Ⅰ的0D值均大于对照组Ⅰ,两组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。ALP活性检测示PRF组Ⅱ第7天、14天、21天、28天细胞活性较对照组Ⅱ均大,两组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。PRF组Ⅱ成骨诱导7天后vonKossa染色阳性;14天后阳性细胞增多,对照组Ⅱ诱导7天未见钙结节,14天见少量阳性钙结节,空白组培养14天未见黑色钙结节。结论：Choukroun’sPRF明显促进脂肪干细胞增殖及成骨分化,为骨组织工程提供了新的技术。PRF与干细胞共同培养可能还有许多潜在的临床及生物工程应用价值,值得进一步研究。     

Wnt3a联合骨形态发生蛋白2对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的 观察经典Wnt/β-catenin以及骨形态发生蛋白(BMP)信号通路对大鼠骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)体外增殖以及向成骨方向分化的影响.方法 应用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞并分4组:对照组、Wnt组、BMP组、Wnt3a和BMP-2联合组,在不同时间点用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞增殖活性,碱性磷酸酶(ALP)活性定量测定、Yon Kossa染色观察细胞向成骨分化和基质矿化程度.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨特异性标志物表达.结果 培养第7天,CCK-8测吸光度值联合组为0.845,Wnt组为0.738,明显高于对照组0.409(P＜0.05).培养第6天和第12天,ALP活性吸光度值联合组为63.8和144.3,BMP-2组为40.8和104.1,均明显高于对照组7.3和18.9(P ＜0.05).培养14 d后,联合组骨钙素mRNA表达量高于对照组,而Runx2及Osterix表达量与其他组比较增高不显著.培养3周后,Yon Kossa染色显示联合组钙结节数量及大小均高于对照组.结论 Wnt3a因子和骨形态发生蛋白-2联合诱导能有效地促进骨髓间充质干细胞增殖及向成骨方向分化.     

不同微环境对人骨髓间充质干细胞体外增殖和分化的影响

目的评价不同微环境对人骨髓间充质干细胞（hBMSC）体外增殖和分化的影响。方法采用全骨髓贴壁分离法培养hBMSC,传至第3代后分别在4种微环境下培养：10％FBS组、10％CS组、1g／L植物源重组人血清白蛋白（OsrHSA）组、单纯DMEM组。采用CCK-8比色法测定细胞一周增殖率。以不加成骨诱导液为对照组,实验组添加成骨诱导液后第1周和第2周行碱性磷酸酶染色,第3周和第4周行茜素红染色,评估不同时段各组细胞成骨分化程度。结果采用单纯DMEM组培养hBMsC,细胞增殖率基本不变,后期下降;10％FBS组、10％CS组和1g／LOsrHSA组均能显著提高hBMSC增殖率（P〈O．05）,以10％FBS组效果最好。碱性磷酸酶染色和茜素红染色显示,单纯DMEM组和对照组均未发现钙沉积阳性细胞;10％FBS组、10VooCS组和1g／LOsrHSA组在各阶段均出现阳性染色,随着诱导时间延长颜色明显加深;10％CS组和1g／LOsrHSA组各时间段阳性染色程度明显较10％FBS组弱,10％CS组其次,1g／LOsrHSA组最差。结论细胞外基质微环境对hBMsC生长分化至关重要,含血清的微环境能更好地促进hBMSC增殖及维持hBMSC分化特性。     

人骨膜细胞体外成骨分化的基因表达和功能检测

目的 探讨并鉴定骨膜细胞经骨形成蛋白7(BMP7)诱导分化为成骨细胞的基因表达和细胞功能.方法 成人胫骨骨膜常规体外细胞培养法,分实验组和对照组,分别加入BMP7加成骨辅助剂和单纯成骨辅助剂进行体外培养.CCK-8法检测细胞增殖活性,第5、10、15和20天分别采用Real Time-PCR检测骨钙素基因表达,ELISA法检测上清液碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的水平,甲苯胺蓝染色检测糖胺聚糖(GAG),Real Time-PCR检测Ⅱ型胶原基因,比色法检测细胞ALP活性,ALP染色法检测ALP,Yon Kossa染色法检测钙结节.结果 两组骨钙素基因表达及上清液ALP、骨钙素、骨桥蛋白的含量均增高,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).两组细胞的ALP和钙结节染色阳性率增高,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).甲苯胺蓝染色阳性率及Ⅱ型胶原基因表达表现为先高后低,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 骨膜细胞在BMP7诱导下体外大量增殖和分化成骨,表达出明显的成骨特异基因,并具有合成分泌成骨特异蛋白的功能;成骨化过程中,除直接分化成骨外,还存在部分细胞先经软骨形成再钙化成骨的现象;经骨膜细胞-BMP7途径在体外获取大量成骨细胞可用于组织工程的体外构骨及临床应用.     

成骨因子BMP7在骨膜细胞体外培养中的作用

目的 探讨成骨因子骨形态发生蛋白(BMP7)在骨膜细胞体外培养中的诱导分化作用.方法取材于成人胫骨骨膜,常规细胞培养法行骨膜细胞体外培养,分为实验组和对照组,分别加入BMP7加成骨细胞培养辅助剂和单纯成骨细胞培养辅助剂,相差显微镜观察骨膜细胞形态特征.每组分别在第5、10、15、20天设3个样本,采用ALP试剂盒法及钙结节Von Kossa染色法分别检测成骨细胞特异性标志物ALP和钙结节的表达情况.结果 骨膜细胞在体外生长良好,实验组和对照组形成的成骨细胞增殖良好,形态一致.细胞早期呈梭形,饱满透明,立体感强;分裂期呈立方形或短柱状;后期由长梭形逐渐变成宽梭和不规则形.由BMP7诱导的骨膜细胞的成骨标志物ALP和钙结节染色阳性率明显高于对照组,有统计学意义(P＜0.01).结论 骨膜细胞具有良好的成骨和再生能力,BMP7在体外培养中具有明显增强骨膜细胞分化为成骨细胞的作用.